Thực tập vi sinh vật học

A IN IG R O L ĐÀM SAO MAI, TRỊNH NGỌC NAM, BÙI HỒNG QUÂN LÊ HỒNG THÍA, ĐÀO HỒNG HÀ R O IN IG A L NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH Viện Cơng nghệ sinh học & Thực phẩm LỜI NHÀ XUẤT BẢN Là khoa học nghiên cứu đặc điểm sinh học vi sinh vật - sinh vật có kích thước hiển vi siêu hiển vi, Vi sinh vật học có nhiệm vụ nghiên cứu đặc điểm hình thái, cấu tạo, di truyền hoạt động sinh vật hóa học; nghiên cứu phân bố vi sinh vật tự nhiên mối quan hệ chúng với môi trường sinh vật khác; nghiên cứu biện pháp thích hợp để sử dụng hiệu vi sinh vật có lợi biện pháp tích cực nhằm ngăn ngừa vi sinh vật có hại R O Cuốn sách “Thực tập Vi sinh vật học” nhóm tác giả: TS Đàm Sao Mai (chủ biên), Trịnh Ngọc Nam, Lê Hồng Thía, Đào Hồng Hà, Bùi Hồng Quân biên soạn công phu, nỗ lực đáng trân trọng việc giới thiệu phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập trung vào thí nghiệm nghiên cứu, xác định vi sinh vật dùng công nghiệp thực phẩm phương pháp kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm Sách cung cấp cho người đọc kiến thức thực hành vi sinh học thực phẩm cách tồn diện thơng qua việc trình bày kĩ thuật kinh điển Bên cạnh đó, sách cịn trình bày số kĩ thuật phân tích đại dựa nguyên tắc sinh học phân tử PCR sử dụng test thử nhanh hệ thống API Hệ thống thí nghiệm bố trí hợp lí, kiến thức trước làm cho sau Trong có phần nhắc lại lí thuyết trọng tâm, giúp người đọc nắm sở lí thuyết thí nghiệm Trình tự thao tác trình bày cặn kẽ, hợp lí minh họa rõ ràng Các thí nghiệm thực qua nhiều cơng đoạn có sơ đồ trình tự thí nghiệm, giúp người đọc hình dung rõ ràng tiến trình thí nghiệm Ngồi ra, phần Phụ lục có tiêu vi sinh số sản phẩm thực phẩm theo Tiêu chuẩn Việt Nam giúp người đọc thông tin giới hạn an toàn vi sinh thực phẩm Sách đáp ứng địi hỏi cơng tác hướng dẫn thực hành: cung cấp sở lí thuyết bản, dự trù nguyên liệu, hóa chất, chuẩn bị dụng cụ, hướng dẫn trình tự tiến hành thao tác chun mơn đặc biệt thí nghiệm, thí nghiệm vi sinh thí nghiệm tinh tế, nhạy cảm, địi hỏi cẩn trọng độ xác cao IN IG A Trên sở kế thừa, nâng cao, đổi nội dung kiến thức, sách thể kết tinh thần làm việc khoa học nghiêm túc tác giả Trong trình biên soạn, tác giả tham khảo, chọn lọc nhiều tài liệu, tn thủ ngun tắc trình bày rõ ràng, lơgích Vì vậy, sách tài liệu khoa học, hệ thống bản, có ích cho giáo viên hướng dẫn thực hành sinh viên ngành công nghệ thực phẩm L Nhà xuất Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh trân trọng giới thiệu sách “Thực tập Vi sinh vật học” đến đơng đảo bạn đọc NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Thực tập Vi sinh vật học LỜI MỞ ĐẦU Xung quanh chúng ta, ngồi sinh vật lớn mà nhìn thấy được, cịn có vơ vàn vi sinh vật nhỏ bé, muốn nhìn thấy chúng phải sử dụng kính hiển vi, người ta gọi chúng vi sinh vật Vi sinh vật phân bố rộng rãi tự nhiên ảnh hưởng lớn đến đời sống người sinh vật khác Ngành khoa học nghiên cứu hoạt động sống vi sinh vật gọi Vi sinh vật học Vi sinh vật học phát triển nhanh, với nhiều lĩnh vực khác nhau: vi khuẩn học, nấm học, tảo học, virus học hay y sinh vi sinh vật học, vi sinh vật học thú y, vi sinh công nghiệp, vi sinh nơng nghiệp, vi sinh mơi trường… Mỗi lĩnh vực có đối tượng riêng, cần sâu nghiên cứu; song mức độ định, chuyên ngành có điểm giống Quyển sách giúp sinh viên hiểu rõ số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật; đó, tập trung chủ yếu Vi sinh đại cương Vi sinh công nghiệp thực phẩm R O Tuy cố gắng q trình biên soạn song khơng thể tránh khỏi nhiều khiếm khuyết, mong nhận góp ý quý độc giả để nội dung sách ngày nâng cao IG Các tác giả IN A L Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm MỤC LỤC Trang Lời nhà xuất Lời mở đầu Những quy tắc an tồn phịng thí nghiệm vi sinh vật Bài R O Thiết bị, dụng cụ phịng thí nghiệm phương pháp tiệt trùng vi sinh vật Bài Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật 18 Bài Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 