Luận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate

Luận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosateLuận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosateLuận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosateLuận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosateLuận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosateLuận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosateLuận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosateLuận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosateLuận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosateLuận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosateLuận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosateLuận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosateLuận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosateLuận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosateLuận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosateLuận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosateLuận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosateLuận văn thạc sĩ: Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN THÀNH LUÂN THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN KHÁNG CHẤT DIỆT CỎ GLYPHOSATE Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60.42.014 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS LÊ VĂN SƠN Thái Nguyên - 2014 i LỜI CAM ĐOAN Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Nguyễn Thành Luân XÁC NHẬN CỦA TRƢỞNG KHOA CHUYÊN MÔN XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS Lê Văn Sơn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Văn Sơn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành KS Hồ Mạnh Tường, cán nghiên cứu , Phịng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi, tận tình bảo, giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu thực thí nghiệm đề tài & Sinh học đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Ngun giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi bày tỏ lời cảm ơn đến đồng nghiệp, bạn bè toàn thể gia đình giúp đỡ, động viên tơi suốt thời gian học tập Thái Nguyên, ngày 16 tháng 04 năm 2014 Tác giả Nguyễn Thành Luân Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục .iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Chất diệt cỏ ứng dụng sản xuất nông nghiệp 2.1.1 Cỏ dại cách phòng trừ 2.1.2 Các loại thuốc diệt cỏ sử dụng 2.2 Chất diệt cỏ glyphosate 2.2.1 Cấu tạo chế hoạt động glyphosate 2.2.2 Tình hình sử dụng thuốc diệt cỏ glyphosate 10 2.3 EPSPS ứng dụng tạo trồng kháng glyphosate 13 2.3.1 Cây trồng chuyển gen kháng chất diệt cỏ 13 2.3.2 EPSPS 18 2.3.3 Ứng dụng EPSPS tạo chuyển gen 19 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Vật liệu 22 3.1.1 Thực vật 22 3.1.2 Chủng vi khuẩn 22 3.1.3 Các vector 22 3.1.4 Hóa chất 22 3.1.5 Máy móc thiết bị 23 3.2 Phương pháp nghiên cứu 23 3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc SP-EPSPS-Cmyc 23 tumefaciens CV58 29 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv yển gen 30 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1.1 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc SP-EPSPS-Cmyc 34 4.1.2 Kết chuyển cấu trúc pBI121/EPSPS vào thuốc 42 4.1.3 Phân tích 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 5.1 Kết luận 49 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT EPSPS 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase bp Cặp bazơ S3P shikimate phosphate-3 ESP enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate cs cộng DEPC Diethy pyrocarbonate dNTP Deoxynucleotide Kb Kilo bazơ LB Luria Bertani PCR Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi polymerase ĐBSCL Đồng sông Cửu Long BAP 6-benzyladenine PVDF Polyvinylidene fluoride WT isopropylthio-β-galactoside RNAi wild type SP signal peptide gus β –Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3-butyric acid MS Môi trường muối theo Murashige Skoog (1962) OD Optical density Ti- plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Phân bố số loại trồng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ 14 2.2 Thống kê trồng chuyển gen chấp nhận Mỹ 20 3.1 Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn 24 3.2 Thành phần phản ứng lai SP-EPSPS-Cmyc vào vector pBI121 25 3.3 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 27 3.4 Thành phần phản ứng PCR với pUC18- F pUC18- R 28 3.5 Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA 31 3.6 Thành phần chạy phản ứng PCR với EPSPS-F CYMC-R 32 4.1 Kết tạo thuốc chuyển gen SP-EPSPS-Cmyc 45 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 Sơ đồ vector pBI121 22 4.1 Trình tự đoạn gen EPSPS theo NCBI 34 4.2 Trình tự đoạn gen mã hóa cho protein EPSPS 35 4.3 Trình tự đoạn SP từ Dã yên thảo 35 4.4 Trình tự cấu trúc SP-EPSPS-Cmyc 36 4.5 Trình tự Protein biểu EPSPS 37 4.6 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid pBluescriptII 37 4.7 Kết cắt vector pBI121 XbaI/SacI 38 4.8 Khuẩn lạc E.coli DH5α mang plasmid 39 4.9 Kết điện di phản ứng cắt vector tái tổ hợp 40 XbaI/SacI PCR 4.10 Kết PCR pBI121/EPSPS A tumefaciens 42 4.11 Mảnh cảm ứng môi trường GM sau ngày 43 4.12 Mảnh sau đồng nuôi cấy ngày môi trường GM 43 4.13 Chồi mọc lên môi trường MS + BAP + kanamycin + 44 cefortaxim 4.14 Các chồi tái sinh chuẩn bị chuyển sang môi trường rễ 44 4.15 Cây hồn chỉnh chuẩn bị trồng ngồi mơi trường 45 4.16 46 4.17 Kết lai Western blot 47 4.18 Kết kiểm tra dòng thuốc mang gen EPSPS kháng 48 glyphosate Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cỏ dại vấn đề lớn với trồng Cỏ dại không cạnh tranh với trồng để lấy nước, chất dinh dưỡng, ánh nắng mặt trời, khoảng không để phát triển mà cịn nơi cư trú cho trùng loại sâu bệnh gây hại, làm giảm sút chất lượng mùa màng, đem theo hạt giống cỏ dại trộn lẫn với hạt giống trồng Theo phương pháp truyền thống cỏ dại thường kiểm soát cách: cầy sới, nhổ cỏ, phun thuốc diệt cỏ, hay kết hợp tất tập quán Nhưng phương pháp áp dụng diện tích nhỏ Biện pháp diệt cỏ hiệu cho diện tích canh tác lớn đưa phun thuốc diệt cỏ lần diện tích lớn Thuốc diệt cỏ tác động vào số enzym chủ yếu trình trao đổi chất cây, làm rối loạn trình tổng hợp hữu cuối tiêu diệt cỏ dại Loại thuốc diệt cỏ hay sử dụng phổ biến Việt Nam glyphosate glufosinate Hai loại thuốc diệt cỏ hữu ích việc kiểm sốt cỏ dại ảnh hưởng trực tiếp lên vật nuôi không tổn hại lâu môi trường Chúng có hiệu cao an tồn số hố chất dùng nơng nghiệp Tuy nhiên, hoạt tính tác động lên cỏ dại tác động giống hệt lên trồng, kết tiêu diệt cỏ dại trồng EPSPS enzyme chìa khóa đường sinh tổng hợp amino acid ng thơm dạng: EPSPS I tồn thực vật vi khuẩn, dạng bị ức chế glyphosate Dạng EPSPS II có số vi khuẩn Pseudomonas sp strain PG2982, Agrobacterium tumefaciens sp strain CP4 Staphylococcus aureus… Trong EPSPSII từ Agrobacterium tumefaciens sp strain CP4 có tính kháng