Đo và giám sát môi trường báo cáo đề tài sắc ký cột phân ly

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN ĐIỆN ====o0o==== HỌC PHẦN: ĐO VÀ GIÁM SÁT MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO ĐỀ TÀI: SẮC KÝ CỘT PHÂN LY GVHD: Nguyễn Thị Lan Hương Thành viên: Vũ Văn Nghĩa ĐK-TĐH K63 20181678 Khổng Minh Đăng ĐK-TĐH K63 20181378 Nguyễn Xuân Thắng ĐK-TĐH K63 20181757 Nghiêm Thị Phượng ĐK-TĐH K63 20181700 Hà Nội, 7/2022 PHẦN I Giới thiệu Khái niệm Thiết bị PHẦN II Phương pháp đo Nguyên lý hoạt động Quá trình rửa giải cột sắc ký Pha tĩnh cột sắc kí Pha động cột sắc ký 10 Cấu tạo thiết bị 10 5.1 Hệ thống bơm 10 5.2 Bộ phận tiêm mẫu 11 5.3 Cột sắc ký 11 5.4 Detector 11 5.4.1 Đầu dò UV/Vis 12 5.4.1.1 Giới thiệu 12 5.4.1.2 Cấu tạo 12 5.4.1.3 Nguyên lý hoạt động 13 5.4.2 Đầu dò huỳnh quang 14 5.4.2.1 Giới thiệu 14 5.4.2.2 Cấu tạo 15 5.4.2.3 Nguyên lý hoạt động 16 5.4.3 Detecter PAD (Photodiode Array) 16 5.4.3.1 Giới thiệu 16 5.4.3.2 Cấu tạo 16 5.4.3.3 Nguyên lý hoạt động 17 5.5 Sắc ký đồ 18 5.6 Thiết bị thu thập liệu 19 5.7 Bình thải 19 Yêu cầu sắc ký cột phân ly 19 Ưu Nhược Điểm Của Phương Pháp Sắc Ký Cột Phân Ly .20 7.1 Ưu điểm sắc ký lỏng: .20 7.2 Nhược điểm sắc ký lỏng: .20 Ứng dụng .21 PHẦN III Thiết bị thực 22 Giới thiệu chung 22 1.1 Tên thiết bị 22 1.2 Một số thông tin Bio – Rad .22 1.3 BioLogic LP System .22 Một số đặc điểm 22 Bộ thu thập phân đoạn BioFrac 24 Bộ thu thập phân đoạn Model 2110 24 Cột sắc ký 25 Thông số kỹ thuật .26 Thông tin sản phẩm hệ thống LPLC BioRad .27 DANH MỤC HÌNH ẢNH Figure 1: Nguyên lý sắc ký cột Figure 2: Sắc ký cột phân ly Figure 3: Quá trình rửa giải cột sắc ký Figure 4: Bảng liệt kê pha tĩnh phổ biến sử dụng sắc ký cột hấp phụ Figure 5: Bảng liệt kê kích thước mắt lưới tiêu chuẩn ứng dụng thích hợp .10 Figure 6: Sơ đồ cấu tạo UV/VIS đơn bước song 12 Figure 7: Sơ đồ hoạt động UV/VIS đơn bước song 14 Figure 8: Biển diễn quang học máy dò huỳnh quang 15 Figure 9: Nguyên lý hoạt động Fluorescence Detector .16 Figure 10: Giản đồ hệ thống quang học .17 Figure 11: Kết đo hiển thị màng hình PAD 18 Figure 12: Cột x sắc ký đồ biểu thị thời gian lưu 19 Figure 13: BioLogic LP System 22 Figure 14: Phần điều khiển hệ thống .23 Figure 15: BioFrac Fraction Collector 24 Figure 16: Bộ thu thập phân đoạn Model 2110 25 Figure 17: Cột sắc ký Econo-Column 26 Figure 18: Thông số kỹ thuật .27 PHẦN I Giới thiệu Khái niệm Sắc ký cột phân ly phương pháp tách sắc ký chất dựa phân bố khác chúng hai pha khơng trộn lẫn, pha động chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa cột Sắc ký cột phân ly tiến hành chủ yếu dựa chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước tương tác hóa học lập thể Thiết bị Sắc ky cột phân ly kỹ thuật sắc ký pha động chất lỏng Có nhiều cách sắc ky cột phân ly thực hiện, hầu hết phương pháp sắc ky cột phân ly cho