25 Bài Phương pháp quan sát vi sinh vật kính hiển vi quang học 33 Bài Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật 42 Bài Phương pháp phân lập vi sinh vật 53 Bài Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 60 Bài Khảo sát sinh trưởng vi sinh vật – Đường cong sinh trưởng vi sinh vật 64 Bài Khảo sát ảnh hưởng yếu tố môi trường đến sinh trưởng vi sinh vật 71 Bài 10 Khảo sát đặc tính sinh hóa vi sinh vật 75 Bài 11 Kiểm soát sinh trưởng vi sinh vật 91 Bài 12 Xác định khả phân giải cellulose hoạt tính enzyme cellulase vi sinh vật 95 Bài 13 Định lượng vi sinh vật phương pháp đếm trực tiếp 101 Bài 14 Định lượng tổng VK hiếu khí thực phẩm phương pháp đếm khuẩn lạc 107 Bài 15 Định lượng Coliform phương pháp MPN (Most probable number) 115 Bài 16 Định lượng vi sinh vật phương pháp dùng petrifilm 121 Bài 17 Ứng dụng vi sinh vật sản xuất thực phẩm – Làm tương đậu 126 Bài 18 Ứng dụng vi sinh vật sản xuất thực phẩm – Làm rượu vang 129 Bài 19 Phương pháp phân tích định lượng Escherichia coli thực phẩm 132 Bài 20 Phương pháp phân tích Salmonella spp thực phẩm 141 Bài 21 Phương pháp phân tích định lượng Bacillus cereus thực phẩm 149 Bài 22 Phương pháp phân tích định lượng Staphylococcus aureus thực phẩm 157 Bài 23 Phương pháp phân tích Vibrio cholerae thực phẩm 163 Bài 24 Phương pháp phân tích Clostridium perfringens thực phẩm 175 Bài 25 Phương pháp phân tích vi sinh vật thực phẩm phương pháp PCR 180 Bài 26 Xác định nhanh vi sinh vật thực phẩm hệ thống Multitest API 20E 186 IN IG A L Thực tập Vi sinh vật học Phụ lục R O Các tiêu vi sinh vật sữa tươi tiệt trùng TCVN 7028:2002 192 Thường quy kỹ thuật định tính bán định lượng độc tố vi nấm aflatoxin 194 Thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc aspergillus flavus, aspergillus niger, aspergillus fumigatus thực phẩm 201 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7042:2002 Bia – quy định kỹ thuật Draught beer – Specification 206 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7041:2002 Đồ uống pha chế sẵn không cồn – quy định kỹ thuật Soft drinks – Specification 210 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7044:2002 Rượu mùi – quy định kỹ thuật Liqueur – Specification 214 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7043:2002 Rượu trắng – quy định kỹ thuật Distilled alcoholic beverages – specification 218 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7045:2002 Rượu vang – quy định kỹ thuật Wine – Specification 221 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7108:2002 Sản phẩm sữa bột dành cho trẻ đến 12 tháng tuổi – quy định kỹ thuật Dried milk for infants up-to 12 months age – Specification 224 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5538:2002 (Soát xét lần 1) Sữa bột – quy định kỹ thuật Milk powder – Specification 230 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7030:2002 Sữa chua – quy định kỹ thuật Yoghurt – Specification 235 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5539:2002 (Soát xét lần 1) Sữa đặc có đường – quy định kỹ thuật Sweetened condensed milk – Specification 240 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7029:2002 Sữa hoàn nguyên tiệt trùng – quy định kỹ thuật Sterilized reconstituted milk – Specification 244 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7028:2002 Sữa tươi tiệt trùng – quy định kỹ thuật Sterilized fresh milk – Specification 248 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7049:2002 Thịt chế biến có xử lý nhiệt – quy định kỹ thuật heat Treated processed meat – Specification 252 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7050:2002 Thịt chế biến không qua xử lý nhiệt - quy định kỹ thuật Non – heat treated processed meat – Specification 257 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7048:2002 Thịt hộp - quy định kỹ thuật Canned meat Specification 262 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7046 : 2002 Thịt tươi – quy định