Nghiên Cứu Đặc Điểm Cấu Trúc Và Hoạt Tính Sinh Học Của Fucoidan Từ Một Số Loài Rong Nâu Việt Nam.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÙI VĂN NGUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - BÙI VĂN NGUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC HÀ NỘI – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - BÙI VĂN NGUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ MỘT SỐ LỒI RONG NÂU VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa học hợp chất thiên nhiên Mã số: 9440117 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Bùi Minh Lý PGS.TS Nguyễn Quyết Chiến Hà Nội – 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân hướng dẫn PGS.TS Bùi Minh Lý PGS.TS Nguyễn Quyết Chiến, có tham khảo thêm tài liệu đáng tin cậy, có nguồn gốc rõ ràng Các số liệu, kết luận án hoàn toàn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung luận án Tác giả luận án Bùi Văn Nguyên ii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Bùi Minh Lý PGS.TS Nguyễn Quyết Chiến, người thầy tâm huyết hướng dẫn tơi khoa học, gợi mở cho ý tưởng nghiên cứu chia sẻ nhiều vấn đề sống suốt thời gian làm luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn tới GS TS Phạm Quốc Long - Viện trưởng Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên, ban lãnh đạo Viện, phận đào tạo Viện tạo điều kiện nhiều cho tơi hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô, anh chị phụ trách Học Viện Khoa học Công nghệ, tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn tới UBND tỉnh Khánh Hòa, ban giám hiệu trường Đại học Khánh Hịa, Khoa KHTN Cơng nghệ, tạo điều kiện tốt để hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo viện, nhà khoa học, anh chị em bạn bè công tác Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện tốt để làm thực nghiệm ln động viên giúp đỡ để tơi hồn thành đề tài luận án Tôi xin chân thành cảm ơn tới nhà khoa học nhóm nghiên cứu PGS.TS Trần Thị Thanh Vân, PGS.TS Thành Thị Thu Thủy, GS.TSKH Anatolii I Usov PGS.TS Yoshiaki Yuguchi tạo điều kiện giúp đỡ hướng dẫn tơi q trình hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn đề tài hợp tác quốc tế với Liên Bang Nga mã số VAST.HTQT.Nga.02.15-16 VAST.HTQT.Nga.06.13-14, với Nhật Bản mã số VAST.HTQT.NHATBAN.02.13-15 tài trợ kinh phí giúp hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn tới TS Lê Như Hậu, Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang giúp đở trình thu thập mẫu rong nâu giám định tên khoa học Tôi xin gửi lời tri ân tới gia đình, bạn bè, người thân ln động viên tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu khoa học Xin chân thành cảm ơn! Tác giả Bùi Văn Nguyên iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ xi MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rong nâu 1.1.1 Giới thiệu rong biển 1.1.2 Giới thiệu Rong Nâu 1.1.2.1 Phân loại phân bố rong nâu giới 1.1.2.2 Phân loại phân bố rong nâu Việt Nam 1.1.3 Thành phần hóa học rong Nâu 14 1.1.3.1 Polysaccharide 14 1.1.3.2 Hợp chất phenolic 19 1.1.3.3 Hợp chất carotenoid 21 1.1.3.4 Hợp chất Terpenoid 22 1.1.3.5 Các hợp chát khác 25 1.2 Tổng quan Sulfated polysaccharide (Fucoidan) 26 1.2.1 Giới thiệu chung Fucoidan 26 1.2.2 Thành phần hóa học fucoidan số lồi rong nâu 26 1.2.3 Cấu trúc hóa học fucoidan 28 1.2.4 Tính chất hóa lý fucoidan 29 1.2.5 Hoạt tính sinh học ứng dụng fucoidan 30 1.2.5.1 Hoạt tính chống đơng tụ máu chống huyết khối 30 1.2.5.2 Hoạt tính chống virus 32 1.2.5.3 Hoạt tính kháng u điều hịa miễn dịch 33 1.2.5.4 Hoạt tính chống oxy hóa 35 1.2.5.5 Giảm lipid