phân tích nồng độ vật chất sử dụng hệ thống thể bên dưới: Figure 1: Nguyên lý sắc ký cột Thiết bị bao gồm hệ thống bơm, phận tiêm mẫu, cột sắc ký (bộ phận điều khiển nhiệt độ sử dụng cần thiết), detector hệ thống thu liệu (hay máy phân tích máy ghi đồ thị) Pha động cung cấp từ vài bình chứa chảy qua cột, thơng thường với tốc độ khơng đổi sau chạy qua detector PHẦN II Phương pháp đo Nguyên lý hoạt động Figure 2: Sắc ký cột phân ly - Trong sắc ký cột phân ly, pha tĩnh bao bọc column ( cột thủy tinh cột kim loại ) Sau đó, hỗn hợp chất phân tích áp dụng vào pha động, thường gọi chất rửa giải, đưa qua cột cách sử dụng hệ thống bơm với áp suất không đổi Một thiết bị tiêm mẫu sử dụng để áp dụng mẫu vào cột - Pha tĩnh phủ lên hạt nhỏ rời rạc (chất nền) đóng gói vào cột áp dụng màng mỏng vào thành bên cột Khi chất rửa giải chảy qua cột, chất phân tích phân tách sở hệ số phân bố chúng lên riêng lẻ dung dịch rửa giải rời khỏi cột Hỗn hợp dung dịch phân tách định lượng qua đầu dò detector để phát đo chất phân tích chúng rời khỏi cột - Mẫu vật thử-̀ ”chất tan”, tác dụng lên pha sắc ký Pha linh hoạt thường khí nước, mang chất tan, qua vùng pha tĩnh Pha tĩnh có lực vật lý với chất hoà tan lại gọi “chất hấp phụ” Chất hấp phụ rắn lỏng - Do lực với ‘chất tan’ khác nên thời gian lưu lại vùng tĩnh dài chất có lực thấp sớm chuyển động khỏi vùng pha tĩnh (gọi rửa) Quá trình rửa giải cột sắc ký - Sắc ký phương pháp vật lý để tách riêng thành phần hỗn hợp cách phân chia chúng thành pha: pha động pha tĩnh Figure 3: Quá trình rửa giải cột sắc ký - - - Rửa giải q trình hóa học liên quan đến việc loại bỏ ion vật liệu cách trao đổi ion với vật liệu khác Trong hệ thống gồm có hai pha: pha động pha tĩnh Đối với chất riêng biệt hỗn hợp, tùy theo khả hấp phụ khả hòa tan dung mơi rửa cột để lấy trước sau Sắc ký hấp phụ thực ống trơ về mặt hóa học đối với các chất quá trình sắc ký, cột có thể là: thủy tinh, kim loại, nhựa thẳng đứng gọi “cột” với chất hấp phụ đóng vai trị pha tĩnh, dung mơi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ Chất hấp phụ sắc ký cột thường dùng oxid nhơm, silica gel, CaCO3, than hoạt tính, polyamid, các loại có gắn nhóm ion,… Các chất phải tiêu chuẩn hóa Dung mơi dùng mợt hỗn hợp nhiều loại dung mơi có tỉ lệ thích hợp Quy trình rửa giải nói chung là sử dụng dung môi có tính chất hướng về một phía hoặc tăng hoặc giảm về tính chất Với chất hấp phụ pha tḥn cổ điển, dung mơi sử dụng có độ phân cực tăng dần. Kỹ thuật sắc ký chiết chất bị hấp phụ từ môi trường hấp phụ rắn sử - - - - - dụng dung môi. Chất rửa giải dung môi pha động qua cột. Khi phân cực chất rửa giải khớp với cực phân tử mẫu, phân tử tách khỏi chất hấp phụ hòa tan chất rửa giải Phần pha động vận chuyển thành phần mẫu gọi dung dịch rửa giải. Hỗn hợp chất tan dung mơi khỏi cột gọi chất rửa giải. Dịch rửa giải tạo thành