kỹ thuật Fresh meat Specification 266 IN IG A L Tài liệu tham thảo 272 Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm NHỮNG QUY TẮC AN TỒN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT Thao tác an toàn yêu cầu quan trọng thí nghiệm vi sinh vật Vi sinh vật có kích thước nhỏ bé mà mắt thường khơng nhìn thấy Trong q trình làm thí nghiệm, thường thao tác với số lượng lớn đậm đặc tế bào vi sinh vật Bên cạnh giống, lồi vi sinh vật có ích giống, lồi có khả gây bệnh có hại sức khỏe người Mặt khác, q trình thí nghiệm phải sử dụng nhiều loại hóa chất, có hóa chất có độc tính Chính thế, người làm thí nghiệm phịng thí nghiệm vi sinh vật cần tuân thủ quy tắc sau I NHỮNG QUY ĐỊNH CHUNG - Những người khơng có nhiệm vụ khơng vào phịng thí nghiệm O - Khi vào phịng thí nghiệm phải mặc áo blouse (cài khuy kín), cột tóc gọn gàng R - Khơng nói chuyện ồn ào, giữ gìn trật tự Khơng ăn uống, hút thuốc phịng kiểm nghiệm IG - Mang trang, găng tay thao tác với vi sinh vật hóa chất - Trên bàn thí nghiệm để vật dụng thí nghiệm, số ghi chép, giấy ghi chép Tất vật dụng cá nhân, áo khoác, túi xách, sách vở… phải để nơi quy định IN A - Trước sau kết thúc thí nghiệm, phải sát trùng mặt bàn hóa chất sát trùng cồn 70% dung dịch diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%) chuẩn bị sẵn lau khô giấy vệ sinh L - Cần ghi tên chủng, ngày tháng thí nghiệm, người làm thí nghiệm lên tất hộp petri, ống nghiệm… - Tuyệt đối không để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dính lên quần áo, sách dụng cụ cá nhân Đồng thời phải ý bảo vệ da quần áo khỏi bị dính hóa chất thuốc nhuộm - Cẩn thận thao tác với đèn cồn đèn bunsen Tắt lửa chưa có nhu cầu sử dụng sau thực xong thao tác Tuyệt đối không dùng đèn cồn để mồi lửa đèn cồn - Sử dụng bóp cao su thao tác ống hút định lượng (pipette), tuyệt đối không hút miệng - Không tự ý sử dụng trang thiết bị, dụng cụ phịng thí nghiệm chưa hướng dẫn cụ thể Sử dụng theo hướng dẫn, thận trọng, tránh làm đổ vỡ hư hỏng Thực tập Vi sinh vật học - Tất vật liệu bị nhiễm bẩn, môi trường chứa nhiễm vi sinh vật cần phải khử trùng trước vứt bỏ sử dụng lại Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần ngâm vào dung dịch diệt khuẩn (nước javel) trước rửa tái sử dụng - Kết thúc thí nghiệm phải vệ sinh thiết bị, dụng cụ sử dụng theo quy trình xếp vào nơi quy định - Rửa tay trước rời phịng thí nghiệm - Tất trường hợp tai nạn phải báo cáo cho cán hướng dẫn thí nghiệm để kịp thời xử lý II MỘT SỐ LƯU Ý VỚI SINH VIÊN NHẰM ĐẠT KẾT QUẢ TỐT TRONG THỰC HÀNH VI SINH VẬT Trước thực hành - Cần đọc trước nội dung tồn để hình dung khối lượng công việc làm - Hiểu rõ nguyên tắc, mục đích thí nghiệm O - Đọc cẩn thận cách tiến hành thí nghiệm R Trong thực hành - Ghi cẩn thận dặn giảng viên thao tác quy trình thực hành IG - Thực thí nghiệm theo hướng dẫn giảng viên IN - Trong q trình thí nghiệm có thao tác, cơng đoạn không rõ cần hỏi lại giảng viên hướng dẫn - Ghi chép cẩn thận ý quan trọng thí nghiệm kết thí nghiệm A Kết thúc thực hành L - Làm báo cáo thực hành theo yêu cầu mục V thí nghiệm theo yêu cầu giảng viên Tuyệt đối không dùng miệng để hút dung dịch vi sinh vật hóa chất !!! Viện Cơng nghệ sinh học & Thực phẩm Bài THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT I THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC o o Tủ sấy (vacuum oven): điều chỉnh nhiệt độ từ 60 C – 200 C, dùng để sấy khô, khử trùng loại dụng cụ chịu sức nóng khơ, chủ yếu dụng cụ thủy tinh, kim loại Tùy vào đối tượng cần khử khuẩn mà sấy chế độ nhiệt thời gian khác nhau, thường o o sấy 160 C giờ, 180 C 30 phút R O IN IG Hình 1.1 Tủ sấy A o o L 2.Tủ ấm (incubator or etuve): nhiệt độ từ 20 C – 60 C, có chế độ ổn định nhiệt độ, sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng phát triển chúng Tùy vào đối tượng nuôi cấy mà ủ nhiệt độ khác để vi sinh vật có o o thể phát triển tốt Ví dụ: coliform 30 C 24 – 48 giờ, E coli thích hợp 44 C 24 – 48 Tủ lạnh hay tủ mát (freezer): dùng