glyphosate mức độ cao nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng Để giải vấn đề Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ phòng trừ cỏ dại đảm bảo suất chất lượng trồng, việc chọn tạo giống trồng mang mang gen EPSPS từ A.tumefacien sp CP4, có khả chống chịu chất diệt cỏ glyphosate hướng quan tâm Xuất phát từ lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate.” Đề tài thực nghiên cứu phòng Công nghệ tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm khoa học quốc gia Việt Nam 1.2 Mục tiêu đề tài Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate 1.3 Nội dung nghiên cứu 1.3.1 Thiết kế vector chuyển gen - Xác định sửa đổi trình tự nucleotid gen EPSPS phù hợp biểu thực vật - Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen mang cấu trúc EPSPS mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate - Chuyển cấu trúc EPSPS vào vi khuẩn A tumefaciens CV58 - Biến nạp cấu trúc EPSPS vào thuốc - Chọn lọc dòng thuốc chuyển gen 1.3.3 Phân tích - Kiểm tra cấu trúc gen chuyển thuốc chuyển gen - Kiểm tra biểu protein tái tổ hợp thuốc chuyển gen - Đánh giá khả kháng glyphosate thuốc chuyển gen Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 41 phần phản ứng không bị nhiễm DNA Giếng 1, xuất băng có kích thước khoảng 1.4 bb Đây kích thước phù hợp với đoạn EPSPS có kèm thêm đoạn vector pBT Như vector tái tổ hợp mang cấu trúc SP-EPSPS-Cmyc thiết kế thành cơng Có thể sử dụng biến nạp vào vi khuẩn A.tumefaciens CV58 để tiến hành bước 4.1.1.5 Kết tạo dòng vi khuẩn A.tumefaciens mang vector pBI121/EPSPS Vector pBI121/EPSPS sau thiết kế thành công biến nạp vào A.tumefaciens phương pháp xung điện Đây phương pháp biến nạp có hiệu quả, có thời gian thí nghiệm ngắn Sản phẩm q trình biến nạp ni chọn lọc mơi trường LB đặc có chứa kháng sinh thích hợp Các dòng khuẩn lạc A tumefaciens tạo nhờ xung điện chứa Ti-plasmid tái tổ hợp phát phương pháp chọn lọc môi trường chứa kháng sinh chọn lọc Chỉ có khuẩn lạc A tumefaciens biến nạp thành công Plasmid pBI121/EPSPS sống môi trường chọn lọc Để xác định A tumefaciens mang gen quan tâm, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu EPSPSF/CYMC-R Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 42 Hình 4.10 Kết PCR pBI121/EPSPS A tumefaciens M: Maker 1, 2, 3: plasmid A tumefaciens mang pBI121/EPSPS Kết cho thấy dòng khuẩn lạc kiểm tra có dịng khuẩn có vạch DNA với kích thước 1400bp phù hợp với kích thước gen EPSPS nhân lên với cặp mồi EPSPS-F CYMC-R Qua kết luận biến nạp thành công vector mang gen EPSPS vào tế bào A.tumefaciens để phục vụ công tác chuyển gen 4.1.2 Kết chuyển cấu trúc pBI121/EPSPS vào thuốc Sau biến nạp thành công vector pBI121/EPSPS vào vi khuẩn A tumefaciens, tiếp tục tiến hành chuyển gen SP-EPSPS-Cmyc thông qua việc lây nhiễm chủng vi khuẩn A tumefaciens mang cấu trúc gen SP-EPSPS-Cmyc vào tế bào mảnh thuốc Nicotiana tabacum K326 cắt tổn thương cạnh nuôi cấy mơi trường cảm ứng GM trước ngày (Hình 4.11) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 43 Hình 4.11 Mảnh cảm ứng môi trường GM sau ngày Để chuẩn bị cho việc biến nạp song song với việc nuôi lỏng A tumefaciens mang cấu trúc gen SP-EPSPS-Cmyc đồng thời gây tổn thương mảnh trước hai ngày Sau hai ngày khuẩn nuôi phục hồi môi trường LB lỏng khơng có kháng sinh, sau tiến hành đo OD600nm đạt số từ 0,6 đến sử dụng khuẩn để tiến hành biến nạp Sau hai ngày đồng nuôi cấy tối, tiến hành rửa khuẩn cefotaxim, cấy chuyển mảnh sang