Luận văn thạc sĩ nghiên cứu chuyển cấu trúc rnai vào giống đậu tương dt84 phục vụ tạo dòng cây chuyển gen kháng soybean mosaic virus

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC N NG Đ N T N TR TƯ NG T G N RN TẠ NG LU N ĂN T Ạ N G NG NG N R Ĩ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – / 2015 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NG NG G T N NG Đ N N TR RN TƯ NG T NG N NG TẠ NG N R Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LU N VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC N ọ : GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên – 5/2015 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấ đ Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ đậu (Fabaceae), công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế hàm lượng dinh dưỡng cao, lại dễ trồng Ngoài trồng đậu tương cịn có tác dụng cải tạo đất nhằm tăng suất giống trồng khác Ở Việt Nam, đậu tương trồng vùng nơng nghiệp nước, 65% miền Bắc 35% miền Nam Hiện suất sản lượng đậu tương thấp phải nhập từ nước khác để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng làm thức ăn cho gia súc [53] Bên cạnh yếu tố hạn hán, kĩ thuật canh tác ngun nhân bệnh trùng, vi khuẩn virus gây ảnh hưởng không nhỏ đến suất, chất lượng đậu tương Hiện người ta xác định khoảng 30 loại bệnh hại đậu tương, có bệnh nhiễm virus gây tổn thất lớn cho ngành sản xuất đậu tương [13] Bệnh khảm đậu tương bệnh hại xuất phổ biến đậu tương Soybean mosaic virus (SMV) thuộc nhóm Potyvirus gây Đậu tương bị nhiễm SMV thời điểm trước hoa suất giảm tới 40% 91% hạt đậu thu có vết lốm đốm, chất lượng [35] SMV lan truyền quần thể đậu tương rệp, học Hiện nay, biện pháp thường sử dụng để ngăn chặn lan truyền SMV có tính chất phịng bệnh mà khơng thể chống lại triệt để Tuy nhiên, nhờ ứng dụng kỹ thuật RNA interference (RNAi) người ta tạo trồng có khả kháng lại bệnh virus cách đưa ch nh gen virus gây bệnh vào hệ gen chủ Theo hướng nghiên cứu này, nhiều giống trồng chuyển gen kháng loại bệnh virus khác tạo ra, đậu chuyển gen kháng virus BGMV (bean golden mosaic virus), thuốc chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc (TMV) Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn Xuất phát từ l trên, lựa chọn đề tài “Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng chuyển gen kháng Soybean mosaic virus” ục t ê c u Tạo dòng chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV giống đậu tương DT84 Nộ du ê c u Nghiên cứu lây nhiễm A tumefaciens mang cấu trúc RNAi vào mô nách mầm hạt chín giống đậu tương DT84 Tái sinh in vitro, chọn lọc tạo dòng đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi; Phân tích có mặt gen chuyển dòng chuyển gen kỹ thuật PCR Xác định hiệu suất chuyển gen Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn ươ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 C đậu tươ 1.1.1 iá tr dinh dư ng c a đậu tương Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình khoảng 38-40%, lipid từ 18-20%, giàu vitamin muối khoáng Đậu tương loại hạt mà giá trị đánh giá đồng thời protein lipid Protein đậu tương có phẩm chất tốt loại protein thực vật Hàm lượng protein cao cá, thịt cao gấp hai lần hàm lượng protein có loại đậu đỗ khác [14] Hàm lượng axit amin có chứa lưu huỳnh methionin, sistein,… đậu tương gần với hàm lượng chất trứng Hàm lượng cazein, đặc biệt lizin cao, gần gấp rưỡi trứng Vì mà nói giá trị protein đậu tương cao nói hàm lượng lớn đầy đủ cân đối loại axit amin cần thiết Protein đậu tương dễ tiêu hóa thịt khơng có thành phần tạo nên cholesteron Khơng có dạng axit uric… Ngày nay, người ta