Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LA VĂN BẢO THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CON ĐƢỜNG SINH TỔNG HỢP PROVITAMIN A TRONG E coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chính quy[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LA VĂN BẢO THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CON ĐƢỜNG SINH TỔNG HỢP PROVITAMIN A TRONG E coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 – 2015 THÁI NGUYÊN - 2015 n ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LA VĂN BẢO THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CON ĐƢỜNG SINH TỔNG HỢP PROVITAMIN A TRONG E coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K43 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 – 2015 Giảng viên : ThS Lƣơng Thị Thu Hƣờng Khoa CNSH-CNTP –Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên THÁI NGUYÊN - 2015 n i LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập nghiên cứu để hồn thành khóa luận tốt nghiệp với cố gắng cá nhân, nhận hướng dẫn, giúp đỡ, bảo động viên thầy cô bạn bè gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn: Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới cô giáo: Ths Lương Thị Thu Hường, Thầy giáo TS Dương Văn Cường, KS Ma Thị Trang người trực tiếp giúp đỡ hướng dẫn suốt thời gian thực đề tài trình hồn chỉnh luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học Công Nghệ Thực Phẩm dạy dỗ giúp đỡ suốt thời gian vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, anh chị làm việc Viện Khoa Học Sự Sống – Đại Học Thái Nguyên giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm chân thành tới gia đình, người, thân bạn bè động viên, chia sẻ giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn q trình học tâp, nghiên cứu hoàn thành luận văn Xin chân trọng cảm ơn! Thái nguyên, tháng năm 2015 Sinh viên La Văn Bảo n ii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1: Danh mục thiết bị 19 Bảng 3.2: Thành phần phản ứng cắt với EcoRI HindIII 24 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng cắt với EcoRI XbaI 24 Bảng 3.4: Thành phần phản ứng gắn nối 26 n iii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1: Cơng thức cấu tạo provitamin A Hình 2.2: Sơ đồ chuyển hóa provitamin A thành vitaminA Hình 2.3: Tổng hợp carotenoid phương pháp ngưng tụ Wittig 10 Hình 2.4: Tổng hợp carotenoid bất đối 10 Hình 2.5 Hình thái E coli 13 Hình 3.1 Cấu trúc vector pLUG-crtY 15 Hình 3.2: Cấu trúc vector pR-iEIB 16 Hình 3.3 Cấu tạo vector pET28 16 Hình 3.4 Sơ đồ thiết kế vector biểu đường sinh tổng hợp rovitamin A tảng vevtor pET28 21 Hình 3.5 Cơ chế tượng biến nạp 27 Hình 4.1: Kết cắt plasmid pLUG-crtY mở vòng vector pET28 với EcoRI HindIII 29 Hình 4.2 Kết sàng lọc dòng mang vector pET-Y 30 Hình 4.3 Kết cắt dòng plasmid đồng thời hai Ezyme EcoRI HindIII 31 Hình 4.4: Kết kiểm tra chiều gắn gene crtY vector pET-Y 32 Hình 4.5: Hình minh họa cở sở kiểm tra chiều gắn gene crtY pET-Y 33 Hình 4.6: Kết điện di kiểm tra dòng plasmid pET-iEIBY 34 Hình 4.7: Kết điện di kiểm cắt dong plasmid pET-iEIBY XbaI EcoRI 35 Hình 4.8: Kết điện di kiểm tra chiều gắn cụm gene iEIB pET-iEIBY 36 Hình 4.9: Cụm iEIB gắn xuôi chiều 37 Hình 4.10: Biểu pET- iEIBY E coli BL21 38 n iv DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT Bp : Base pair – Cặp bazơ nitơ DNA : Deoxyribonucleic Acid E coli : Escherichia coli EDTA : Etilendiamin tetraaxetic acid IPTG : Isopropyl Thiogalactoside Kb : Kilo base – Kilo bazơ nitơ LB : Laria Broth TAE : Tris-acetate-EDTA X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactoside cs : cộng n v MỤC LỤC Trang PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 Cơ sở khoa học đề tài 2.1.1 Provitamin A vai trò provitamin A thực tiễn 2.1.2 Các đường tổng hợp provitamin A 2.2 Tổng quan nghiên cứu nước 14 2.2.1 Tình hình nghiên cứu provitamin A nước 14 2.2.2 Tình hình nghiên cứu provitamin A giới 14 PHẦN ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 15 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 15 3.1.3 Hóa chất 17 3.1.4 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 19 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 20 3.3 Nội dung 20 3.3.1 Nội dung 20 3.3.2 Nội dung 20 3.3.3 Phương pháp nghiên cứu 20 n vi PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 kết thiết kế vector biểu mang polycistronic operon chứa gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY tảng vector pET28 28 4.1.1 Kết gắn crtY vào vector pET28 tạo vector tái tổ hợp pET-Y 28 4.1.2 Kết gắn cụm gene iEIB (idi, crtE, crtI, crtB) vào vector pET-Y tạo vector tái tổ hợp pET-iEIBY 34 4.2 Kết đánh giá biểu pET- iEIBY E coli BL21 38 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO n PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Provitamin A (ß-caroten) hợp chất thuộc nhóm carotenoid tiền chất để tổng hợp vitamin A- nhóm sắc tố tự nhiên tổng hợp nhiều nhiều loại thực vật, vi khuẩn, tảo nấm (Das cs, 2007)[7] Trong thực vật, provitamin A tham gia vào trình quang hợp, che chắn ánh sáng, hình thành màu sắc thực vật màu vàng, da cam, đỏ tham gia vào tham gia vào trình hình thành số hormone (Vilchez cs, 2011)[8] Ngồi provitamin A cịn tham gia hình thành màu sắc cho vi sinh vật, chim, côn trùng, cá động vật giáp xác (Takahashi cs, 1998)[9] Ngày người ta tìm thấy 600 chất họ carotenoid, có 20 loại tìm thấy máu người đơng vật, tiêu biểu α-caroten, ßcaroten, lycopene, lutein crytoxamthin (Rao and Rao, 2007)[10] Ngồi provitamin A cịn có nhiều tác dụng quan trọng thể người Provitamin A tiền chất vitamin A (Hà Thị Bích Ngọc, 2006)[4], loại vitamin liên quan đến thị lực Ngồi provitamin A cịn có tác dụng chống oxy hóa, tăng cường hệ miễn dịch, ức chế phát triển tế bào ung thư, bệnh tim mạch (Paiva and Russell, 1999)[11] Mặc dù provitamin A quan trọng thể người tự tổng hợp loại vitamin mà chủ yếu thông qua đường hấp thụ từ nguồn thức ăn cung cấp từ bên Hiện nay, nhu cầu sử dụng provitamin A ngày gia tăng Nó bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, sản xuất dược phẩm mỹ phẩm (Lee cs, 2003)[12] Ngày nay, có số phương pháp để sản xuất provitamin A, chủ yếu sản xuất phương pháp tổng hợp hóa học, lên men tách chiết từ nguồn có sẵn tự nhiên với quy mô số lượng nhỏ n (Johnson cs, 1996)[13], nhược điểm phương pháp phương pháp sản phẩm thu với số lượng ít, khơng thân thiện với mơi trường phải có nguồn nguyên liệu với số lượng lớn Vì vậy, Cần có phương pháp sản xuất ưu việt yêu cầu đặt Cùng với phát triển khoa học công nghệ, nhà khoa học đạt nhiều thành tựu việc sản xuất provitamin A phương pháp sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để tổng hợp provitamin A từ vi sinh vật Quá trình sinh tổng hợp provitamin A gồm có hai đường đường Mevalonate với tiền chất glucose, pyruvate đường Nonmevalonate với tiền chất Acetyl- CoA Cả hai đường dẫn đến hình thành chất isopentenyl diphosphate (IPP) (Slattery cs, 2000)[14] dimethylallyl diphosphate (DMAPP) đồng phân IPP Hai chất hai tiền chất cấu tạo nên tất hợp chất isoprenoid ( Das cs 2007)[7] Sau diễn phản ứng ngưng tụ liên tiếp IPP tạo sản phẩm C30 C40 carotenoid Hiện nay, việc sản xuất hợp chất provitamin A Việt Nam vấn đề mới, nghiên cứu dừng lại việc tách chiết từ thực vật phân lập chủng vi sinh vật sản xuất provitamin A quy mô nhỏ Việc sử dụng hợp chất provitamin A Việt Nam chủ yếu nhập từ nước với giá thành cao Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, thực đề tài: ‘‘Thiết kế vector biểu đƣờng sinh tổng hợp provitamin A E coli” nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho nghiên cứu tạo chủng vi sinh vật có khả sản xuất provitamin A tái tổ hợp 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Thiết kế vector biểu mang polycistronic operon gồm gene idi, crtE, crtI, crtB crtY mã hóa enzyme xúc tác phản ứng chuyển hóa đường sinh tổng hợp provitamin A tảng vector pET 28 n