từ pha động chất phân tích. Là chất phân tách di chuyển thành phần hỗn hợp qua cột máy sắc ký. Chất rửa giải sắc ký lỏng dung mơi lỏng cịn sắc ký khí khí mang Để mơ tả cách chất tan giữ lại cột sắc ký có mặt chất lỏng định, thuật ngữ “pha động yếu” “pha động mạnh” sử dụng Pha động mạnh dung môi dung dịch rửa giải nhanh chất tan khỏi cột Tình xảy pha động giống với pha tĩnh loại tương tác mà loại có với chất tan Pha động yếu dung môi dung dịch rửa giải từ chất tan khỏi cột, điều xảy pha động khác với pha tĩnh tương tác với chất tan Điều quan trọng cần lưu ý chất lỏng pha động yếu hay mạnh phụ thuộc vào loại pha tĩnh cột Ví dụ, dung mơi khơng phân cực (như hexan) pha động yếu pha tĩnh có cực pha động mạnh pha tĩnh khơng phân cực Do đó, pha tĩnh xác định chất lỏng pha động mạnh hay yếu cột sắc ký định Việc tách hai hợp chất riêng có đạt kết tốt hay không tùy thuộc vào hệ số phân chia (partition coeffiicient) Bất kỳ hợp chất đặt vào hệ thống gồm có pha (thí dụ: hai pha lỏng-lỏng rắn-lỏng), lúc đạt đến trạng thái cân bằng, hợp chất phân bố vào pha với tỉ lệ nồng độ cố định, tỉ lệ thay đổi tùy vào tính chất động học hợp chất hai pha Cân cấu tử X hệ sắc ký mơ tả phương trình sau: Hằng số cân K cho cân gọi tỉ lệ phân bố hay số phân bố (partition coefficient) tính sau: Với CS   : nồng độ cấu tử pha tĩnh       CM  : nồng độ cấu tử pha động - Hệ số K tùy thuộc vào chất pha tĩnh, pha động chất phân tích Mỗi hợp chất có lực riêng hai pha, có tương tác mạnh/yếu khác pha tĩnh Hệ hợp chất di chuyển ngang qua pha tĩnh với vân tốc khác nhau, nhờ kỹ thuật sắc ký tách riêng loại hợp chất Pha tĩnh cột sắc kí Figure 4: Bảng liệt kê pha tĩnh phổ biến sử dụng sắc ký cột hấp phụ - Có hai loại pha tĩnh sử dụng sắc ký lỏng pha tĩnh dạng rắn pha tĩnh dạng lỏng Mỗi dạng lại có nhiều loại khác nhau, tùy theo đặc điểm chất cần tách, kỹ thuật tách mà lựa chọn pha tĩnh phù hợp - Loại vật liệu hấp phụ sử dụng làm pha tĩnh quan trọng để phân tách hiệu thành phần hỗn hợp. Một số chất rắn khác sử dụng. Vật liệu hấp phụ chọn dựa kích thước hạt hoạt tính chất rắn. Hoạt tính chất hấp phụ biểu thị cấp hoạt động nó, thước đo sức hút chất hấp phụ chất hòa tan dung dịch mẫu. Chất rắn có hoạt độ cao chất rắn hoàn toàn khan. Silica gel alumina chất hấp phụ phổ biến sử dụng. Alumina phục vụ tốt cho mẫu yêu cầu điều kiện cụ thể để phân tách cách thích hợp. Tuy nhiên, việc sử dụng pha tĩnh khơng trung tính phải thực thận trọng, sự tăng giảm độ pH pha tĩnh alumin cho phép phản ứng hóa học xảy thành phần hỗn hợp. Tuy nhiên, silica gel hoạt động alumina thường sử dụng làm chất hấp phụ toàn diện cho hầu hết thành phần dung dịch. Silica ưa chuộng khả chứa mẫu cao, làm cho trở thành vật liệu hấp phụ phổ biến Kích thước hạt vật liệu hấp phụ loại bỏ theo kích thước mắt lưới Điều đề cập đến sàng tiêu chuẩn mà thành phần qua Rây 