ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ SEMINAR ĐỀ TÀI TÌM HIỂU CEPHALOMANNINE CÓ TRONG THÔNG ĐỎ ĐÀ LẠT (TAXUS WALLICHIANA ZUCC ) GV[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA HÓA HỌC BỘ MƠN HĨA HỌC HỮU CƠ SEMINAR ĐỀ TÀI: TÌM HIỂU CEPHALOMANNINE CĨ TRONG THƠNG ĐỎ ĐÀ LẠT (TAXUS WALLICHIANA ZUCC.) GV : PGS TS NGUYỄN TRUNG NHÂN HV : BÙI NGUYỄN NGỌC HÀ - K29 MSHV: 19C51008 MỤC LỤC PHỤ LỤC ii ĐẶT VẤN ĐỀ NỘI DUNG .2 Tổng quan alkaloid 1.1 Định nghĩa 1.2 Phân loại .2 Thông đỏ Lâm Đồng 3 Cephalomannine Thông đỏ 3.1 Công thức lập thể 3.2 Tính chất vật lý 3.3 Phương pháp ly trích lập 3.4 Nhận danh cấu trúc 3.4.1 Phổ H-NMR cephalomannine 3.4.2 Phổ 13C-NMR cephalomannine 3.4.3 Phổ ESI-MS cephalomannine: 3.5 Quá trình sinh tổng hợp cephalomannine 3.6 Quá trình bán tổng hợp cephalomannine .7 3.7 Hoạt tính sinh học .8 Kết luận TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 i PHỤ LỤC HÌNH Hình 1: Lá thông đỏ .3 Hình 2: Cơng thức lập thể cephalomannine Hình 3: Quá trình sinh tổng hợp cephalomannine .7 Hình 4: Quá trình bán tổng hợp cephalomannine BẢNG BIỂU Bảng 1: Dữ liệu phổ H-NMR Bảng 2: Dữ liệu phổ 13C-NMR ii ĐẶT VẤN ĐỀ Từ xưa, người biết tận dụng cỏ tự nhiên vào để làm thuốc chữa bệnh Nhưng ngẫu nhiên phải nhiều thời gian người ta nhận biết loại dùng làm thuốc Ngày nay, ngành tổng hợp hoá dược phát triển nhanh chóng khơng phải hợp chất dễ dàng tổng hợp Để đáp ứng yêu cầu đó, đồng thời tận dụng ưu đãi thiên nhiên, ngành Hoá học hợp chất tự nhiên đời phát triển mạnh mẽ Nhiều hợp chất tự nhiên cô lập từ cỏ ứng dụng rộng rãi để sản xuất loại thuốc chữa bệnh bảo vệ sức khoẻ người Hơn nữa, việc dùng thuốc Nam không gây tác dụng phụ phù hợp với sức khoẻ người Một nhóm hợp chất tự nhiên quan tâm nhiều alkaloid, chúng có hoạt tính đa dạng ứng dụng làm thuốc nhiều Ngồi ra, nhiều alkaloid mơ hình quan trọng để phát triển thành dược phẩm tổng hợp bán tổng hợp có giá trị Trong lồi chứa alkaloid, Thơng đỏ Thái Bình Dương chiếm vị trí quan trọng Thơng đỏ Thái Bình Dương – tên khoa học Taxus wallichiana có kích thước trung bình, mọc trải dài dãy Himalaya, từ Afghanistan tới Miến Điện Ngày xưa, phận T Wallichiana sử dụng để điều trị nhiều loại bệnh làm thuốc nhuộm Nó sử dụng thuốc chống co thắt, ho máu, động kinh, hen suyễn loại bệnh nhiễm trùng khác Quả T Wallichiana đươc sử dụng thuốc an thần, chống co thắt điều hòa kinh nguyệt Lá sử dụng cho chứng khó tiêu, động kinh, hồi hộp thuốc kích thích [1] Taxus wallichiana Zucc thu hút ý giới khoa học tính chất dược học to lớn Một alkaloid tiếng phát lá, vỏ Taxus wallichiana Taxol (tên thương mại Paclitaxel) dung để điều trị số loại ung thư ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư phổ, ung thư cổ tử cung ung thư tuyến tụy Ngoài taxol, alkaloid khác phân lập, nghiên cứu cấu trúc, hoạt tính sinh học trình sinh tổng hợp Tại Việt Nam, thơng đỏ Đà Lạt thuộc lồi Taxus wallichana Zucc