máu 36 iv 1.2.5.6 Kháng viêm 36 1.2.5.7 Chống lại bệnh gan 37 1.2.5.8 Hoạt tính kháng khuẩn 37 1.2.5.9 Tác dụng giảm lượng đường huyết máu 37 1.2.5.10 Các ứng dụng fucoidan 38 1.3 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam liên quan đến nội dung nghiên cứu luận án 39 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 39 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 44 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49 2.1 Đối tượng nghiên cứu 49 2.2 Phương pháp nghiên cứu 50 2.2.1 Phương pháp chiết tách phân đoạn fucoidan 51 2.2.1.1 Phương pháp tách chiết fucoidan 51 2.2.1.2 Phương pháp phân đoạn fucoidan 51 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu cấu trúc fucoidan 51 2.2.2.1 Phương pháp phân tích liên kết methyl hóa 51 2.2.2.2 Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) 53 2.2.2.3 Phương pháp phổ IR 53 2.2.2.4 Phương pháp phổ NMR 54 2.2.2.5 Phương pháp phổ MS 59 2.2.2.6 Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) 64 2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 66 2.2.3.1 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro 66 2.2.3.2 Phương pháp đánh giá khả ức chế phát triển khối tế bào ung thư thạch mềm 68 2.2.3.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống đơng tụ máu 68 Chương THỰC NGHIỆM 70 3.1 Thu thập xử lý rong 70 3.2 Chiết tách phân lập fucoidan từ rong nâu 71 3.3 Xác định thành phần cấu trúc fucoidan 77 v 3.3.1 Xác định hàm lượng tổng carbohydrate 77 3.3.2 Xác định thành phần monosaccharide 77 3.3.3 Xác định hàm lượng sulfate 78 3.3.4 Phương pháp khử sulfate 78 3.3.5 Xác định hàm lượng axít uronic 78 3.3.6 Phân tích liên kết methyl hóa 79 3.3.7 Thủy phân tạo oligosaccharide 79 3.3.8 Sắc ký thẩm thấu gel (GPC) 79 3.3.9 Phổ IR 80 3.3.10 Phổ NMR 80 3.3.11 Phổ ESI-MS/MS 80 3.3.12 Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) 80 3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học 81 3.4.1 Hoạt tính gây độc tế bào 81 3.4.2 Thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u ba chiều thạch mềm 82 3.4.3 Thử nghiệm hoạt tính chống đông tụ máu 83 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 85 4.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết tách fucoidan 85 4.2 Hàm lượng fucoidan số polysaccharide tan nước 06 loài rong nâu sinh trưởng biển Nha Trang, thành phần hóa học fucoidan thu 86 4.3 Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc fucoidan từ hai loài rong nâu S binderi S duplicatum 90 4.3.1 Nội dung kết nghiên cứu loài Sargassum binderi 90 4.3.2 Nội dung kết nghiên cứu loài Sargassum duplicatum 92 4.4 Nghiên cứu cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidan phân lập từ rong nâu Sargassum aquifolium 96 4.4.1 Chiết xuất làm fucoidan 96 4.4.2 Xác định cấu trúc fucoidan 100 4.4.2.1 Tách loại nhóm sulfat (Desulfation) 100 vi 4.4.2.2 Phổ NMR FSA phân đoạn sắc ký anion FSA 101 4.4.2.3 Phân tích liên kết methyl hóa (Methylation analysis) 104 4.4.2.4 Tách 1,0M-deS cột sắc ký trao đổi anion 106 4.4.2.5 Các đặc điểm cấu trúc deS-2 deS-3 107 4.4.2.6 Các đặc điểm cấu trúc deS-4 111 4.4.2.7 Các đặc điểm cấu trúc deS-6 115 4.4.2.8 Các đặc điểm cấu trúc deS-5 117 4.4.2.9 Nghiên cứu số đặc điểm cấu trúc phân đoạn FSA-1,5M phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp với phổ ESI-MS/MS 117 4.4.3 Đánh giá hoạt tính sinh học 124 4.4.