100 mắt - 10 Figure 8: Biển diễn quang học máy dò huỳnh quang - Ứng dụng quang phổ huỳnh quang liên quan đến việc sử dụng chùm sáng (thường ánh sáng cực tím) kích thích electron phân tử định mẫu phân tích để phát ánh sáng nhìn thấy Thơng thường phát xạ đặn góc 90 ° có kích thích 5.4.2.2 Cấu tạo - Gồm thành phần sau:  Nguồn sáng: tạo xạ cần thiết o Đèn Xenon o Nguồn cảm ứng Laser  Bộ phận đơn sắc hóa: gồm phần đơn sắc hóa xạ kích thích (trước buồng đo) xạ huỳnh quang (sau buồng đo)  Buồng đo: bố trí để phương buồng đo phương buồng sáng vng góc với  Để tăng tín hiệu thu nhận, đơi người ta cịn bố trí thêm gương phía đối diện 16 Figure 9: Nguyên lý hoạt động Fluorescence Detector 5.4.2.3 Nguyên lý hoạt động - Dựa vào hiện tượng chất hấp thụ ánh sáng để đạt mức lượng cao phát ánh sáng để trở lại mức ban đầu. Một chất có bước sóng ánh sáng cụ thể mà hấp thụ (bước sóng kích thích) phát (bước sóng phát xạ) Trong máy dò UV / UV-VIS phát ánh sáng qua flow cell, máy dò huỳnh quang phát huỳnh quang phát theo hướng trực giao với ánh sáng kích thích 5.4.3 Detecter PAD (Photodiode Array) 5.4.3.1 Giới thiệu - Đây máy dò UV phổ biến theo dõi toàn phổ UV/VIS vật liệu qua flow cell cách sử dụng cảm biến hình ảnh photodiode Kết thu độ hấp thụ quang phổ sử dụng để đánh giá định lượng, nhận dạng đánh giá độ tinh khiết đỉnh Một Detector giới thiệu Hewlett Packard (Agilent) vào năm 1982 5.4.3.2 Cấu tạo 17 - Từ sơ đồ ta thấy cấu tạo Detector PAD/DAD giống với loại Detector UV/VIS, khác chỗ ánh sáng từ đèn chiếu trực tiếp vào flow cell, ánh sáng qua phân tán cách tử nhiễu xạ lượng ánh sáng phân tán ước tính cho bước sóng PAD Figure 10: Giản đồ hệ thống quang học a) UV/VIS Detector b) PAD Detector 5.4.3.3 Nguyên lý hoạt động 18 - - Cũng Detector UV/VIS, hai dựa định luật Lamber – Beer.Toàn quang phổ đèn D2 qua flow cell ánh sáng truyền qua phân tán cách tử cố định vào phần tử mảng diode để theo dõi cường độ ánh sáng bước sóng Trong đầu dị UV/VIS có phần tiếp nhận ánh sảng phía mẫu PAD có nhiều mảng diode quang (1024 512) để thu thông tin loạt bước sóng lúc Figure 11: Kết đo hiển thị màng hình PAD - Bản đồ đường viền 2D hình cho phép hiển thị sắc đồ bước sóng phát khác nhau, đánh giá độ tinh khiết píc, phân tích định lượng sắc ký đồ định tìm kiếm thư viện quang phổ UV 5.5 Sắc ký đồ Sắc ký đồ là đầu trực quan sắc ký. Trong trường hợp phân tách tối ưu, đỉnh mẫu khác sắc ký đồ tương ứng với thành phần khác hỗn hợp tách 19 Figure 12: Cột x sắc ký đồ biểu thị thời gian lưu    Trục x vẽ thời gian lưu Trục y vẽ tín hiệu tương ứng (ví dụ thu máy đo quang phổ, máy quang phổ khối loại máy dò khác) tạo máy phân tích khỏi hệ thống.  