chứa nhiều loại alkaloid cephalomannine có hàm lượng lớn bên cạnh taxol Trong nội dung seminar này, xin phép trình bày đề tài “Tìm hiểu cephalomannine có Thông đỏ Đà Lạt (Taxus wallichiana Zucc.)” NỘI DUNG Tổng quan alkaloid 1.1 Định nghĩa Trong khoảng 50 000 hợp chất tự nhiên tìm thấy, có khoảng 12 000 alkaloid Ngày nay, alkaloid có hoạt tính sinh học phân lập từ ứng dụng nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp chăm sóc sức khỏe người Chúng dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm mỹ phẩm v.v Đã từ lâu nhà khoa học tìm thấy hợp chất tự nhiên, hợp chất thường acid chất trung tính Đến năm 1806, dược sĩ Friedrich Wilhelm Sertuner phân lập chất từ nhựa thuốc phiện có tính kiềm gây ngủ mạnh đặt tên morphin Năm 1810, Gomes chiết chất kể tinh từ vỏ canhkina đặt tên “Cinchonino” Đến năm 1819, dược sĩ Wilhelm Meissner đề nghị xếp chất có tính kiềm lấy từ thực vật thành nhóm riêng ơng đề nghị gọi lên alkaloid Ông người đưa định nghĩa alkaloid: Alkaloid hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, có phản ứng kiềm lấy từ thực vật [2] Sau này, người ta tìm thấy alkaloid khơng có thực vật mà cịn có động vật Ngồi tính kiềm, alkaloid cịn có đặc tính khác có hoạt tính sinh học mạnh, có tác dụng với số thuốc thử gọi thuốc thử chung alkaloid Polonopski định nghĩa: “Alkaloid hợp chất hữu có chứa nitơ, đa số có nhân dị vịng, có phản ứng kiềm, thường gặp thực vật động vật, thường có dược tính mạnh cho phản ứng hóa học với số thuốc thử gọi thuốc thử chung alkaloid” [2] Tuy nhiên có số chất xếp vào alkaloid nitơ khơng dị vịng mà mạch nhánh; số alkaloid khơng có phản ứng kiềm Vì theo IUPAC định nghĩa alkaloid chất hợp chất chứa nitơ (đa phần nitơ dị vịng) có nguồn gốc chủ yếu từ thực vật (nhưng không loại trừ nguồn gốc động vật) Amino acid, peptides, proteins, nucleotides, acid nucleic, đường amino chất kháng sinh alkaloid Mở rộng, chất di truyền sinh học trung tính liên quan đến alkaloid xem alkaloid [3] 1.2 Phân loại Có nhiều cách phân loại alkaloid: - Dựa vào số lượng nguyên tố - Dựa theo lý tính - Dựa vào tác dụng dược lý - Dựa vào họ chi thực vật - Dựa vào nguồn acid amin: tyrosin, tryptophan, lysin, histidin,… - Dựa vào sinh tổng hợp: pseudo-, proto-, true-alkaloid - Dựa vào cấu trúc hóa học: tropan, quinolin, indol, … Thơng đỏ Lâm Đồng Thơng đỏ Lâm Đồng có tên khoa học T baccata ssp Wallichiana (Zucc.) Pilg.; tên tiếng Anh Taxus wallichiana Zucc thuộc họ Thông đỏ (Taxaceae) Đây lồi thơng địa vùng Himalaya, từ đơng Afghanistan đến phía tây tỉnh Vân Nam thuộc tây năm Trung Quốc, độ cao 2000-35000 m Taxus wallichiana Zucc phát Joseph Gerhrad Zuccarini vào năm 1843, thêm chữ “Zucc” trình đặt tên [4] Cây gỗ lớn cao tới 25m, đường kính thân 1m Cây mọc đứng với cành mọc phân tán Bỏ nâu đỏ bóc tách thành mảng nhỏ Lá dạng dài mác, thẳng đơi hình lưỡi liềm, mềm, xếp hình xoắn ốc thành dãy, mọc cách, dài 2,5 cm – cm rộng mm, thuôn