Thực hành sinh hóa bài 1 protein 1 định tính  amino acid bằng phản ứng ninhydrin

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC THỰC HÀNH SINH HĨA  Nhóm 1: Thành viên: MSSV: Vương Vĩnh Hưng 2008170048 Trần Phước Huy 2008170051 Võ Thảo Hạnh 2008170036 Huỳnh Ngọc Khiêm 2008170057 BÀI 1: PROTEIN Định tính -amino acid phản ứng ninhydrin Chuẩn bị: Dụng cụ Cốc 100ml Ống nghiệm Phễu Giấy lọc Bông thấm Đèn cồn Kẹp gắp ống nghiệm Bóp cao su Số lượng 1 1 1 Hóa chất Lịng trắng trứng gà Nước cất C2H5O2N Ancohol 96% C9H6O4 Số lượng ~ 40 mL lit 0,02 g 10 mL 0,1 g Tiến hành:  Chuẩn bị nguyên liệu, hóa chất: - Dung dịch protein trứng: Lấy lòng trắng trứng gà (~ 40mL) pha loãng 20 lần nước cất Lọc bơng thấm, sau lọc lại giấy lọc, bảo quản 240C Pha trước làm thí nghiệm - Dung dịch glycine 0,02%: Cân 0,02g C2H5O2N, định mức nước cất đến đủ 100mL dung dịch - Dung dịch thuốc thử ninhydrin 0,1%: Lấy 10mL Ancohol 96% để hòa tan 0,1g C9H6O4, định mức nước cất đến đủ 100mL dung dịch Bảo quản lo thủy tinh màu nâu, tránh sáng  Tiến hành thí nghiệm: - Lấy ống nghiệm, đánh số 2, cho vào: + Ống 1: 1mL dung dịch glycine 0,02% + Ống 2: 1mL dung dịch protein trứng - Thêm vào ống giọt dung dịch thuốc thử ninhydrin 0,1% - Đun nóng ống nghiệm lửa đèn cồn (~ 30 giây) đặt nôi cách thủy 700C phút Kết quan sát: - Ống 1: Không xuất màu - Ống 2: xuất màu xanh tím  Giải thích tượng: Sự xuất màu xanh tím phản ứng ninhydrin amino acid Ninhydrin bị khử +NH3 +CO2 +RCHO Ninhydrin +NH3 +Ninhydrin bị khử Phức chất màu xanh tím Định tính protein phản ứng biuret Chuẩn bị: Dụng cụ Cốc 100ml Ống nghiệm Thìa nhựa Chai nhựa trắng Đèn cồn Kẹp gắp ống nghiệm Bóp cao su Số lượng 2 1 1 Hóa chất NaOHrắn CuSO4.5H2O Tinh thể urea dd protein trứng Nước cất Số lượng 10g 1,6g 0,1g mL 500mL Tiến hành:  Chuẩn bị nguyên liệu, hóa chất: - dd sodiun hydroxide 10%: cân 10g NaOH, định mức nước cất đến đủ 100mL, bảo quản lọ nhựa màu trắng - dd copper sunfate 1%: Cân 1,6g CuSO4.5H2O, định mức nước cất đến đủ 100mL  Tiến hành thí nghiệm: - Lấy ống nghiệm, đánh số 2, cho vào: + Ống 1: 0,1g tinh thể urea + Ống 2: 1mL dd protein trứng - Đun nóng ống lửa đèn cồn, lúc đầu urea nóng chảy, sau bắt đầu cứng lại biuret, để nguội - Thêm vào ống 1ml đ NaOH 10% giọt dd CuSO4 1% Lắc Chú ý: Không nên cho nhiều dd CuSO4 màu xanh cảu dd Cu(OH)2 lấn át màu phản ứng biuret Phản ứng coi dương tính có màu tím rõ Kết quan sát: - Ống 1: có xuất màu tím hồng - Ống 2: có xuất màu tím  Giải thích tượng: Do mơi trường kiềm, liên kết peptide phản ứng với sulfate đồng (CuSO4) tạo