Trong trường hợp hệ thống tối ưu, tín hiệu tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích cụ thể tách 5.6 Thiết bị thu thập liệu     Tín hiệu từ đầu dị thu thập máy ghi biểu đồ tích hợp điện tử khác với phần mềm lưu trữ, phân tích xử lý liệu sắc ký Các ứng dụng sắc ký cột phân ly Thông tin thu thập qua hệ thống sắc ký cột bao gồm độ phân giải, định lượng hợp chất Sự thay đổi dung dịch rửa giải máy dị phát dạng tín hiệu điện tử mắt khơng thể nhìn thấy Ngày xưa, bút (giấy) ghi nhanh sử dụng phổ biến. Ngày nay, xử lý liệu dựa máy tính (bộ tích hợp) phổ biến Có nhiều loại xử lý liệu khác nhau; từ hệ thống đơn giản bao gồm máy in xử lý văn tích hợp hệ thống có phần mềm thiết kế đặc biệt cho hệ thống LC không thu thập liệu mà cịn có tính đo đỉnh, hiệu chỉnh đường sở, tính tốn nồng độ tự động, xác định trọng lượng phân tử, v.v 5.7 Bình thải Chứa đựng nước thải 20 Yêu cầu sắc ký cột phân ly Sắc ký cột phân ly có số yêu cầu mẫu chất phân tích, định dạng chúng vai trị pha động phương pháp Yêu cầu phải đáp ứng trước LC kiểm tra hóa chất phải có khả đưa hóa chất vào chất lỏng tiêm vào pha động Đây yêu cầu nghiêm ngặt nhiều so với yêu cầu GC, chất phân tích phải dễ bay tự nhiên chuyển đổi thành dạng dễ bay Đặc điểm làm cho LC có giá trị việc tách nhiều hợp chất sinh học lớn (ví dụ, protein, peptit axit nucleic) mà khơng thể dễ dàng đưa vào pha khí Việc sử dụng chất lỏng làm pha động cho phép LC hình thành nhiệt độ thấp nhiều so với GC, làm cho phù hợp với hợp chất không ổn định nhiệt Yêu cầu thứ hai LC phải có khác biệt độ lưu giữ chất phân tích xếp hạng riêng Mặc dù lưu giữ thay đổi GC cách điều chỉnh nhiệt độ loại pha tĩnh col umn, lưu giữ LC thay đổi cách thay đổi pha động mật độ chất lỏng cao so với chất khí Kết là, khả lưu giữ chất tan LC phụ thuộc vào tương tác thành phần mẫu với pha động pha tĩnh, làm cho LC linh hoạt GC tối ưu hóa phân tách Ưu Nhược Điểm Của Phương Pháp Sắc Ký Cột Phân Ly 7.1 Ưu điểm sắc ký lỏng:  Có khả định lượng đồng thời chất có độ phân cực gần  Đầu dò hiệu cao, độ nhạy cao  Hữu hiệu định lượng hợp chất hữu có nhiệt thủy phân thấp  Nó giúp tách tạp chất khỏi loại hỗn hợp  Bất kỳ phân tách đa dạng số lượng thực thơng qua sắc ký cột  Nhiều loại dung mơi sử dụng trình phân tách dựa kết u cầu  Q trình tự động hóa  Nó tốn 7.2 Nhược điểm sắc ký lỏng:  Thời gian gian làm ổn định cột sắc ký sau lần chạy lâu 21  Tốn nhiều dung mơi hữu  So với sắc ký khí, sắc ký lỏng kỹ thuật chậm  Sắc ký cột phân ly có đỉnh cao mở rộng dải có độ phân giải thấp so với sắc ký khí Ứng dụng      Sắc ký cột dùng để phân lập hoạt chất Nó hữu ích việc tách hỗn hợp hợp chất Nó sử dụng để xác định ước tính thuốc từ cơng thức thuốc Nó sử dụng để loại bỏ tạp chất Được sử dụng để phân lập chất chuyển hóa từ dịch sinh học 22 PHẦN III Thiết bị thực Giới thiệu chung 1.1 Tên thiết bị  BioLogic LP System Bio – Rad 1.2 Một số thông tin Bio – Rad - Bio-Rad năm công ty hàng đầu giới khoa học sống, cung cấp thiết bị, phần mềm, vật tư tiêu hao, hóa chất sản phẩm lĩnh vực sinh