thành đỉnh nhọn, gốc mọc xuống, mép phẳng, mặt xanh vàng, mặt xanh nhạt với lỗ khí xanh nhạt hai bên gân chồi mọc dựng lên xếp thành dãy Nón đơn tính khác gốc Nón đơn độc, có hạt bao quanh khơng bao kín áo hạt màu đỏ, chin năm Nón đực tạo thành hang nách lá, nhỏ, hình trứng, dài mm rộng 3mm, khơng có cuống có cuống nhỏ Hạt hình trứng, mm x 5mm, đen chin Hình 1: Lá thơng đỏ Thơng đỏ Lâm Đồng có phân bố rải rác thành quần thể nhỏ nhiều nơi thuộc tỉnh Lâm Đồng độ cao khoảng 1.500m Tổng số tìm thấy chưa 250 cá thể trưởng thành Loài phân bố hẹp, bị đe doạ tuyệt chủng nạn phá rừng khai thác để phục vụ cho nghiên cứu sản xuất thuốc chữa bệnh ung thư Số cá thể trưởng thành gặp tự nhiên Loài ghi Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “hiếm” (Bậc R) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý (nhóm 1) Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 Chính phủ để nghiêm cấm khai thác, sử dụng mục đích thương mại; cần bảo vệ điểm phân bố biết, đặc biệt Vườn quốc gia Bì Đúp - Núi Bà Nghiên cứu nhằm mục đích cho việc trồng để chủ động nguồn nguyên liệu phục vụ cho nghiên cứu làm thuốc bảo tồn ngoại vi Cephalomannine Thông đỏ 3.1 Công thức lập thể O O O NH O OH O OH O OH O O O Hình 2: Công thức lập thể cephalomannine - CTPT C45H53NO14 - M = 831.3466 g/mol - Tên thường: Cephalomannine, Taxol B - Danh pháp IUPAC: [4,12-diacetyloxy-1,9-dihydroxy-15-[2-hydroxy-3-(2methylbut-2-enoylamino)-3-phenylpropanoyl]oxy-10,14,17,17-tetramethyl-11-oxo6-oxatetracyclo[11.3.1.03,10.04,7]heptadec-13-en-2-yl] benzoate 3.2 Tính chất vật lý - Trạng thái tự nhiên: rắn, bảo quản -20°C - Độ tan: tan DMSO - Nhiệt độ sôi: 929.53°C - Năng lực triền quang: [α]25 = −41o (c, 0.39, MeOH) 3.3 Phương pháp ly trích cô lập Vỏ thông đỏ T wallichiana Zucc phơi khơ nhiệt độ phịng, sau xay nhỏ thành bột Bộ vỏ ngâm 15l methanol trích lần, lọc quay chân không 40oC thu cao methanol Dung môi methanol thu hồi, sau tiếp tục chiết kiệt bột vỏ ban đầu với qui trình tương tự (thực lần) Cao methanol thu chiết lỏng – lỏng dung môi n-hexan, dichloromethane, etyl acetat chia thành phân đoạn từ A đến E [1] Phần cao dichloromethane hòa tan dung môi methanol Sử dụng sắc ký bảng mỏng khảo sát với hệ rửa giải benzene-chloroform-acetone-methanol (20:92.5:15:7.5), sau đặt đèn UV (254nm); baccatin III, paclitaxel cephalomannine có Rf = 0.55 – 0.66 cạo khỏi bảng Chất rắn thu được rửa giải với acetone-methanol (1:1) để silicagel, sau đem quay Hịa tan chất rắn thu vào CH2Cl2, sau chạy HPLC (Rainin Dynamax-CyanoR, 2,1x 25 cm) với hệ dung môi hexane-isopropanol (2:1) Cephalomannine thu sau 38,1 phút taxol sau 45,3 phút [5] 3.4 Nhận danh cấu trúc 3.4.1 Phổ H-NMR cephalomannine Vị trí 6 10 13 14 16 17 18 19 20 20 OAc OAc 2’ 3’ 3’Ph NH OBz OBz δ (ppm) Loại mũi d d dd m m m s t m s s s s d d D dd d m dd 5.66 3.75 4.92 1.85 2.5 4.4 6.25 6.18 2.22 1.25 1.12 1.81 1.67 4.18 4.29 2.24 2.36 4.7 5.76 7.36 