môi trường GM có bổ sung cefotaxim, kanamycin (Hình 4.12) Hình 4.12 Mảnh sau đồng nuôi cấy ngày môi trường GM Sau - tuần xuất chồi nhỏ (Hình 4.13) Số mảnh sống sót môi trường chọn lọc kháng sinh 117/150 Từ mảnh lá, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 44 tiến hành tách chồi nhỏ cấy lên môi trường MS có bổ sung cefotaxim, kanamycin để nhân nhanh chồi Hình 4.13 Chồi mọc lên mơi trường MS + BAP + kanamycin + cefortaxim Sau - tuần, thu nhiều chồi từ mảnh cảm ứng tạo mơ sẹo (Hình 4.14), chồi phát triển cao khoảng 3cm cắt chuyển sang mơi trường RM có bổ sung cefotaxim, kanamycin (Hình 4.15) Hình 4.14 Các chồi tái sinh chuẩn bị chuyển sang môi trường rễ Qua lần biến nạp, kết thu số rễ chọn lọc sơ thể Bảng 4.1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 45 Bảng 4.1 Kết tạo thuốc chuyển gen SP-EPSPS-Cmyc Biến nạp Tổng mảnh Số mảnh sống sót sau tuần Số mảnh cảm ứng tạo chồi Số rễ môi trƣờng chọn lọc Lần 50 40 40 30 Lần 50 39 37 32 Lần 50 38 31 30 Tổng 150 117 108 92 Bảng 4.1 cho thấy số lượng mảnh sống sót mơi trường chọn lọc giảm dần theo thời gian, điều cho thấy khả mảnh tồn phát triển mô mang tế bào chuyển gen Sau - tuần, có 117/150 mảnh sống sót mơi trường chọn lọc qua lần biến nạp Sau – tuần, 92 thuốc chuyển gen hoàn chỉnh tạo thành Hình 4.15 Cây hồn chỉnh chuẩn bị trồng ngồi mơi trường Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 46 4.1.3 Phân tích 4.1.3.1 Tách DNA tổng số, PCR kiểm tra có mặt gen biểu Các dòng thuốc chuyển gen sau thời gian phát triển 30 ngày điều kiện invitro, tiến hành chọn lọc từ 30 dòng thuốc chuyển gen, lấy 10 dòng đánh số ngẫu nhiên từ E1 – E10, tiến hành tách DNA tổng số sau PCR với cặp mồi đặc hiệu EPSPS-F/CYMC-R với 10 dòng thuốc M - 10 1,5 kb kb 4.16 10/30 - a - 1-E10 Hình 4.16 kết PCR cặp mồi đặc hiệu EPSPS-F/CYMC-R với DNA từ 10 dòng sau chuyển gen chọn ngẫu nhiên E1-E10, chọn dịng có kết dương tính, sản phẩm PCR cho băng DNA có kích thước khoảng 1400bp, tương đương kích thước cấu trúc gen chuyển PCR với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm không xuất đối chứng không chuyển gen Trong tổng số 30 dòng thuốc sau chuyển gen, kiểm tra phản ứng PCR thu 20 dòng mang cấu trúc gen cần chuyển Như khẳng định thu dòng thuốc mang cấu trúc gen SP-EPSPS-Cmyc 4.1.3.2 Kết lai Western blot Để khẳng định vector thiết kế mang gen chuyển có khả biểu protein đích, chúng tơi tiến hành lai Western Trong thí nghiệm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 47 này, dòng thuốc chuyển gen hệ T0 có kết PCR dương tính lựa chọn để tiến hành phân tích Cây T0 lấy mẫu tiến hành kiểm tra khả biểu protein SP-EPSPS-Cmyc lai Western với kháng thể kháng Cmyc Hình 4.17 : Kết lai Western blot MK: Maker WT: không mang gen – 4: dòng thuốc chuyển gen Từ kết lai hình 4.17 cho thấy dịng chuyển gen xuất băng đặc hiệu có kích thước gần 50kDa Băng protein không xuất đối chứng không chuyển gen (WT), theo kết tính tốn lý thuyết băng protein SP-EPSPS-Cmyc có kích thước 48,8 kDa, gần xấp xỉ 50kDa, băng protein thu có kích thước khoảng 50kDa đoạn protein SP-EPSPS-Cmyc khẳng định chúng tơi biểu thành công cấu trúc protein SP-EPSPS-Cmyc mơ hình thuốc K326 4.1.3.3 Kết kiểm tra mức độ kháng thuốc thuốc mang gen thuốc trừ cỏ glyphosat VIFOSATE 240DD (công ty cổ phần thuốc sát trùng Việt Nam) có nồng độ glyphosate khoảng 2,4 g/l Đây thuốc trừ cỏ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 48 nội hấp phổ rộng khơng chọn lọc có tác dụng