bảo quản môi trường pha chế, giống vi khuẩn, chế phẩm sinh học (vaccin, huyết thanh, đĩa giấy kháng sinh…), hóa chất, thuốc thử dễ phân hủy nhiệt độ thường Nồi hấp ướt (autoclave): Thiết bị cấp nhiệt nước áp suất cao (hơi nước bão hòa áp suất cao), sử dụng để hấp khử trùng mơi trường, số ngun liệu dụng cụ thí nghiệm Tùy đối tượng mà sử dụng chế độ nhiệt độ áp suất o o thích hợp, thường dùng 121 C/1 atm 15 phút; 127 C/1.5 atm 30 phút với môi o trường đất; hay 117 C/0.8 atm 15 phút với môi trường chứa nhiều đường, môi trường sữa… Thực tập Vi sinh vật học 10 Bảng 1.1 Tương quan thể thích mơi trường thời gian hấp tiệt trùng 121oC Thể tích mơi trường ni cấy (ml) 25 50 100 250 500 1000 2000 4000 Thời gian hấp tiệt trùng tối thiểu (phút) 20 25 28 31 35 40 48 63 Bảng 1.2 Tương quan áp suất (chỉ số áp kế nồi hấp) nhiệt độ o O Chỉ số áp kế nồi áp 0,0 suất (atm) o 100 Nhiệt độ sôi nước ( C) Nhiệt độ sôi nước ( F) 212 0,2 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,5 2,0 105 110 112 114 116 117 119 121 127 134 221 230 234 237 241 243 246 250 261 273 R IN IG A L Hình 1.2 Nồi hấp cao áp (Autoclave) Cân phân tích điện tử (analytical balance): cân trọng lượng từ 100 µg – 200 g -4 -2 Độ xác 10 g Cân kỹ thuật (technical balance): độ xác 10 g Dùng cân hóa chất, mơi trường Trong q trình sử dụng, không đặt trọng lượng khoảng cân lên cân Thực tập Vi sinh vật học 178 Cấy ủ mẫu - Chọn hai nồng độ pha lỗng thích hợp Cho 10 ml dung dịch pha lỗng (mỗi nồng độ ống) vào ống nghiệm có chứa môi trường Wilson Blair cải tiến làm nguội 45oC Cho thêm ml dung dịch Na2SO3 giọt phèn sắt 5% Tiếp tục làm sau: - Lắc - Đun cách thủy 75oC, 15 phút - Làm đơng nhanh - Ủ 37oC bình kị khí thời gian 18-24 Đọc kết Đếm tất khuẩn lạc đặc trưng Clostridium perfringens (tròn, đen, có đường kính 3mm) Tính tốn kết O Số khuẩn lạc g mẫu trung bình cộng số khuẩn lạc nghi ngờ có hai ống nghiệm nuôi cấy (cùng nồng độ) nhân với hệ số pha loãng tương ứng chia cho 10 R IV NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Phèn sắt Na thiosulfat cần pha riêng rẽ bổ sung sau hấp tiệt trùng IG IN - Chủng Clostridium perfringens loại vi sinh vật nguy hiểm, cẩn thận trình thực hành Mang trang găng tay để tránh bị xâm nhiễm Các dung dịch vi sinh vật, dụng cụ môi trường nuôi cấy cần hấp tiệt trùng cẩn thận sau thí nghiệm L V BÁO CÁO THỰC TẬP A - Để kết phân tích xác, nên sử dụng mơi trường tổng hợp dạng đông khô cho tất bước thử nghiệm - Trình bày đặc tính sinh lý gây bệnh Clostridium perfringens - Trình bày quy trình phân tích Clostridium perfringens thực phẩm - Giải thích chế thử nghiệm sinh hóa sử dụng q trình phân tích xác định Clostridium perfringens QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM Tiêu chuẩn sử dụng: ISO 7937: 2004 Microbiology of food and animal feeding stuffsHorizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens - Colony count tecchnique Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 179 Mẫu Đồng mẫu Đồng 10g mẫu 90ml nước muối 0,85% Pha loãng mẫu Pha loãng mẫu thành nồng độ 10-2,10-3,10-4 Cấy mẫu Chọn nồng độ pha lỗng thích hợp cấy 10ml mẫu vào hai ống môi trường thạch Wilson Blair đun chảy làm nguội đến 50oC, bổ sung 0,5 ml Na2SO3 5% 0,25 ml FeSO4 5% Lắc trộn R O Đun cách thủy 75oC/15 phút IG Làm đông thạch nhanh IN Cho 1ml parafin lỏng vào ống thạch Ủ 37oC/18-24 A L Khẳng định Chọn khuẩn lạc điển hình (trịn, lồi, bờ đều, đen nhẵn, đường kính 2-4 mm) Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào mơi trường Motility Nitrate Ủ điều kiện kị khí, 37oC/18-24 Motility Nitrate Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào mơi trường Lactose gelatine Ủ điều kiện kị khí, 37oC/18-24 Lactose Gelatin Đặt ống nghiệm 5oC/1giờ Thực tập Vi sinh vật học 180 Bài 25 PHÂN TÍCH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) I NGUYÊN TẮC O Các phương pháp truyền thống phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm bao gồm bước nuôi cấy môi trường chọn