6.5 7.36 8.05 Bảng 1: Dữ liệu phổ H-NMR 3.4.2 Phổ 13C-NMR cephalomannine Vị trí δ (ppm) 79 74.9 45.5 81.1 84.4 J (Hz) 7 7, 8 9, 8, 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 4-OAc C=O 4-OAC CH3 10-OAc C=O 10-OAc CH3 C=O PH q-Ph o-Ph m-Ph p-Ph q-Ph o-Ph m-Ph p-Ph 5’ 6’ 7’ 8’ 6’ CH3 35.5 72.17 58.5 203.8 75.6 133.1 142.2 72.24 35.5 43.1 21.8 26.8 14.7 9.5 76.5 170.4 22.5 171.4 20.8 167.1 129.15 130.3 128.3 133.8 131.3 127 128.8 129.03 169.1 138.2 132 13.9 12.3 Bảng 2: Dữ liệu phổ 13C-NMR Dữ liệu phổ phát triển sở hữu phịng thí nghiệm Lange WSU (Washington State University) 3.4.3 Phổ ESI-MS cephalomannine: m/z 854.335327 [M+Na]+; lý thuyết C45H53NO14 831.3466 g 3.5 Quá trình sinh tổng hợp cephalomannine Những nghiên cứu khoa học sinh tổng hợp cephalomannine cho thấy trình tổng hợp cephalomannine tương tự sinh tổng hợp taxol Sự sinh tổng hợp cephalomannine bắt đầu với đóng vịng tiền chất diterpenoid geranylgeranyl diphosphate tạo taxa-4(5),11(12)-diene Olefin sau oxid hóa, acyl hóa phản ứng khác tạo trung gian baccatin III Vị trí C13O baccatin III gắn với mạch nhánh phenylisoserine tạo taxol dẫn xuất cephalomannine (taxol B), taxol C [6] O aminomutase H O H2N OH OH H O SCoA aminoacyl CoA H NH2 (R)- β -phenylalanoyl CoA (R)- β -phenylalanine (S)-α -phenylalanine H2N ATP CoA-SH AcO O OH HO O aminoacyl CoA 2' Ph 13-O-transferase OH OBz AcO AcO CoA-SH O NH2 NADPH O2 2'-hydroxylase O OH OBz OAc N-debenzoyl-2'-deoxytaxol O O O OH O NH2 Ph OH O baccatin III AcO O R SCoA R aroyl/acyl CoA Ph O N-transferase O OH OH OBz AcO NH O O O OH OH OBz OAc OH O OAc N-debenzoyltaxol Taxol (Taxol A), R = Ph Cephalomannine (Taxol B), R = (E)-2-buten-2-yl Taxol C, R = n-C5H11 Taxcultine (taxol D), R = n-C3H7 Hình 3: Quá trình sinh tổng hợp cephalomannine 3.6 Quá trình bán tổng hợp cephalomannine Cephalomannine bán tổng hợp dựa trình sau từ 9-dihydro-13acetylbaccatin III (9DHB) [7] OH AcO O H3C OH DMAP or n-BuLi,THF -78oC to RT O H3C O OH OAc OBz 9DHB OH AcO O H3C OR1 O BOC protecting agent O OH OH AcO O OAc OBz CrO3/silica gel NaBH4/LiCl OR1 R1=BOC O O DCC OR DPC, DMAP Tol/THFM 40-70OC phenyl isoserine side chain OH OBz O R NH Ph AcO O O R OR1 H+, THF or DCM or mixtures of above Ph O R1O O OH OBz OAc O NH AcO O O OH O R1 O OAc O OH OBz OAc Dẫn xuất taxol BOC = nhóm tert-butyxylcarbonyl DCC = N,N’-dicyclohexylcarbodiimide DPC = di-2-pyridylcarbonate DMAP = 4-dimethylaminopyridine DCM = dichloromethane Hình 4: Quá trình bán tổng hợp cephalomannine 3.7 Hoạt tính sinh học Cephalomannine có hoạt tính chống ung thư thử nghiệm khối u chuột Cephalomannine sử dụng hóa trị số loại ung thư, phổ biến ung thư phổi Trong nghiên cứu ứng dụng chống ưng thư hợp chất taxoid, với mục tiêu cải thiện tính tan, dược tính mạnh tăng khả chống kháng thuốc, nhà khoa học phát hợp chất cephalomannine – chất có cấu trúc tương tự paclitaxel với tính chất – phát triển thành thành phần thuốc