diệt trừ loài cỏ tranh, cỏ rộng với hiệu diệt trừ cao 12 ngày sau phun Hình 4.18 Kết kiểm tra dịng thuốc mang gen EPSPS kháng glyphosate Các giống thuốc trước phun (A) sau phun 12 ngày (B) WT: wild type giống thuốc mang gen EPSPS: E1, E4, E5, E6 Hình 4.18 cho thấy dịng thuốc có sinh trưởng phát triển khác sau 12 ngày xử lý thuốc Cây đối chứng WT khơng có khă kháng thuốc diệt cỏ nên bị chết, rủ xuống chuyển dần sang màu vàng giống với biểu giống E5 E6 Trong tổng số 20 dòng thuốc chuyển gen thu được, dịng E1, E12, E16 có khả kháng glyphosate mạnh nhất, xanh tốt, sinh trưởng phát triển bình thường Các dịng E4, E7, E11, E18 có khả kháng thuốc trừ cỏ dòng E1 (một số bị rủ vàng) sinh trưởng phát triển bình thường Các dịng chuyển gen cịn lại dương tính PCR khả kháng thuốc diệt trừ cỏ giống với hai dòng E5 E6, giống WT Khả kháng vị trí gen chuyển genome dẫn đến mức độ biểu gen khác Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Gen mã hóa EPSPS tối ưu biểu thực vật thiết kế thành công vào vector pBI121 Gen EPSPS thiết kế điều khiển promoter 35S tích lũy lục lạp, giúp cho trồng kháng chất diệt cỏ glyphosate Đã chuyển thành công cấu trúc mang gen EPSPS vào giống thuốc N tabacum K326 thông qua vi khuẩn A.tumefaciens CV58 Các dòng thuốc chuyển gen kiểm tra có mặt mức độ biểu gen chuyển PCR Western blot Kết đánh giá khả kháng với chất diệt cỏ glyphosate dòng thuốc chuyển gen cho thấy thu dịng (E1, E12, E16) có khả kháng tốt dịng (E4, E7, E11, E18) có khả kháng mức độ trung bình Kiến nghị Tiếp tục theo dõi phát triển dòng thuốc chuyển gen kháng tốt qua hệ T1, T2 để theo dõi ổn định biểu kháng glyphosate gen biểu Tiếp tục tiến hành chuyển gen vào thực vật khác có ý nghĩa thực tiễn nông nghiệp như: lúa, ngô số loại mầm khác Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam, Bộ sách chuyên khảo, NXB Khoa học Công nghệ Lê Trần Bình (2003), Tài liệu thực hành cơng nghệ tế bào thực vật, Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Cơng nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2003), Tạo Hồng (Paulownia fortune) chuyển gen kháng sâu thông qua agrobacterium Trần Thị Cúc Hịa, Lê Trần Bình, Bùi Bá Bổng (2004), Chuyển nạp gen kháng sâu cryIAb cryIAc vào giống lúa phương pháp agrobacterium chọn lọc Mannose, Nông nghiệp-Nông thôn-Môi trường, 6, tr 21-26 Nguyễn Ánh Hồng (2000), Cơ sở Khoa học Công nghệ chuyển gen thực vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội Lê Đình Lương (2002), Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học sinh học, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội Đỗ Tiến Phát, Đinh Thị Phịng, Chu Hồng Hà (2008), Đánh giá ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn tới hiệu chuyển gene vào (Gossypium hirsutum L) thông qua Agrobacterium tumefaciens, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 6(4A), tr 689-695 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 51 10 Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 11 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 12 Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di tryền chọn giống thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 13 Hà Minh Trung, Vũ Đình Phú, Ngơ Vĩnh Viễn, Mai Thị Liên (2002), Cơng nghệ tuyển chọn nhân giống có múi bệnh, Cục trồng trọt, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn 14 Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình (2008), Tạo thuốc kháng bệnh khảm dưa chuột ký thuật