phức chất màu tím Màu phản ứng phụ thuộc vào lượng đồng (Cu) số lượng liên kết peptide phân tử chất tham gia phản ứng Ống 1: Biuret tạo thành từ urea điều kiện nhiệt độ cao Khi môi trường kiềm chứa Cu2+  hình thành màu tím hồng dd biuret Ống 2: dd protein trứng chuyển thành dd có màu xanh tím mơi trường kiềm có chứa Cu2+ 3 Tìm điểm đẳng điện protein phương pháp tạo pH khác Chuẩn bị: Dụng cụ Cốc 1L Ống nghiệm Pipet 1mL Lọ thủy tinh màu nâu Bóp cao su Số lượng 3 1 Hóa chất Na2HPO4.12H2O C6H8O7.H2O dd protein trứng Nước cất Cồn 960 Số lượng 71,6g 21g mL 3L Tiến hành:  Chuẩn bị nguyên liệu, hóa chất: - dd sodiun phosphate dibasic 0,2M: cân 71,6g Na2HPO4.12H2O, định mức nước cất đến đủ 1L - dd acid citric 0,1M: Cân 21g CuSO4.5H2O, định mức nước cất đến đủ 1L Bảo quản lọ thủy tinh màu nâu  Tiến hành thí nghiệm: - Lấy ống nghiệm, đánh số 1, 3, cho vào: + Ống 1: 0,3mL dd Na2HPO4.12H2O 0,2M + 0,7mL dd C6H8O7.H2O 0,1M (pH=3,7) + Ống 2: 0,5mL dd Na2HPO4.12H2O 0,2M + 0,5mL dd C6H8O7.H2O 0,1M (pH=4,7) + Ống 3: 0,7mL dd Na2HPO4.12H2O 0,2M + 0,3mL dd C6H8O7.H2O 0,1M (pH=5,7) - Lắc ống nghiệm để dung dịch đệm đảm bảo độ pH tương ứng - Thêm vào ống nghiệm 1mL dd protein trứng, lắc nhẹ - Thêm vào ống nghiệm 1mL cồn 960, lắc đều, để yên phút Kết quan sát: - Cả ống thu có kết tủa trắng - Thời gian kết tủa ống có khác Phản ứng kết tủa ống diễn nhanh ống lại Giải thích: - Phản ứng kết tủa protein điểm đẳng điện diễn nhanh chóng -Mà ta có pHi Albumine trứng 4,6 pH môi trường 4,7  Vì ống mơi trường lý tưởng tạo điều kiện cho albumine trứng kết tủa nhanh Nguyên tắc: Các amino acid protein chất điện ly lưỡng tính, tùy thuộc vào pH dung dịch, mức độ phân ly nhóm carboxle amine tự 4 Kết tủa protein muối trung tính (NH4)2SO4 cách đun sơi môi trường khác Chuẩn bị: Dụng cụ Cốc 100ml Ống nghiệm Thìa nhựa Pipet 1mL Pipet 5mL Đèn cồn Kẹp gắp ống nghiệm Bóp cao su Số lượng 2 1 1 Hóa chất (NH4)2SO4 CH3COOH 98% dd protein trứng nguyên chất Nước cất Số lượng 78g 9,7 mL mL 500mL Tiến hành:  Chuẩn bị nguyên liệu, hóa chất: - dd ammonium sunlfate bão hòa: cân 78g (NH4)2SO4, hòa tan với 100mL nước cất - dd acid acetic 10%: hút 9,7mL CH3COOH 98% định mức 100mL nước cất - dd acid acetic 1%: pha loãng 10 lần dung dịch acid acetic 10% nước cất - dd muối ăn bão hòa: cân 36,3g NaCl, hòa tan với 100mL nước cất  Tiến hành thí nghiệm: - Kết tủa thuận nghịch protein: Lấy ống nghiệm đánh số 2, cho vào ống mL dd lòng trắng trắng nguyên chất + Ống 1: mL dd (NH4)2SO4 bão hòa, lắc nhẹ, xuất thể vẩn trắng globuline + Ống 2: thêm từ từ tinh