biết thêm có chứa chất lexithin, có tác dụng làm cho thể trẻ lâu, sung sức, làm tăng thêm tr nhớ tái sinh mô, làm cứng xương tăng sức đề kháng thể Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao loại đậu đỗ khác nên coi cung cấp dầu thực vật Hiện nước có mức sống cao người ta lại ưa chuộng dầu thực vật mỡ động vật Lipid đậu tương chứa tỷ lệ cao axit béo chưa no có hệ số đồng hóa cao, mùi vị thơm ngon Dùng dầu đậu tương thay mỡ động vật tránh xơ vữa động mạch [14] Trong đậu tương cịn có nhiều loại vitamin, đặc biệt hàm lượng vitamin B1 B2, ngồi cịn có loại vitamin PP, A, E, K, D, C… Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn loại muối khống khác [14] Do mà từ hạt đậu tương người ta chế biến 600 sản phẩm khác nhau, có 300 loại thức ăn phương pháp cổ truyền, thủ công đại dạng tươi, khô, lên men… làm giá, sữa đậu nành, xì dầu… sản phẩm cao cấp đậu tương, socola- đậu tương, bánh kẹo, pate, thịt nhân tạo… nước ta, từ hàng ngàn năm đậu tương cung cấp phần nhu cầu chất đạm cho người gia súc, thơng qua ăn cổ truyền chế biến từ đậu tương, phần tạo cân dinh dưỡng phẩn thức ăn cho người dân Đậu tương chế biến thành giò, chả cho người ăn chay Đậu tương vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt hạt đậu tương đen, có tác dụng tốt cho tim mạch, gan, thận, dày ruột, làm thức ăn tốt cho người bị bệnh đái tháo đường, thấp khớp, ốm dậy lao động sức Các chất lexithin cazein có đậu tương dùng riêng phối hợp để làm thuốc bổ dưỡng Bột đậu tương sau ép lấy dầu, bã dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn tinh hỗn hợp giàu đạm để nuôi gia súc, gia cầm theo hướng cơng nghiệp Thân đậu tương dùng làm thức ăn gia súc gia cầm tốt Ở nhiều nước phát triển người ta dùng đậu tương vào ngành công nghiệp khác chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn ngành hàng khơng Đậu tương cịn có khả t ch lũy chất đạm khí trời để tự túc làm giàu đạm cho đất nhờ cộng sinh vi khuẩn nốt sần rễ Trong điều kiện thuận lợi, vi khuẩn nốt sần t ch lũy lượng đạm tương đương từ 20- 25 kg ure/ha Do nói nốt sần “nhà máy đạm tý hon”, nên trồng đậu tương tốn t phân đạm mà làm cho đất tốt lên, có tác dụng tích cực việc cải tạo bồi dưỡng đất [14] Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn 1.1.2 Đặc đ sinh học Cây đậu tương (Glycine max (L) Merrill) thuộc họ Đậu (Fabaceae), có nguồn gốc từ đậu tương hoang dại (Glycine ussuriensis) dạng thân leo, sống hàng năm phát Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên Chúng có nhiều chủng khác nhau, thích nghi với điều kiện khí hậu từ ơn đới đến nhiệt đới [14] Rễ đậu tương khác với rễ hoà thảo có rễ rễ phụ Rễ ăn sâu 30-50cm 1m Trên rễ mọc nhiều rễ phụ, rễ phụ cấp 2, cấp tập trung nhiều tầng đất 7-8 cm rộng 30-40 cm2 Trên rễ rễ phụ có nhiều nốt sần Bộ rễ phân bố nơng sâu, rộng hẹp, số lượng nốt sần hay nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, kh hậu kỹ thuật trồng [14] Trong điều kiện đất chua kiềm q nốt sần hình thành pH thích hợp cho hình thành nốt sần 6-7, việc lựa chọn đất trồng đậu tương th ch hợp quan trọng Điều kiện dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến phát triển nốt sần Nhìn chung bón đầy đủ NPK nốt sần phát triển mạnh, bón P2O5 có tác dụng thúc đẩy phát triển nốt sần, cịn hiệu kali khơng rõ Bón đạm khơng thích hợp ức chế hình thành phát triển nốt sần Nốt sần rễ đậu tương thường tập trung tầng đất 0-20cm, từ 20-30cm nốt sần dần sâu có khơng có Nốt sần đóng vai trị q trình cố định đạm khí trời cung cấp cho Lượng đạm cung cấp cho lớn khoảng 30-60 kg/ha Nốt sần dài l cm, đường kính mm, hình thành có màu trắng sữa, tốt có