RNAi, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 6(4A), tr 679-687 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 15 Amrhein N, Deus B, Gehrke P, Steinrucken HC (1980), The site of the inhibition of the shikimate pathway by glyphosate II Interference of glyphosate with chorismate formation in vivo and in vitro Plant Physiol 66: 830–834 16 Amrhein N, Johanning D, Schab J, Schulz A (1983), Biochemical basis for glyphosate-tolerance in a bacterium and a plant tissue culture FEBS Lett 157: 191–196 17 Baerson SR, Rodriguez DJ, Tran M, Feng Y, Biest NA, Dill GM (2002), Glyphosate-resistant goosegrass Identification of a mutation in the target enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase Plant Physiol 129: 1265–1275 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 52 18 Barry G, Kishore G, Padgette SR, Taylor ML, Kolacz K, Weldon M, Re DB, Eichholtz DA, Fincher K, Hallas L (1992), Inhibitors of amino acid biosynthesis: strategies for imparting glyphosate tolerance to crop plants In BK Singh, HE Flores, JC Shannon, eds, Biosynthesis and Molecular Regulation of Amino Acids in Plants American Society of Plant Physiologists, 19 Bradshaw L, Padgette SR, Kimball SL, Wells BH (1997), Perspectives on glyphosate resistance 20 Cadwell RC, Joyce GF (1994), Mutagenic PCR PCR Methods Appl 3: S136–S140 21 Coggins JR, Abell C, Evans LB, Frederickson M, Robinson DA, Roszak AW, Lapthorn AP (2003), Experiences with the shikimate-pathway enzymes as targets for rational drug design Biochem Soc Trans 31: 548–552 22 Della-Cioppa G, Bauer SC, Klein BK, Shah DM, Fraley RT, Kishore GM (1986), Translocation of the precursor of 5-enolpyruvylshikimate 3phosphate synthase into chloroplasts of higher plants in vitro Proc Natl Acad Sci USA 83: 6873–6877 23 Fitzgibbon JE, Braymer HD (1990), “Cloning of a gene from Pseudomonas sp strain PG2982 conferring increased glyphosate resistance”, Appl Environ Microbiol 56: 3382–3388 24 Hajdukiewicz P, Svab Z, Maliga P (1994), “The small, versatile pPZP family of agrobacterium binary vectors for plant transformation”, Plant Mol Biol 25: 989–994 25 He M, Yang ZY, Nie YF, Wang J, Xu P (2001), “A new type of class I bacterial 5-enopyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutants with enhanced tolerance to glyphosate”, Biochim Biophys Acta 1568: 1- Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 53 26 Jerry M Green (2009), Evolution of Glyphosate-Resistant Crop Technology, Weed Science 2009 57:108–117 27 Mayer MP (1995), A new set of useful cloning and expression vectors derived from pBlueScript, Gene 163: 41–46 28 Padgette SR, Re DB, Barry G, Eichholtz DA, Delannay X, Fuchs RL, Kishore G, Fraley RT (1996), New weed control opportunities: development of soybeans with a Roundup Ready gene.In SO Duke, ed, Herbicide Resistant Crops: Agricultural, Economic, Environmental, Regulatory, and Technological Aspects CRC Press, Boca Raton, FL, pp 53–84 29 Priestman MA, Funke T, Singh IM, Crupper SS, Schonbrunn E (2005b) 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Staphylococcus aureus is insensitive to glyphosate FEBS Lett 579: 728–732 30 Priestman MA, Healy ML, Becker A, Alberg DG, Bartlett PA, Lushington GH, Schonbrunn E (2005), Interaction of phosphonate analogues of the tetrahedral enolpyruvylshikimate-3-phosphate reaction intermediate synthase in atomic with 5- detail, Biochemistry 44: 3241–3248 31 Sambrook J, Russell DW (2001), Molecular Cloning: A laboratory Manual, 1st ed Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 32 Schonbrunn E, Eschenburg S, Shuttleworth WA, Schloss JV, Amrhein N, Evans JN, Kabsch W (2001) Interaction of the herbicide glyphosate with its target enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase in atomic detail, Proc Natl Acad Sci USA 98: 1376–1380 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 54 33 Shaner and O'Connor (1991), Protection of a wide variety of agricultural commodities 34 Smith EA, Oehme FW (1992), “The biological activity of glyphosate to plants and animals: a literature review”, Vet Hum Toxicol 34: 531–543 35 Stalker DM, Hiatt WR, Comai L (1985), “A single amino acid substitution in the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase confers resistance to the herbicide glyphosate”, J Biol Chem 260: 4724– 4728 36 Stephen Powles (2008), Evolved glyphosate-resistant weeds around the world: lessons to be learnt, Pest Management Science 64:360–365 37 Stephen O Duke and Antonio L Cerdeira (2007), Risks and Benefits of Glyphosate-Resistant Crops, Natural Products Utilization Research Unit Agricultural Research Service, USDA 38 Topping JF, In Foster GD, Taylor SC (1998), “Plant virology protocols, from virus isolation to fransgenic resistance”, Humana Press, Totowa 81: 365-485 39 Xu J, Feng D, Song G, Wei X, Chen L, Wu X, Li X, Zhu Z (2002), “Cloning of genomic DNA of rice 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase gene and chromosomal localization of the gene”, Sci China C Life Sci 46: 561–569 40 Zhao T, Lin C, Shen Z, (2011), Development of Transgenic GlyphosateResistant Rice with G6 Gene Encoding 5-Enolpyruvylshikimate-3Phosphate Synthase, Agricultural Sciences in China 2011, 10(9): 13071312 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 55 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần loại môi trường Môi Thành phần trƣờng LB đặc LB lỏng MS đặc MS lỏng ½ MS g/l Yeast extract + 10 g/l Bacto tryptone + 10 g/l NaCl + 15 g/l bacto agar, pH = g/l Yeast extract + 10 g/l Bacto tryptone + 10 g/l NaCl, pH = 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + 30 g đường + g thạch, pH = 5,8 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + 30 g đường, pH = 5,8 10 ml/L MS I + ml/L MS II + ml/L MS III + ml/L MS IV + ml/L MS V, pH = 5,8 GM MS (I – V) + BAP 1mg/l + sucrose 30g/l + Agar 9g/l, pH = 5,8 RM MS (I – V) + IBA 0,1mg/l + Sucrose 30g/l + Agar 9g/l pH = 5,8 Phụ lục 2: Bài báo công bố Hồ Mạnh Tường, Phạm Thị Lý Thu, Nguyễn Thành Luân, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2013), Thiết kế vector mang gen Cry1AC EPSPS phục vụ tạo chuyển gen kháng côn trùng chất diệt cỏ Glyphosate, Hội nghị Công nghệ sinh học tồn quốc 2013: 1133-1137 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... vector chuyển gen mang cấu trúc gen mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate 1.3 Nội dung nghiên cứu 1.3.1 Thiết kế vector chuyển gen - Xác định sửa đổi trình tự nucleotid gen EPSPS phù hợp... mang gen EPSPS từ A.tumefacien sp CP4, có khả chống chịu chất diệt cỏ glyphosate hướng quan tâm Xuất phát từ lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein kháng. .. nucleotid gen EPSPS phù hợp biểu thực vật - Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen mang cấu trúc EPSPS mã hóa protein kháng chất diệt cỏ glyphosate - Chuyển cấu trúc EPSPS vào vi khuẩn A tumefaciens