thể (NH4)2SO4 lắc dung dịch trở thành bão hòa (NH4)2SO4 Kết quan sát: - Các ống nghiệm thu có xuất tủa keo trắng Giải thích: Protein chất keo ưa nước, độ bền dung dịch keo protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố như: tích điện phân tử protein, mức độ hydrate hóa, nhiệt độ,… - Với phản ứng kết tủa thuận nghịch protein: tác dụng chất (muối trung tính kim loại kiềm, kiềm thổ, muối ăn (NaCl), ammoniun sulfate (NH4)2SO4, magnesium sulfate (MgSO4),…); dung môi hữu (cồn, ether, acetone,…) điều kiện nhiệt độ thấp có tác dụng gây kết tủa protein - Kết tủa không thuận nghịch: Lấy ống nghiệm, đánh số từ đến 5, cho vào ống 1mL dd protein trứng Sau tiến hành: + Ống 1: đun nóng + Ống 2: thêm giọt CH3COOH 1%, đun nóng + Ống 3: thêm giọt CH3COOH 10%, đun nóng + Ống 4: thêm giọt CH3COOH 10% giọt NaCl bão hịa, đun nóng + Ống 5: thêm giọt NaOH 10%, đun nóng Kết quan sát: tủa, ống có dd màu vàng sánh Thu ống có kết tủa trắng, ống khơng kết Giải thích Ống 1: Các phân tử protein bị đông tụ tạo tủa Vì hầu hết protein khơng ổn định tác dụng nhiệt, nhiệt độ cao (50550C) liên kết hydro, liên kết kị nước bị đứt, tạo tủa trắng đục Ống 2: Các phân tử protein bị đơng tụ tạo tủa Vì acid CH3COOH 1% tạo nên môi trường acid yếu, làm protein trứng bị kết tủa màu trắng đục Ống 3: dd có màu trắng trong, khơng tạo tủa Vì acid CH3COOH 10% tạo nên môi trường acid mạnh protein trứng, làm cho protein trở nên tích chủ yếu điện dương, nên không tạo kết tủa Ống 4: Các phân tử protein bị đơng tụ tạo tủa Vì mơi trường acid mạnh CH3COOH 10% có bổ sung đầy đủ muối trung tính, đem đun nóng, làm protein kết tủa trắng đục Ống 5: Khơng có kết tủa cho giọt NaOH 10%, đun nóng khơng tạo tủa dd chuyển sang màu vàng sánh Vì NaOH 10% tạo môi trường kiềm, đun sôi điện âm phân tử cịn  Protein tích điện âm, khơng tạo tủa 5 Định lượng protein niệu (Kỹ thuật Mestrezat) Chuẩn bị: Dụng cụ Cốc 100ml Ống nghiệm Bóp cao su Pipet 5mL Số lượng 11 Hóa chất Protein mẫu Nước tiểu Lượng protein g/L Nước cất Số lượng 28mL 5mL g/L 50mL Tiến hành: Lấy 11 ống nghiệm đánh số từ đến 10 ống mẫu, cho theo thứ tự lượng thuốc thử sau: Ống nghiệm Protein mẫu Nước cất Nước tiểu TCA 1/3 Lượng protein g/L 0,5 4,5 1,0 4,0 1,5 3,5 2,0 3,0 2,5 2,5 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 3,0 3,5 2,0 1,5 0,3 0,6 0,7 4,0 1,0 4,5 0,5 10 5,0 Mẫu 0 5,0 0,8 0,9 1,0 ? Lắc để yên 15 phút Sau lắc kỹ so sánh ống mẫu với dãy ống nghiệm từ đến 10 Để ống mẫu ống có độ đục gần giống ống mẫu Để ống lên hàng chữ sách quay ánh sáng, so sánh độ mờ chữ qua ống