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào 124 4.4.3.2 Hoạt tính chống khối u in vitro 124 4.4.3.3 Hoạt tính chống đơng tụ máu 126 4.5 Nghiên cứu cấu trúc hoạt tính gây độc tế bào fucoidan phân lập từ rong nâu Turbinaria decurrens 131 4.5.1 Chiết xuất, phân đoạn xác định thành phần fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens 131 4.5.2 Xác định cấu trúc FTD-2,0N phân lập từ rong nâu Turbinaria decurrens 135 4.5.3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào FTD-2,0M 142 4.6 Nghiên cứu kích thước hình dáng fucoidan phân lập từ rong nâu Việt Nam, phân tích liên hệ chúng với hoạt tính gây độc tế bào 144 4.6.1 Nghiên cứu kích thước hình dáng fucoidan phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ 144 4.6.2 Liên hệ đặc điểm cấu trúc mẫu fucoidan với hoạt tính gây đốc tế bào 151 KẾT LUẬN 156 KIẾN NGHỊ 159 CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 160 TÀI LIỆU THAM KHẢO 162 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Các phương pháp sắc ký CC Column Chromatography GC Gas Chromatography GC-MS Gas Chromatography - Mass Spectrometry GLC Gas Liquid Chromatography GPC Gel permeation chromatography HPLC High Performance Liquid Chromatography LC-MS Liquid Chromatography - Mass Spectrometry GC - FID Gas Chromatography – Flame Ionization Detector Các phương pháp phổ 13 C-NMR Carbon-13 NMR Spectroscopy H-NMR Proton NMR Spectroscopy COSY Correlation Spectroscopy ESI-MS HMBC ESI-MS HSQC IR MALDITOF/MS NMR NOESY Electron Spray Ionization Mass Spectrometry Heteronuclear Multiple Bond Correlation Electron Spray Ionization - Mass Spectrometry Heteronuclear Single Quantum Coherence Infrared Spectroscopy Time-of-flight mass spectrometry with matrix-assisted laser desorption/ionization Nuclear Magnetic Resonance Rgc Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Radius of gyration SAXS TOCSY Small-angle X-ray Scattering Total correlation spectroscopy Sắc ký cột thường Sắc ký khí Sắc ký khí - Phổ khối Sắc ký khí, pha tĩnh lỏng Sắc ký lọc gel Sắc ký lỏng cao áp Sắc ký lỏng cao áp - Phổ khối Sắc ký khí – Đầu dị ion hóa lửa Phổ CHTHN carbon 13 Phổ CHTHN proton Phổ tương tác hai chiều 1H1 H Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết Phổ hồng ngoại Phổ khối MALDI-TOF/MS Cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) Phổ NOESY Bán kính hồi chuyển, bán kính quay Tán xạ tia X góc nhỏ Phổ tương tác tồn phần viii Hoạt tính sinh học APTT Activated Partial Thromboplastin Time CS Hep-G2 HIV Cell Survival, Cell Viability Human hepatocellular carcinoma Human immunodeficiency virus IC50 Inhibitory Concentration 50% LU-1 RD Human lung adenocarcinoma Human Rhabdomyosarcoma Monosaccharide Fuc Fucose Fucf Fucofuranose Fucp Fucopyranose Gal Galactose Gluc Glucose GlucA Glucuronic Acid Man Mannose Xyl Xylose Hóa chất Cetavlon DMSO EtOAc EtOH MeOH TFA Hexadecyltrimethylammonium bromide, Cetrimonium bromide Dimethylsulfoxide Ethyl acetate Ethanol Methanol Trifluoroacetic acid Xét nghiệm APTT đánh giá chức đông máu Tế bào sống sót Ung thư gan người Virus gây suy giảm miễn dịch người Nồng độ ức chế 50% tăng trưởng đối tượng thử Ung thư biểu mô phổi Ung thư mô liên kết Đường fucose Fucofuranose Fucopyranose Đường galactose Đường glucose Axit glucuronic Đường mannose Đường xylose Hexadecyl trimethyl ammonium bromid Dimethylsulfoxid Ethyl acetat Ethanol Methanol Axit trifluoroacetic 91 đoạn F2 chiếm 45.7%, thấp phân đoạn F4 (2.5%), hai phân đoạn F1 F3 chiếm 17.2% 15.3% Bảng 4.3 Thành phần hóa học phân đoạn fucoidan từ Sargassum binderi Các phân đoạn Hiệu SO3 Thành phần monosaccharid trung tính suất (%) (tỉ lệ mol) (%) Rham Man Fuc Gal Xyl Glc F1-0.5 М NaCl 17,2 22,0 0,2 1,0 0,4 0,1 F2-1.0 М NaCl 45,7 28,3 0,1 1,0 0,3 0,05 F3-1.5 М NaCl 15,3 