học tế bào, biểu gen, tinh protein, định lượng protein, phát sản xuất thuốc, an toàn thực phẩm kiểm tra chất lượng môi trường, với giáo dục khoa học Các sản phẩm giải pháp dựa công nghệ để phân tách, tinh sạch, xác định, phân tích khuếch đại sinh phẩm kháng thể, protein, axit nucleic, tế bào vi khuẩn 1.3 BioLogic LP System - BioLogic LP System hệ thống cột sắc ký lỏng áp suất thấp ( LPLC_Low Pressure Liquid Chromatography) BioRad sản xuất Figure 13: BioLogic LP System 23 Một số đặc điểm             - Lưu trữ lên đến 50 phương thức Kiểm soát (tối đa) đệm Lập trình dựa thời gian khối lượng Chỉnh sửa phương pháp tiến hành Chức ‘Trợ giúp’ trực tuyến, nhạy cảm với ngữ cảnh Tự động cảm nhận diện van Tốc độ dòng chảy đến 40 ml/ph Lập trình lên đến 50 cửa sổ sưu tập Ba báo thức lập trình tùy chọn giữ Giám sát độ dẫn điện Bộ dò UV 280 nm 254 nm tiêu chuẩn Lựa chọn Bộ thu thập Bio-Rad 2110 2128 Một ưu điểm Hệ thống LP BioLogic khả chỉnh sửa phương pháp tiến hành Sẽ thời gian nhiều để cố gắng tối ưu hóa phân tách Thêm vào đó, BioLogic LP lưu trữ vơ thời hạn phương pháp thường sử dụng, tốn thời gian cho việc chuẩn bị phân tách Figure 14: Phần điều khiển hệ thống Trong : Điều khiển bàn phím tất thiết bị Đèn LED trạng thái cho biết thành phần hoạt động 24 ‘Trợ giúp’ trực tuyến có phân biệt ngữ cảnh cung cấp câu trả lời cho câu hỏi Các chế độ hoạt động lựa chọn Phím nhạc cụ biểu tượng công cụ địa độc Bộ thu thập phân đoạn BioFrac Figure 15: BioFrac Fraction Collector - BioFrac Fraction Collector cung cấp tính linh hoạt với nhiều tùy chọn giá thu gom, bao gồm giá để sưu tập tùy chỉnh sẵn Giá đỡ tùy chỉnh cung cấp nhiều khả thu gom, từ giọt (~ 50 µl) đến 99 lít Giá đỡ ngồi kệ mở rộng tính linh hoạt kế hoạch thu thập cung cấp khả lưu trữ mẫu hiệu chi phí Giá treo ngồi hấp tiệt trùng, dễ dàng lắp ráp nằm phẳng, cần khơng gian lưu trữ  Các tính bao gồm: - Bộ thu thập theo thời gian, giọt khối lượng - Thả chuyển động cánh tay theo chuyển động x,y; cánh tay phân phối điều chỉnh tay để chiều cao ống lên đến 150mm - Nhiều giá đỡ có sẵn chứa ống (đường kính 12-20mm), ống vi sinh (0.5, 1.5 2.0 ml) - Giá đỡ bồn nước đá cho phép làm mát ống vi mẫu 13mm ống tuân theo tiêu chuẩn SBS - Giá để chuẩn bị BioFrac Prep-20 tùy chọn với tối đa 20 cổng thu gom Bộ thu thập phân đoạn Model 2110 25 Figure 16: Bộ thu thập phân đoạn Model 2110 Bộ thu thập phân đoạn Model 2110 cung cấp nhiều chế độ thu thập để phân tách sắc ký - Bộ thu thập theo thời gian, giọt khối lượng Thu thập phân đoạn từ giọt (~ 50 µl) đến ml 80 ống nghiệm vi ống Cột sắc ký Cột sắc ký Econo-Column cột sắc ký thủy tinh chất lượng cao, áp suất thấp. Những cột linh hoạt có kích thước dài từ đến 170 cm đường kính từ 0,5 đến 5,0 cm. Giá đỡ lớp polyme xốp cột giữ lại hạt mịn phụ kiện cuối polypropylene mờ cho phép quan sát toàn lớp cột Hoạt động áp suất