màu hồng Quan hệ vi sinh vật nốt sần với đậu tương mối quan hệ cộng sinh: cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn hoạt động, ngược lại vi khuẩn lại tổng hợp nitơ tự khơng khí chuyển sang dạng đạm hữu sử dụng [14] Thân đậu tương thuộc thân thảo, có hình trịn, thân có nhiều lơng nhỏ Thân cịn non có màu xanh màu tím già chuyển sang màu Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn nâu nhạt, màu sắc thân cịn non có liên quan chặt chẽ với màu sắc hoa sau Nếu thân lúc cịn non màu xanh hoa màu trắng cịn non thân có màu t m hoa có màu t m đỏ Thân có trung bình 14-15 lóng, lóng ph a thường ngắn, lóng ph a thường dài (vì lóng phía phát triển từ ngày 35-40 trở vào lúc sinh trưởng nhanh nên lóng thường dài) Tuỳ theo giống thời vụ gieo mà chiều dài lóng có khác thường biến động từ - 10 cm Cây đậu tương vụ hè thường có lóng dài vụ xuân vụ đơng Chiều dài lóng góp phần định chiều cao thân Thân đậu tương thường cao từ 0,3 m - 1,0 m Những giống thân nhỏ lóng dài dễ bị đổ hay mọc bị thường làm thức ăn cho gia súc Những giống thân to thường thân đứng có nhiều hạt chống gió bão Tồn thân có lớp lơng tơ ngắn, mọc dày bao phủ từ gốc lên đến ngọn, đến cuống Thực tế có giống khơng có lơng tơ Những giống có mật độ lơng tơ dày, màu sẫm có sức kháng bệnh, chịu hạn chịu rét khoẻ Ngược lại giống khơng có lơng tơ thường sinh trưởng khơng bình thường, sức chống chịu Thân có lơng tơ nhiều dài ngắn, dày thưa đặc điểm phân biệt giống với Từ lúc mọc đến có thật (3 kép) khoảng 25-30 ngày sau gieo, thân sinh trưởng với tốc độ bình thường [14] Về trình phát triển đậu tương, có 6-7 thật (4-5 kép) thân bắt đầu phát triển mạnh, tốc độ mạnh vào lúc hoa rộ Sự khác biệt đậu tương với trồng khác hoa rộ lại lúc thân cành phát triển mạnh Đây giai đoạn trình sinh trưởng sinh dưỡng sinh trưởng sinh thực cạnh tranh dẫn đến khủng hoảng thiếu dinh dưỡng, cần phải cung cấp đầy đủ dinh dưỡng trước vào thời kỳ tạo điều kiện cho rễ phát triển thuận lợi Trong kỹ thuật chăm sóc ta phải xới vun kết hợp với bón thúc phân cho đậu tương vào giai đoạn 3-5 kép, lúc có đầy đủ hoa sinh trưởng chậm dần dừng hẳn Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn Cây đậu tương có loại lá: mầm, nguyên, kép Lá mầm mọc có màu vàng hay xanh lục, tiếp xúc với ánh sáng chuyển sang màu xanh Hạt giống to mầm chứa nhiều dinh dưỡng nuôi mầm, hết chất dinh dưỡng mầm khô héo đi, kỹ thuật trồng đậu tương nên làm đất tơi nhỏ chọn hạt to mọc khoẻ, sinh trưởng tốt Lá nguyên xuất sau mọc từ 2-3 ngày mọc phía mầm Lá đơn mọc đối xứng Lá đơn to màu xanh bóng biểu sinh trưởng tốt Lá đơn to xanh đậm biểu giống có khả chịu rét Lá đơn nhọn gợn sóng biểu sinh trưởng khơng bình thường Mỗi kép có chét, có 4-5 chét Lá kép mọc so le, kép thường có màu xanh tươi già biến thành màu vàng nâu Cũng có giống chín giữ màu xanh, giống thích hợp trồng làm thức ăn gia súc Phần lớn có nhiều lơng tơ Lá có nhiều hình dạng khác tuỳ theo giống, giống nhỏ dài chịu hạn khoẻ thường cho suất thấp Những giống to chống chịu hạn thường cho suất cao Nếu kép đầu to dày thường biểu giống có khả chống chịu rét Số lượng kép nhiều hay ít, diện tích to hay nhỏ chi phối lớn đến suất phụ thuộc vào thời vụ gieo trồng Các nằm cạnh chùm hoa giữ vai trò chủ chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho chùm hoa Nếu điều kiện làm cho bị úa vàng vị tr thường bị rụng lép Các nhà chọn giống đậu tương đưa sở để nâng cao suất đậu tương tăng cường trình quang hợp muốn quang hợp với hiệu cao phải chọn có nhỏ, dày, đứng có dạng hình trứng Số nhiều to khoẻ vào thời kỳ hoa rộ Khi phiến phát triển to, rộng, mỏng, phẳng, có