24,0 0,1 1,0 0,4 0,07 F4-2.0 М NaCl 2,5 28,3 0,2 1,0 0,2 0,07 Kết phân tích thành phần đường cho thấy, tất phân đoạn fucoidan rong nâu Sargassum binderi có hàm lượng fucose lớn, thứ hai hàm lượng galactose chứa hàm lượng nhỏ gốc đường mannose xylose, đặc biệt gốc đường rhamnose glucose khơng có mặt tất phân đoạn fucoidan loài rong Hàm lượng mannose lớn phân đoạn F1, F4 nhỏ hai phân đoạn F2 F3 Hàm lượng sulfate phân đoạn sắc ký không tăng lên đặn từ F1 đến F4 mà tăng dần từ phân đoạn F1 đến F2 dao động khoảng 22% - 28.3%, F3 đến F4 dao động khoảng 24%-28.3% Như vậy, phân đoạn fucoidan rong nâu Sargassum binderi với thành phần đường fucose galactose lượng lớn sulfat gọi galactofucan sulfat hóa Trong fucoidan số lồi rong nâu khác thuộc Fucales sống vùng ôn đới Fucus evanescens, Fucus vesiculosus thành phần chúng chứa fucose sulfat gọi fucan sulfat hóa [68,35] Phổ 13 C-NMR phân đoạn F2 tách từ rong nâu Sargassum binderi trình bày Hình 4.4 Phổ có nhiều tín hiệu mạnh vùng anomeric (99.7 - 103.18 ppm) vùng từ trường cao (15.40 ppm 16.16 ppm) tín hiệu điển hình gốc α-L-fucopyranoside Các tín hiệu vùng 67 -84 ppm nguyên tử C2 - C5 vịng pyranoid Các tín hiệu 61.5 ppm ứng với nhóm CH2OH gốc 92 β-D-galactopyranose tín hiệu 65.0 ppm nhóm CH2OR cho gốc O-6-β-D-galactopyranose Một số tín hiệu mạnh 173.7 - 174.6 ppm 20.92 ppm khẳng định diện nhóm O-acetyl Hình 4.4 Phổ 13C-NMR fucoidan phân đoạn F2 từ rong Sargassum binderi Phổ 1H-NMR F2 bao gồm vài tín hiệu mạnh vùng α-anomeric (5.09 - 5.23 ppm) vùng trường cao (1-1.5 ppm) Trong tín hiệu vùng 2.0 - 2.2 ppm xác định diện nhóm O-acetyl Đặc điểm cấu trúc fucoidan tách từ rong nâu Sargassum binderi Malaysia nghiên cứu công bố vào năm 2016 [84] 4.3.2 Nội dung kết nghiên cứu loài Sargassum duplicatum Fucoidan tổng FSDu rong nâu Sargassum duplicatum tách sắc ký trao đổi anion cột DEAE-cellulose (3,2 x 32 cm), rửa giải gradient với dung dịch NaCl từ 0,1M đến 2,0M thu lấy phân đoạn SDAuF1 (ứng với khoảng nồng độ NaCl 0,2M - 0,6M) SDAuF2 (ứng với khoảng nồng độ NaCl 1,0M - 1,4M) Quá trình sắc ký biểu diễn Hình 4.5 93 SDAuF SDAuF Hình 4.5 Phân đoạn fucoidan chiết từ rong Sargassum duplicatum Bảng 4.4 Thành phần hóa học phân đoạn fucoidan từ S duplicatum đoạn Hàm Phân fucoidan lượng SO42- Axit Thành (%)* uronic mol(%) (%)* Fuc Man Gal Xyl Glc (%)* phần monosaccharide, SDAuF1 40,7 32,3 12,71 40,2 3,1 35,7 0 SDAuF2 39,88 38,2 13,08 59,5 39,4 *: Hàm lượng tính theo khối lượng mẫu fucoidan Kết xác định thành phần hóa học (Bảng 4.4.) cho thấy phân đoạn SDAuF1 SDAuF2 có đường fucose galactose thành phần đường trung tính Fucose phân đoạn SDAuF2 cao (59,5 %) phân đoạn SDAuF1 (40 %), phân đoạn SDAuF2 khơng có xuất đường mannose Cả phân đoạn khơng có xuất đường glucose, phân đoạn SDAuF2 hàm lượng xylose chiếm lượng nhỏ Fucoidan tổng FSDu phân lập từ rong nâu S duplicatum với hiệu suất 2,28% theo phươn pháp Bilan cs Trên phổ hồng ngoại IR hình 4.6 FSDu xuất tín hiệu hấp thụ 1.244 cm-1 (vùng dao động đặc trưng liên kết S=O) Vùng tín hiệu đặc trưng cho liên kết C – O – S 800-845 cm-1 rõ 94 Hình 4.6 Phổ IR phân đoạn fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum duplicatum Giống nhiều fucoidan chiết xuất từ rong nâu khác giới, fucoidan FSDu từ rong nâu S duplicatum có phổ 1H-NMR phức tạp có nhiều pic chồng chất lên (Hình 4.7.) Tuy nhiên phổ 1H-NMR có tín hiệu cộng hưởng đặc trưng giúp cho việc nhận biết fucoidan Đó tín hiệu xuất vùng proton anomer (5,0 – 5,5 pm) tín hiệu vùng trường cao (1,2 - 1,5 ppm) nhóm CH3 vịng α-L-Fucopyranose Trên phổ 1H-NMR fucoidan