lọc hàng loạt thử nghiệm hóa sinh để khẳng định có mặt loài gây bệnh định, thường kéo dài vài ngày đến vài tuần Trong năm vừa qua, phương pháp nhanh hơn, chuyên biệt nhằm phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm dựa nguyên tắc sinh học phân tử miễn dịch học phương pháp lai phân tử, PCR, ELISA… thiết lập PCR (Polymerase Chain Reaction) kỹ thuật ứng dụng phổ biến khắc phục nhược điểm phương pháp truyền thống nhờ khả phát nhanh đặc hiệu mầm bệnh Các nghiên cứu giới tập trung vào khẳng định khả sử dụng PCR phương pháp tiêu chuẩn để kiểm tra vệ sinh thực phẩm R PCR kỹ thuật nhằm tạo lượng lớn DNA mục tiêu ống nghiệm dựa vào chu kỳ nhiệt Kỹ thuật nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis phát minh vào năm 1985 Sự phân tích sản phẩm PCR điện di cho phép phát vi sinh vật mục tiêu dự so sánh với trình tự DNA đặc trưng vi sinh vật chuẩn Xét nghiệm kỹ thuật PCR thường có kết độ xác cao, tính đặc hiệu lớn Tuy nhiên, kết cịn tùy thuộc trình độ kỹ thuật viên, phương tiện máy móc làm việc việc quản lý chất lượng IN IG A II DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT Dụng cụ 10 Tên dụng cụ, thiết bị nhóm (3 sinh viên) Giá ống nghiệm Ống nghiệm ‫׎‬18 Bình tam giác 250 ml Cốc 100 ml Bình tia Pipette ml Pipette 10 ml Micropipette 100-1000 μl Đầu tuýp 1000 μl Ống Eppendorf 0,2; 0,5 ml; 1,5 ml chuyên dùng cho PCR L STT Đơn vị tính Số lượng Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái 15 1 1 10 Cái Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm STT 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Số lượng Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái 1 1 1 1 Cái Cái Cái Cái Cái IG 23 Đơn vị tính R 22 Tên dụng cụ, thiết bị nhóm (3 sinh viên) Dụng cụ dùng chung Nồi hấp cao áp Tủ cấy vô trùng Tủ sấy Máy dập mẫu Bình ủ kị khí Bếp đun cách thủy Bút đếm khuẩn lạc Máy PCR Máy ly tâm dùng cho ống Eppendorf 1,5 ml Máy vortex Thiết bị điện di ngang nguồn điện di có điện hoạt động từ 80 đến 150 volt Hộp đèn soi UV có kính lọc 302 mm Bộ chụp ảnh đèn UV O 21 181 Mơi trường, hóa chất a) Hóa chất IN A * Mồi: Gồm hai mồi invA1 invA2 thiết lập cách 520 bp gen invA có vai trị q trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật người Trình tự hai mồi sau: invA1: 5' - TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3' L invA2: 5' - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG - 3' Nồng độ mồi sử dụng phân tích pha lỗng thành pM đệm TE Ðệm TE có thành phần sau: 10 mM Tris-HCl (pH = 8), mM EDTA * Hỗn hợp dùng khuếch đại PCR 1,1x - Taq polymerase: 0,025 U/ml (1,25 U/50 ml) - Tris - HCl (pH = 8,8 nhiệt độ 25oC): 75 mM - Sunphat amon (NH4)2ư SO4: 20 nM - Tween 20: 0,01% (v/v) - dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP): 200 mM (mỗi loại) - Magiê clorua (MgCl2) 1,5 mM Thực tập Vi sinh vật học 182 - Tất thành phần pha chế nước cất lần bảo quản nhiệt độ C tháng Có thể bảo quản nhiệt độ - 20oC năm Không nên rã đông tái đông dung dịch pha chế nhiều lần o * Thang ADN Nên sử dụng thang đo phù hợp ước lượng đoạn khuếch đại 520 bp Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 520 bp biết trước làm thang đo phương pháp * Agarose Sử dụng kỹ thuật loại dùng để điện di ADN có kích thước nhỏ 1000 bp * Ðệm điện di TAE 1x - Tris: 4,84 g - Na2EDTA 0,5M, pH = 8,0: ml O - Axit axetic băng: 1,14 ml R - Nước cất cho đủ: 1000 ml * Ðệm tải mẫu 6x - Xanh bromphenon: 0,25 % - Na2EDTA: 20 mM A - Tris: 200 mM IN - Glyxerol: 30 % IG Nên pha chế thành dung dịch 10x (đậm đặc 10 lần), sử dụng pha loãng với nước thành dung dịch 1x L Các thành phần pha nước cất, bảo quản nhiệt độ 4oC * Thuốc nhuộm AND: dung dịch etyl bromua nồng độ 10 mg/ml b) Môi trường nuôi cấy vi sinh vật Dung dịch đệm peptone - Peptone (C5H10O5): 10,0 g - Natri clorua (NaCl): 5,0 g - Dinatri hyđro phosphat (Na2HPO4): 3,6 g - Kali dihydro phosphat (KH2PO4): 1,5 g - Nước cất: 1000 ml Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 183 Hòa tan thành phần