Các họ thực vật chứa paclitaxel chứa lượng lớn cephalommanine Vòng tanxane cephalomannine giống vòng tanxane paclitaxel; khác mạch nhanh Paclitaxel có nhóm amino nhánh phenyl isoserine benzoyl hóa, cịn nhóm amino cephalomannine gắn với axit (E)-2-methyl-2butenoic Trong nghiên cứu biến đổi cấu trúc, nhà khoa học tổng hợp lượng đáng hứa hẹn tác nhân chống ung thư halogen hóa liên kết đơi mạch nhánh cephalomannine Dẫn xuất dicloro dibromo cephalomannine 7-epi-cephalomannine cho thấy hoạt tính tương tự paclitaxel kiểm tra in vitro thực với 60 dòng ung thư người viện NCI lập nên [8] Kết luận Cephalomannine có chung khung sườn với taxol, khác nhóm vị trí C-13 nên cephalomannine có hoạt tính chống ung thư tương tự taxol Bên cạnh cephalomannine cịn có hoạt tính kháng bệnh bạch hầu động vật Tuy nhiên, hoạt tính cephalomannine cịn thấp so với taxol tanxane khác nên cephalomannine sử dụng tiền chất để tổng hợp nên taxol, 7-epicephalomannine,… Việc tìm hiểu nghiên cứu taxane alkaloid khác có hoạt tính kháng tế bào ung thư tương tự taxol có ý nghĩa quan trọng khoa học đời sống, giải vấn đề thiếu hụt nguồn taxol dược phẩm, y tế TÀI LIỆU THAM KHẢO T.U.Rahman, K.F.Khattak, W.Liaqat, M.I.Choudhary, “Antibacterial, antifungal, insecticidal, cytotoxic and phytotoxic activities of the crude extracts of Taxus wallichiana Zucc twigs”, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 8(1), 398-402, 2016 Dược liệu học, tập 2, NXB Y học, Bộ y tế, 9-10 Glossary of class names of organic compounds and reactivity intermediates based on structure (IUPAC Recommendations 1995), 67, 1313 Sudina Bhuju, Dhurva Gauchan, “International Journal of Research Taxus wallichiana (Zucc.), an Endangered Anti-Cancerous Plant”, International Journal of Research, (21), 2018 John H Cardellina II, “HPLC Separation of Taxol and Cephalomannine”, Journal of Liquid Chromatography, 14(4), 659-665, 1991 R.M.Long, C.Lagisetti, R.M.Coates, R.B.Croteau, “Specificity of the N-benzoyl transferase responsible for the last step of Taxol biosynthesis”, Archives of Biochemistry and Biophysics, 477, 384–389, 2008 Chatham Biotch Ltd, “Semi-synthetic process for the preparation of taxane derivatives”, WIPO, 2006 F.Shahidi, C.Ho, Phytochemicals and Phytopharmaceuticals, AOCS Press, Illinois, 57-58, 2000 10 ... thơng đỏ Đà Lạt thuộc lồi Taxus wallichana Zucc chứa nhiều loại alkaloid cephalomannine có hàm lượng lớn bên cạnh taxol Trong nội dung seminar này, xin phép trình bày đề tài ? ?Tìm hiểu cephalomannine. .. cephalomannine có Thơng đỏ Đà Lạt (Taxus wallichiana Zucc.)” NỘI DUNG Tổng quan alkaloid 1.1 Định nghĩa Trong khoảng 50 000 hợp chất tự nhiên tìm thấy, có khoảng 12 000 alkaloid Ngày nay, alkaloid có hoạt... thực vật [2] Sau này, người ta tìm thấy alkaloid khơng có thực vật mà cịn có động vật Ngồi tính kiềm, alkaloid cịn có đặc tính khác có hoạt tính sinh học mạnh, có tác dụng với số thuốc thử gọi