từ rong nâu S duplicatum xuất tín hiệu đặc trưng giúp ta nhận biết fucoidan Đó tín hiệu vùng 1,2 1,4 ppm (nhóm methyl fucose) 5,1-5,3 ppm (H-anomer gốc →3)-α-LFucp(1) Các tín hiệu 5,3 ppm 3,5 ppm đặc trưng cho H-1 H-6 gốc βD-galactose Ngồi tín hiệu 2,1 - 2,3 ppm xác nhận có mặt nhóm Oacetyl phân tử fucoidan Hình 4.7 Phổ 1H-NMR fucoidan FSDu chiết từ rong nâu S duplicatum 95 Trong cơng trình nghiên cứu độc lập với luận án này, cấu trúc xác fucoidan FSDu xác định bới Usoltseva cộng thuộc Viện Hàn lâm khoa học Nga Viễn đơng [113] Theo fucoidan galactofucan sulfat hóa acetyl hóa FSDu có cấu trúc phân nhánh phức tạp làm cho phổ NMR khó giải thích Mạch cấu tạo chủ yếu gốc 4)-α-L-Fuc-(1 β-D-Gal luân phiên liên kết với Mạch nhánh liên kết với O-6 galactose cấu tạo gốc fucose có liên kết mạch O-3 có nhóm sulfat vị trí O-2 O-4 Mạch nhánh có đến gốc đường nhiều Kết luận chung cho nội dung nghiên cứu 4.2 4.3 nhằm lựa chọn đối tượng rong nâu để nghiên cứu sâu cấu trúc hoạt tính:  Kết phân tích fucoidan thành phần polysaccharide tan nước khác fucoidan loài rong thuộc chi rong khác khác nhau, loài rong thuộc chi rong hay loài rong khác thành phần tỉ lệ mol gốc đường đơn Điều cho thấy thành phần đặc điểm cấu trúc fucoidan vô phức tạp Tuy nhiên, fucoidan loài rong có đặc điểm chung bên cạnh hàm lượng sulfat cao, hai đường fucose galactose chiếm hàm lượng lớn so với gốc đường khác, với đặc điểm chúng gọi galactofucan sulfat hóa Theo tài liệu cơng bố, fucoidan rong nâu nói chung galactofucan sulfat hóa nói riêng sở hữu phổ hoạt tính sinh học rộng đa dạng hoạt tính kháng ung thư, kháng đơng tụ máu, kháng vi rút, [95]  Các fucoidan tách chiết phân lập từ loài rong nâu Sargassum feldmannii, Sargassum duplicatum, Sargassum denticarpum Sargassum binderi fucogalactan sulfat hóa chứa nhóm este sulfat nhóm axít uronic, thành phần đường fucose galactose, với lượng nhỏ đường đơn mannose, xylose glucose Cấu trúc fucoidan tách chiết từ rong nâu Sargassum duplicatum Sargassum binderi nghiên cứu kỹ lưỡng [84,113] 96  Sau nghiên cứu thành phần hóa học fucoidan từ số lồi rong nâu chúng tơi chọn đại diện chi Sargassum, Turbinaria loài đại diện để nghiên cứu sâu cấu trúc hoạt tính sinh học Các lồi bao gồm Sargassum aquifolium Turbinaria decurrens Các loài loài rong nâu tương đối phổ biến biển Việt Nam nói chung vịnh Nha Trang nói riêng  Đại diện cho chi rong nâu Turbinaria chúng tơi chọn lồi rong nâu Turbinaria decurrens lồi chưa có nhà khoa học nghiên cứu cấu trúc hoàn thiện chúng  Đại diện cho chi Sargassum chúng tơi chọn lồi rong nâu Sargassum aquifolium lồi rong nâu chưa nghiên cứu Việt Nam giới Mặt khác fucoidan có thêm thành phần cấu tạo axít uronic Điều hứa hẹn khả tìm dạng cấu trúc fucoidan có tính cao 4.4 Nghiên cứu cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidan phân lập từ rong nâu Sargassum aquifolium 4.4.1 Chiết xuất làm fucoidan Đối tượng nghiên cứu phần loài rong nâu Sargassum aquifolium thu hoạch vào tháng năm 2015 biển Nha Trang Mục tiêu nghiên cứu xác định hàm lượng fucoidan tổng sinh khối, đặc trưng hóa lý, đặc điểm cấu trúc, hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính chống đơng máu phân đoạn thu phương pháp sắc ký trao đổi anion Các kết nghiên cứu trước cho thấy, fucoidan từ lồi tảo biển thuộc chi Sargassum có cấu trúc đặc biệt phức tạp Chúng thường cấu tạo từ nhiều thành phần đường đơn đường đơn (sulfate, acetate) khác nhau, hình thành nên cấu trúc phân nhánh khơng theo trình tự định Vì việc nghiên cứu cấu trúc loại fucoidan địi hỏi phải có kết hợp khéo léo phương