nước cất, đun tan, phân phối vào bình chứa phù hợp Hấp khử trùng nhiệt độ 121oC 15 phút pH sau khử trùng 7,0 ± 0,2 25oC Nguyên liệu khác Mẫu thức ăn đường phố, thịt gà tươi sống, hải sản, trứng sản phẩm trứng, rau xà lách, thức ăn gia súc nhiễm vi sinh vật tự nhiên III TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM Lấy mẫu Cân xác 25 g mẫu (hoặc khối lượng xác tùy theo yêu cầu) cho vào bình tam giác bao PE vô trùng Tăng sinh R O Nhằm làm tăng số lượng Salmonella mẫu, tế bào bị suy yếu hay tổn thương phục hồi phát triển Giai đoạn tiến hành môi trường không chọn lọc nguyên tắc phần khối lượng mẫu bổ sung phần khối lượng môi trường tăng sinh Nếu lấy 25 g mẫu, phải bổ sung 225 g môi trường tăng sinh dung dịch peptone đệm Ủ mẫu có mơi trường tăng sinh nhiệt độ 37,0oC ± 1,0oC khoảng 18 IG Xử lý mẫu giải phóng ADN IN Giai đoạn nhằm thu nhận sinh khối sau tăng sinh, rửa môi trường sau ni cấy, phá vỡ tế bào để giải phóng ADN Cách xử lý sau: A - Lắc canh khuẩn tăng sinh Hút 0,5 ml vào ống eppendorf tích 1,5 ml, ly tâm với tốc độ 10 000 vòng/phút phút loại bỏ phần môi trường lỏng bên Rửa sinh khối bên với nước cất vô trùng tiếp tục ly tâm với chế độ để loại bỏ phần nước L - Huyền phù sinh khối ống với 0,5 ml nước cất vô trùng Ðun sôi cách thủy 10 phút Ly tâm huyền dịch sau đun với tốc độ 10 000 vòng/phút phút để lắng mảnh vỡ tế bào xuống đáy Phần dịch bên coi khuôn ADN để tiến hành phản ứng khuếch đại Khuếch đại Giai đoạn nhằm làm tăng số lượng đoạn ADN đích máy luân nhiệt (thermocycler) hai mồi đặc trưng Quá trình khuếch đại tiến hành khoảng 30 chu kỳ - Chuẩn bị ống khuếch đại Thực tập Vi sinh vật học 184 Hút 45 ml hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào ống nghiệm PCR tích 0,2 0,5 ml, thêm vào ml mồi invA1 invA2 có nồng độ pM ml mẫu khuôn ADN Tổng thể tích ống khuếch đại 50 ml Ðối chứng dương: thay dịch khuôn ADN mẫu dịch ADN Salmonella chuẩn biết Ðối chứng âm: thay dịch khuôn ADN mẫu nước cất vô trùng - Chương trình khuếch đại Các ống khuếch đại đặt vào máy luân nhiệt Chương trình khuếch đại sau: trì nhiệt độ 95oC phút để làm biến tính hồn tồn sợi ADN mẫu Tiếp theo 35 chu kỳ, chu kỳ có ba bước sau: 95oC/60 giây; 54oC/45 giây 72oC/60 giây Sau kết thúc 35 chu kỳ, mẫu giữ nhiệt độ 72oC 10 phút, sau giữ ổn định nhiệt độ 20oC điện di Ðiện di sản phẩm khuếch đại O - Chuẩn bị gel điện di agarose 1% R Gel agarose % pha đệm TAE 1x đun chảy hồn tồn đổ vào khay điện di có sẵn lược để tạo giếng Gel điện di phải có độ dày khoảng - mm Gel sau chuẩn bị ngâm chìm hồn tồn đệm TAE IG - Chuẩn bị dịch điện di Mẫu sau khuếch đại nhuộm với 10 ml đệm tải mẫu 6x trộn thật IN - Ðiện di A Một giếng gel điện di sử dụng cho thang ADN chuẩn hay mẫu đối chứng dương Nạp 10 ml dịch điện di chuẩn bị vào gel agarose Tiến hành điện di 60 phút hiệu điện 100 vôn - Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu L Nhuộm ADN, quan sát sản phẩm khuếch đại Pha dung dịch nhuộm ADN sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 lít nước, pha vào khay chứa có miệng rộng gel điện di - Nhuộm gel Ngâm gel điện di vào dung dịch nhuộm 10 phút Rửa gel nước khoảng - phút để loại bỏ phần etyl bromua dư - Quan sát, chụp hình Cho gel nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn quan sát vạch sáng đỏ ADN xuất gel Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 185 Ðọc giải thích kết Kết phân tích xem xét kết luận mẫu đối chứng dương tính có sản phẩm khuếch đại ADN với kích thước 520 bp mẫu đối chứng âm khơng có sản phẩm Mẫu kết luạn dương tính Salmonella có sản phẩm khuếch đại 520 bp gel Mẫu kết luận âm tính khơng có sản phẩm khuếch đại, hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khác 520 bp IV NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Mang trang găng tay cao su để tránh làm tạp nhiễm sản phẩm PCR - Khơng điều chỉnh ngồi khoảng thể tích cho phép hút sử dụng micropipette - Tuân thủ bước thao tác chuẩn bị phản ứng PCR vận hành máy luân nhiệt PCR R O - Phải dùng kính bảo vệ mắt quan sát sản phẩm điện di gel agarose đèn UV V BÁO CÁO THỰC TẬP IG - Trình bày nguyên tắc phương pháp PCR xác định vi sinh vật thực phẩm - Trình bày vai trị mồi xi, ngược phản ứng PCR IN - Giải thích phản ứng PCR nên tiến hành khoảng 35 chu kỳ? - Trình bày nguyên tắc phương pháp đọc điện di sản phẩm PCR A - Trình bày kết xác định Salmonella spp mẫu thực phẩm ban đầu phương pháp PCR L Thực tập Vi sinh vật học 186 Bài 26 XÁC ĐỊNH NHANH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM BẰNG HỆ THỐNG MULTITEST API 20E I NGUYÊN TẮC Những đặc điểm Gram, khả di động, trình ni cấy, hệ thống enzyme, đặc tính sinh hóa… vi sinh vật thường sử dụng cơng cụ để xác định vi sinh vật Tuy nhiên, để có đặc điểm cần sử dụng lượng lớn mơi trường hóa chất, ống nghiệm, đĩa petri môi trường nuôi cấy nhiều thời gian nuôi ủ Để làm giảm bớt yếu tố này, có số hệ thống multitest (API 20E, Enterotube II…) sử dụng Những multitest cho phép trình xác định số lượng lớn đối tượng vi sinh vật quan trọng với thời gian ngắn R O Multites API 20E hệ thống chuẩn gồm 22 test sinh hóa dùng để xác định loại vi khuẩn Gram âm thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae số nhóm vi khuẩn khác Tổng cộng có 127 taxa xác định hệ thống Hệ thống API 20E áp dụng phổ biến cho đối tượng vi khuẩn như: Escherichia coli, Proteus mirabilis, Shigella dysenteria, Salmonella typhi, Yersinia pestis IN IG A L Hình 26.1 Hệ thống API 20E cupule giếng Hình 26.2 Cấu trúc giếng vỉ API Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 187 Các test sinh hóa hệ thống API 20E môi trường nuôi cấy kiểm tra chứa dải giếng nhỏ bảng nhựa Phía giếng có phần khuyết gọi cupule Môi trường dạng đông khô làm ẩm cách bổ sung dịch huyền phù vi sinh vật nước muối sinh lý vào giếng sử dụng Sau gieo cấy vi sinh vật, dải giếng môi trường ủ 35-37oC thời gian 18-24 cho vi sinh vật hoạt động biến đổi chất Kết thử nghiệm đọc dựa vào thay đổi màu môi trường giếng dựa vào thay đổi màu bổ sung thuốc thử Các thử nghiệm âm tính hay dương tính cho điểm theo hướng dẫn Mỗi nhóm thử nghiệm tính điểm Có số mã nhóm thử nghiệm Quá trình xác định vi sinh vật thực thông qua việc tra cứu mã vào hệ thống mã API 20E Profile Recognition hay The API 20E Profile Index Booklet II DỤNG CỤ, MƠI TRƯỜNG VÀ HĨA CHấT Dụng cụ STT R IN IG - Dải hệ thống API 20E bioMérieux - Khay ủ gói bảo quản - Nước muối sinh lý 0,85% - Dung dịch McFarland No (BaSO4) - Thuốc thử Kovac Số lượng Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái Cái 15 1 1 1 L Mơi trường hóa chất Đơn vị tính A 12 13 14 15 16 O 10 11 Tên dụng cụ, thiết bị nhóm (3 sinh viên) Giá ống nghiệm Ống nghiệm ‫׎‬18 Bình tam giác 250 ml Cốc 100 ml Bình tia Pipette ml Pipette Pasteur Micropipette 100-1000 μl Đầu tuýp 1000 μl Que cấy vòng Đèn cồn Dụng cụ dùng chung Nồi hấp cao áp Tủ cấy vô trùng Tủ sấy Máy dập mẫu Tủ ấm Cái Cái Cái Cái Cái 1 1 Thực tập Vi sinh vật học 188 - Môi trường TSA - Dầu khống vơ trùng - Thuốc thử nitrite - Bột kẽm - H2O2 1,5% - Thuốc thử Barritt A (α-napthol) B (KOH 40%) - Thuốc thử oxidase test Những nguyên vật liệu khác - Giấy lọc Whatman số - Sách API 20E Quick Index Booklet III TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM O Gieo cấy vi sinh vật R - Dùng que cấy vịng vơ trùng lấy sinh khối vi khuẩn từ khuẩn lạc đặc trưng vi sinh vật cần xác định đĩa petri Trải lượng sinh khối thành vùng nhỏ giấy lọc Thêm vài giọt thuốc thử lên vết bôi vi khuẩn Quan sát thay đổi màu giấy lọc chỗ nhỏ thuốc thử để xác định kết thử nghiệm oxydase IG IN - Tiếp tục chuyển vòng que cấy đầy vi khuẩn vào ống nghiệm có ml nước muối sinh lý vô trùng Lắc ống nghiệm để tạo dịch huyền phù So sánh độ đục huyền phù với dung dịch McFarland No (BaSO4) Có thể thêm sinh khối vi khuẩn cần A - Dán nhãn với thông tin tên người thực hiện, ngày thực lên khay ủ Hút 5ml nước cất vô trùng nhỏ vào đáy khay ủ để giữ ẩm cho vỉ test trình ủ L - Lấy vỉ nhựa API khỏi túi gói, đặt vào khay ủ - Lắc ml dịch huyền phù vi khuẩn Dùng pipette hút dịch huyền phù vào nhỏ vào giếng khay sau: + Nghiêng khay ủ đựng vỉ API, đưa đầu pipette tì vào cạnh cupule Nhỏ đầy dịch vào giếng ONPG, TDA, IND, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA + Nhỏ lượng nhỏ dịch huyền phù vào giếng ADH, LDC, ODC, H2S, URE (những giếng có tên test vỉ gạch dưới) + Nhỏ dịch huyền phù đầy phần giếng cupule giếng CIT, VP GEL (những giếng có tên test vỉ đóng khung) - Sau nhỏ dịch huyền phù, giếng ADH, LDC, ODC, H2S, URE nhỏ đầy phần cupule dầu khoáng vơ trùng để tạo điều kiện kị khí Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 189 - Đậy nắp khay ủ ủ tủ ấm nhiệt độ 35oC thời gian 18-24 Nếu không đọc kịp kết thời gian sau 24 ủ, khay ủ với vỉ API giữ tủ lạnh nhiệt độ từ 2-8oC đọc kết - Cấy ria dịch huyền phù vi khuẩn lên đĩa petri môi trường TSA để kiểm tra độ dịch huyền phù Đọc kết - Sau thời gian ủ 18-24 giờ, ghi nhận kết (dựa vào biến đổi màu) tất thử nghiệm không cần bổ sung thuốc thử (không đọc kết thử nghiệm TDA, VIP IND) Ghi kết dương tính dấu (+) kết âm dấu (-) sau 24 vào bảng sau: Bảng 16.1 Bảng ghi nhận kết thử nghiệm hệ thống API 20E R O IN IG - Nếu thử nghiệm GLU âm tính (màu xanh dương hay xanh lục), không cần thêm thuốc thử Thử nghiệm glucose âm tính biểu thị vi khuẩn phân tích khơng thuộc nhóm Enterobacteriaceae Nếu thử nghiệm GLU dương tính (có màu vàng bọt khí), thêm thuốc thử nitrite A B vào giếng A Trong tất thử nghiệm, đọc kết sau nhỏ thuốc thử vào chờ khoảng thời gian phù hợp Ghi nhận kết thử nghiệm theo bảng sau nhỏ thuốc thử vào giếng sau: L - Nhỏ giọt ferric chloride 10% vào giếng TDA Đọc kết - Nhỏ giọt loại thuốc thử Barritt’s A B vào giếng VP Nên nhỏ Barritt’B trước Đọc kết sau 10 phút - Nhỏ giọt thuốc thử Kovac vào giếng IND Đọc kết sau phút - Kiểm tra hình thành bọt khí giếng GLU (âm tính dương tính) Nếu có bọt khí chứng tỏ có khử nitrate tạo thành khí nitơ - Nhỏ giọt loại thuốc thử nitrite vào giếng GLU Đọc kết sau 2-3 phút Nếu kết âm tính, thêm bột kẽm vào giếng Đọc kết sau 10 phút Nếu xuất màu hồng cam, khử nitrat không xảy (thử nghiệm âm tính) Nếu giữ ngun màu vàng, có hình thành khí nitơ (thử nghiệm dương tính) - Nhỏ giọt H2O2 vào cupule test MAN, INO SOR Đọc kết hình thành bọt khí hay khơng hình thành Thực tập Vi sinh vật học 190 Sau ghi nhận kết thử nghiệm, cộng điểm thử nghiệm dương tính nhóm Sẽ có số tương ứng với nhóm thử nghiệm Tra số vào bảng API 20E Quick Index Booklet để xác định vi sinh vật phân tích Bảng 26.2 Kết hệ thống API 20E dựa vào biến đổi màu mơi trường R O IN IG Ví dụ: kết API 20E E coli = 144 572 + - + - L + A - + + + Viện Công nghệ sinh học & Thực phẩm 191 IV NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Các loại thuốc thử dùng thử nghiệm chất độc, cần mang găng tay trang trình sử dụng - Chú ý thời gian ủ API 20E để đọc kết quả, không đọc kịp, cần giữ test API 20E nhiệt độ 2-8oC đến đọc kết - Sau đọc xong kết quả, phải hấp khử trùng test API 20E trước loại bỏ V BÁO CÁO THỰC TẬP - Trình bày nguyên tắc phương pháp xác định vi sinh vật hệ thống test API 20E - Xác định kết phân tích mẫu vi sinh vật - Mục đích việc thêm dầu khống số giếng API 20E? - Có thể dùng hệ thống API 20E để xác định loại vi khuẩn Gram (-), oxidase (+) không? R O IN IG A L Hình 26.3 Các bước thực xác định vi sinh vật API 20E R O L A IN IG View publication stats ... chúng vi sinh vật Vi sinh vật phân bố rộng rãi tự nhiên ảnh hưởng lớn đến đời sống người sinh vật khác Ngành khoa học nghiên cứu hoạt động sống vi sinh vật gọi Vi sinh vật học Vi sinh vật học... nhiều lĩnh vực khác nhau: vi khuẩn học, nấm học, tảo học, virus học hay y sinh vi sinh vật học, vi sinh vật học thú y, vi sinh công nghiệp, vi sinh nông nghiệp, vi sinh môi trường… Mỗi lĩnh... ứng dụng vi sinh vật Mục đích vi? ??c ni cấy - Phát có mặt vi sinh vật nguyên liệu vật phẩm cần nghiên cứu O - Tiến hành vi? ??c nhân giống vi sinh vật cách nhanh chóng - Bảo tồn giống vi sinh vật khiết