pháp phổ đại với phương pháp sắc ký phương pháp chuyển hóa hóa học Các phương pháp tách fucoidan thành phân đoạn cột trao đổi anion, phương pháp tách loại sulfat (desulfation), phương pháp phân tích liên kết methyl hóa (methylation analysis, gọi tắt phân tích methyl hóa) cho phép thu phân đoạn đồng hơn, đơn giản hơn, phù hợp với việc xác định cấu trúc phương pháp phổ khối lượng 97 cộng hưởng từ hạt nhân Vì phần này, nội dung nghiên cứu cụ thể bao gồm:  Chiết xuất tinh fucoidan tổng (ký hiệu FSA), xác định đặc trưng hóa, lý  Tách FSA thành phân đoạn (ký hiệu FSA-0,5M, FSA-1,0M, FSA-1,5M, FSA-2,0M) có hàm lượng sulfat tăng dần phương pháp sắc ký trao đổi anion, khảo sát sản phẩm thu  Thực hiên phản ứng tách loại sulfat phân đoạn FSA (ký hiệu 1,0M-deS, 1,5M-deS, 2,0M-deS) , khảo sát sản phẩm thu  Tách sản phẩm 1,0M-deS thành phân đoạn có hàm lượng uronic tăng dần phương pháp sắc ký trao đổi anion, khảo sát sản phẩm thu  Thực phép phân tích methyl hóa số sản phẩm chọn lọc  Xác định đặc điểm cấu trúc FSA sản phẩm cách phân tích tổng hợp kiện thu  Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào, chống khối u chống đơng máu Trình tự thực nội dung chiết xuất, tinh sạch, phân đoạn chuyển hóa FSA trình bày khái quát Hình 4.8 Hình 4.8 Sơ đồ chiết xuất, phân lập chuyển hóa fucoidan S aquifolium 98 Fucoidan tổng FSA rong nâu S aquifolium chiết xuất tinh chế theo qui trình hình 4.8 Qui trình sử dụng nước nóng làm dung mơi chiết ethanol làm tác nhân kết tủa Các bước qui trình tiến hành sau: Bột khô rong nâu S aquifolium (100 g) chiết với hỗn hợp dung môi gồm ethanol, aceton chloroform để loại chất béo, chất mầu chất có KLPT thấp khác Nguyên liệu loại chất béo chiết với L nước 800C Các polysaccharide tan dung dịch kết tủa cách thêm L ethanol 99,0% Tủa hịa tan HCl lỗng (pH 1,0) Sau ly tâm, phần dung dịch trung hịa NaHCO3, thẩm tách đơng cơ, cho fucoidan tổng FSA dạng muối natri với hiệu suất 3,7% tính theo ngun liệu khơ Kết phân tích thành phần cấu tạo FSA (Bảng 4.5) cho thấy, FSA có thành phần fucose (9.2%), galactose (8.5%), axit uronic (12.6%) sulfat (22.9%) Các đường đơn trung tính cịn lại gồm xylose (2.2%), glucose (2.2%) mannose (2.0%) có hàm lượng nhỏ rõ rệt Bảng 4.5 Hiệu suất thành phần (%) FSA phân đoạn fucoidan thu sau sắc ký trao đổi anion Fucoidan H% FSA Fuc,% Xyl,% Man a,% Glc,% Gal,% UA,% SO3Na,% 9.2 2.2 2.0 2.2 8.5 12.6 22.9 FSA-0.5M 4.7b 4.5 4.9 4.3 6.7 12.0 27.9 5.9 FSA-1.0M 21.9 b 15.9 5.7 3.5 2.2 11.3 13.6 21.8 FSA-1.5M 9.8 b 19.2 4.6 2.2 1.7 25.5 5.3 29.2 FSA-2.0M 2.3 b 31.2 2.9 1.0 0.8 17.3 1.8 31.5 a Giá trị mannose thấp thực tế thủy phân liên kết glucuronosid khơng hồn tồn b % FSA Phương pháp sắc ký lọc gel GPC sử dụng để xác định phân bố theo KLPT polymer thành phần FSA xác định KLPT trung bình FSA Đồ thị sắc ký GPC thu (Hình 4.9) gồm peak chứng tỏ FSA có độ cao Kết tính tốn cho thấy FSA có khối lượng phân tử trung bình 110 kDa Chỉ số đa phân tán PI = Mw/Mn = 2,15 cho thấy mức độ phân tán khối lượng phân tử polysaccharide không lớn 99 Khối lượng phân tử (D) Hình 4.9 Sắc ký đồ GPC fucoidan FSA từ rong nâu Sargassum aquifolium Tách phân đoạn FSA cột sắc ký trao đổi anion DEAE-Sephacel (Pharmacia): Hình 4.10 Các phân đoạn fucoidan từ rong nâu Sargassum aquifolium Tương tự fucoidan khác, FSA hỗn hợp nhiều polysaccharide anionic khác thành phần cấu tạo mật độ điện tích, chúng tách thành phân đoạn có tính chất đồng phương pháp sắc ký trao đổi ion Cụ thể FSA tách thành phân đoạn có hàm lượng sulfate tăng dần cột sắc ký trao đổi anion sau: 100 Mẫu FSA (2 g) hòa tan 100 mL nước cất Dung dịch ly tâm để loại bỏ vẩn đục nạp lên cột DEAE-Sephacel (Pharmacia) dạng Cl, rửa giải với dung dịch NaCl nước có nồng độ tăng dần (0,5 M, 1,0 M, 1,5 M, 2,0 M) Mỗi lần rửa giải tiến hành đầu khơng cịn phản ứng dương tính với thuốc thử carbohydrat (thuốc thử phenol / H2SO4 đậm đặc [94]) Các phân đoạn sắc ký đem thẩm tách đông khô Kết sắc ký biểu diễn dạng đồ thị Hình 4.10 Hiệu suất thành phần phân đoạn (FSA-0,5M, FSA-1,0M, FSA-1,5M, FSA-2,0M) trình bày Bảng 4.5 Kết phân tích thành phần phân đoạn sắc ký (Bảng 4.5.) cho thấy:  FSA hỗn hợp không đồng polysaccharide có đặc trưng thành phần cấu tạo khác  Hàm lượng sulfat phân đoạn tăng dần lên với nồng độ dung dịch muối rửa giải, hàm lượng uronic acid giảm dần  Phân đoạn FSA-0.5M (4,7% tính theo FSA) có hàm lượng uronic acid glucose cao giải thích diện tạp chất mẫu alginat laminaran  Phân đoạn FSA-1.0M (21,9% tính theo FSA) có thành phần đường đơn đặc biệt phức tạp với có mặt đáng kể fucose, galactose, xylose mannose, ngồi cịn thêm lượng lớn nhóm sulfat axit uronic  Phân đoạn FSA-1.5M (9,8% tính theo FSA) cấu tạo chủ yếu từ thành phần fucose, galactose sulfat Các thành phần khác có hàm lượng nhỏ  Phân đoạn FSA-2M (2,3% tính theo FSA) có thành phần cấu tạo đơn giản nhất, gần gồm fucose, galactose sulfat Tuy nhiên hàm lượng FSA lại nhỏ 4.4.2 Xác định cấu trúc fucoidan 4.4.2.1 Tách loại nhóm sulfat (Desulfation) Để tạo thuận lợi cho việc nghiên cứu cấu trúc phương pháp phổ, phân đoạn fucoidan FSA-1,0M FSA-1,5 tiếp tục đơn giản hóa cấu trúc cách loại bỏ tất nhóm sulfat gắn với khung đường Phản ứng tách loại sulfat phân đoạn fucoidan FSA-1,0M FSA-1,5 thực cách gia nhiệt muối pyridinium chúng hỗn hợp 101 dung môi DMSO-MeOH theo qui trình thơng dụng mơ tả Usov cs (1998) [114] Trong q trình phản ứng chúng tơi quan sát thấy có biểu thối biến polysaccharid chia cắt phần liên kết fucosidic không bền Sản phẩm phản ứng làm phương pháp thẩm tách đông khô Kết thu sản phẩm tách loại sulfat FSA-1,0M 1,0M-deS với hiệu suất cao, đạt 56,6% Hiệu suất thu 1,5M-deS đạt 44,0% Kết xác định thành phần sản phẩm (Bảng 4.6) cho thấy 1,0MdeS chứa lượng vết sulfat, thành phần đường đơn tăng lên mong đợi, nhiên hàm lượng tương đối fucose lại giảm rõ rệt Nguyên nhân xảy phản ứng chia cắt phần liên kết glycosid yếu fucose Bảng 4.6 Thành phần (%) fucoidan tách loại sulfat 1,0M-deS 1,5MdeS so sánh với fucoidan mẹ chúng (FSA-1,0M FSA-1,5M) Fucoidan H% Fuc Xyl Man Glc Gal Uronic SO3Na acid FSA-1.0M 21.9b 15.9 5.9 3.5 2.2 11.3 13.6 21.8 8.1 4.0 7.8 4.3 14.0 30.6 2.8 19.2 4.6 2.2 1.7 25.5 5.3 29.2 12.8 5.3 2.7 1.8 31.6 10.4 4.1 1.0MdeS FSA-1.5M 1.5MdeS b 9.8b % FSA 4.4.2.2 Phổ NMR FSA phân đoạn sắc ký anion FSA Phổ NMR cung cấp thơng tin q giá cấu trúc polysaccharide, việc áp dụng phương pháp CHTHN fucoidan chiết xuất từ tảo biển bị hạn chế đa dạng thành phần phân tử chúng [7] Thực tế có số cơng bố kết giải trực tiếp cấu trúc fucoidan tự nhiên chưa bị biến đổi kỹ thuật NMR [31] Cách tiếp cận thực tế kết hợp phép phân tích CHTHN hóa học để xác định yếu tố cấu trúc polysaccharide tự nhiên polysaccharide tách loại sulfate 102 Hình 4.11 Trích đoạn phổ 13C-NMR FSA-2,0M Riêng trường hợp FSA phân đoạn sắc ký trao đổi anion nó, phổ NMR q phức tạp (Hình 4.11, 4.12, 4.13 phụ lục), sử dụng trực tiếp để giải cấu trúc Ngay phân đoạn FSA-2.0M (một galactofucan sulfate hóa) có thành phần đơn giản nhất, phổ 13C-NMR tối thiểu sáu tín hiệu vùng C-anomer 105-95 ppm số lượng tín hiệu C-methyl gốc fucose vùng 20-17 ppm (Hình 4.11) Kết hợp với việc tín hiệu ứng với nhóm CH2OH tự galactose vắng mặt, kiện cho thấy FSA-2.0M có cấu trúc phân nhánh khơng có qui luật, mức độ phân nhánh cao, nhóm sulfate gắn với nhiều vị trí khác nhau, đường đơn gắn kết với theo nhiều kiểu khác Phù hợp với dự đoán từ thành phần cấu tạo đa dạng, phổ 13C-NMR phân đoạn FSA-1.5M cịn phức tạp (Hình 4.12) Cụ thể phổ xuất nhiều tín hiệu vùng C-anomer Một số tín hiệu xuất vùng CH2OH khơng 63-61 ppm Trên phổ NMR phân đoạn FSA-1.0M (Hình 4.13) xuất cụm tín hiệu vùng 17 ppm ứng với nhóm methyl gốc fucose Tại vùng C-anomer (110 - 95 ppm) xuất nhiều tín hiệu với cường độ gần tương đương chứng tỏ có mặt nhiều loại đường nhiều kiểu liên kết glycosid mẫu nghiên cứu Trong phổ xuất tín hiệu nhóm CH2OH 103 galatose không vùng 63-61 ppm nhóm cacboxyl axit uronic 175,6 ppm Hình 4.12 Trích đoạn phổ 13C-NMR FSA-1,5M Tải FULL (191 trang): https://bit.ly/3YnqYCV Dự phịng: fb.com/TaiHo123doc.net Hình 4.13 Trích đoạn phổ 13C-NMR FSA-1,0M 104 Phổ 1H-NMR FSA tất phân đoạn sắc ký không tách bạch, khơng thể áp dụng kỹ thuật HMBC để gán đặc điểm cấu trúc cho tín Tải FULL (191 trang): https://bit.ly/3YnqYCV Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net hiệu 4.4.2.3 Phân tích liên kết methyl hóa (Methylation analysis) Các fucoidan phân đoạn FSA-1.0M, FSA-1.5M sản phẩm tách loại sulfate 1.0M-deS, 1,5M-deS chúng nghiên cứu tiếp với phương pháp phân tích liên kết methyl hóa Phương pháp bao gồm q trình methyl hóa fucoidan MeI với xúc tác NaOH dung môi DMSO, thủy phân chúng thành monomer, khử hóa monomer thành alditol, acetat hóa alditol thành alditol acetat methyl hóa phần mô tả sơ đồ phản ứng Hình 2.2 Phân tích sản phẩm thu phương pháp GCMS cho phép rút kết luận thành phần đường đơn vị trí liên kết chúng chuỗi mạch polysaccharide [12] Kết phân tích cho thấy có dẫn xuất xylose, dẫn xuất fucose 16 dẫn xuất hexose (manose galactose) phát Thành phần chúng đối tượng nghiên cứu trình bày Bảng 4.7 Bảng 4.7 Kết phân tích liên kết methyl hóa Vị trí nhóm О- Suy diễn vị trí Me trong: nhóm FSA-1.0M 1.0MdeS, FSA- 1.5MdeS, , mol% mol% 1.5M , mol% mol% Xyl: 2,3,4 Xylp→ 10 2,4 →3Xylp→ - tr tr 3* 2,3(3,4) Fuc: 2,3,5 Fucf→ 1 2,3,4 Fucp→ 14 2,3 →4(5)Fucp(f)→ 6 3,5 →2Fucf→ - - - 2,4 →3Fucp→ 6 3** →3,4(5)Fucp(f)→ 11 105 →2,4(5)Fucp(f)→ 7*** - →2,3Fucp→ - + - Fuc →2,3,4Fuc→ - - 2,3,4,6-Man Manp→ tr tr 2,3,4,6-Gal Galp→ 12 3,4,6 →2Hexp→ - - - 2,3,6 →4Hexp→ 10 15 2,3,6 →4Hexp→ 2,4,6 →3Hexp→ - 2,3,4 →6Hexp→ 21 2,6 →3,4Hexp→ - 4,6 →2,3Hexp→ 3 - tr Hex: 3,6+4,6 3,6 →2,4Hexp→ 3 tr 2,3 →4,6Hexp→ 2 2,4 →3,6Hexp→ 10 - - 3,4+2,4 →3,4,6Hexp→ tr →2,3,6Hexp→ - →2,4,6Hexp→ - 10 3(4) - 3(4) 2 Gal - Các kết phân tích trình bày Bảng 4.7 cho thấy:  Có nhiều fucitol methyl hóa có nguồn gốc từ gốc fucofuranose Đây điểm đặc biệt trước có trường hợp tìm thấy có mặt lượng đáng kể fucofuranose lồi Chordaria flagelliformis [8]  Các polysaccharide sulfate hóa bao gồm chủ yếu gốc fucose hai, chí đến ba lần Như vậy, nằm chuỗi mạch thẳng chúng phải gắn với nhóm sulfate mạch nhánh 5360151 ... án ? ?Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidan từ số lồi rong nâu Việt Nam” Mục tiêu nghiên cứu luận án là: Nghiên cứu phân lập, xác định đặc điểm cấu trúc thử nghiệm hoạt tính sinh. .. nội dung nghiên cứu luận án bao gồm: Nghiên cứu sàng lọc số loài rong nâu để chọn đối tượng nghiên cứu sâu cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidan Nghiên cứu sâu cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidan. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - BÙI VĂN NGUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ MỘT SỐ