màu xanh tươi biểu sinh trưởng khoẻ có khả cho suất cao [14] Hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, thuộc loại cánh bướm Màu sắc hoa thay đổi tuỳ theo giống thường có màu tím, tím nhạt trắng Đa phần giống có hoa màu tím tím nhạt Các giống đậu tương có hoa màu trắng Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn 10 thường có tỷ lệ dầu cao giống màu tím Hoa phát sinh nách lá, đầu cành đầu thân Hoa mọc thành chùm, chùm có từ 1-10 hoa thường có 3-5 hoa Hoa đậu tương nhiều tỷ lệ rụng cao khoảng 30% có lên tới 80% [14] Hoa đậu tương thuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính hoa có nhị nhụy, hoa gồm đài, cánh hoa có 10 nhị nhụy Đài hoa có màu xanh, nhiều bơng Các cánh hoa vươn khỏi đài từ ngày hôm trước việc thụ phấn xẩy vào sáng ngày hôm sau lúc 8-9 sáng trước nụ hoa chưa nở hoàn tồn Mùa hè hoa thường nở sớm mùa đơng thời gian nở hoa ngắn sáng nở chiều tàn Hoa đậu tương thường thụ phấn trước hoa nở tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn thấp chiếm trung bình 0,5 - 1% Thời gian bắt đầu hoa sớm hay muộn, dài hay ngắn tuỳ thuộc vào giống thời tiết khác Giống chín sớm sau mọc 30 ngày hoa giống chín muộn 45-50 ngày hoa Thời gian hoa dài hay ngắn theo giống theo thời vụ Có giống thời gian hoa kéo dài 10-15 ngày Kết nghiên cứu cho thấy thời kỳ hoa rộ thường từ ngày thứ đến ngày thứ 10 sau hoa bắt đầu nở Hoa đợt rộ tạo nhiều, trước sau đợt hoa rộ tỷ lệ đậu thấp Điều kiện thích hợp cho nở hoa nhiệt độ 25-28oC, ẩm độ khơng khí 75-80%, ẩm độ đất 70-80% Căn vào phương thức hoa người ta chia giống đậu tương làm nhóm: (i) Nhóm hoa hữu hạn: Thuộc giống sinh trưởng hữu hạn, hướng hoa theo trình tự từ xuống từ vào Những giống thường thấp hoa tập trung, hạt đồng (ii) Nhóm hoa vơ hạn: Thuộc giống sinh trưởng vơ hạn, có hướng hoa theo trình tự từ lên từ Những giống thường hoa phân tán, chín khơng tập trung phẩm chất hạt không đồng Trong thực tế, giống hoa tập trung gặp điều kiện bất thuận, hoa rụng nhiều nên thất thu nặng Còn giống thời gian hoa dài chín khơng tập trung bị rụng vào đợt hoa tiếp đợt sau nên không thất thu nặng Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn 37 tc d 3.2 đậu tươ c u e t ệT 3.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số DNA tổng số từ mẫu đậu tương giống DT84 tách chiết theo phương pháp Saghai Maroof cộng (1984) [49] điện di kiểm tra gel agarose, kết thể hình 3.7 10 11 12  Hình 3.7 Kết điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ mẫu dòng chuyển gen đối chứng giống DT84 1- : Đố uy ứ e ố uy - :m u e y - :m u uy - :m u e y y uy e ố y ố - :m u uy e ố - :m u uy e y ố Kết thể hình 3.6 cho thấy DNA tổng số tách chiết đảm bảo hàm lượng chất lượng cho việc tiến hành phản ứng PCR nhân cấu trúc CPi- SMV đậu tương chuyển gen 3.2.2 Kết nhân đoạn gen CPi- SMV từ d ng đậu tương chuyển gen T0 Để kiểm tra có mặt gen chuyển dòng đậu tương chuyển gen, kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-Fi/ SMV-CPi-Ri sử dụng để nhân đoạn gen CPi - SMV từ DNA hệ gen Kết PCR nhân đoạn gen CPi –SMV từ DNA tổng số dòng đậu tương chuyển gen đối chứng có nguồn gốc từ giống DT84 trình bày hình 3.8 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn 38 WT (+) M 0,5 kb  Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt cấu trúc CPi -SMV dòng đậu tương chuyển gen đối chứng ( : e SMV: ố , WT: ứ y ố ứ uy , , , , : y e (+): plasmid pK7GW-CPiut uy e ởt ế ệT ) Hình 3.8 cho thấy có dịng dương t nh với PCR đoạn DNA thu có k ch thước khoảng 294 bp xuất chạy số 1, 2, 5, đối chứng khơng chuyển gen (WT) không xuất đoạn DNA k ch thước Các dòng đậu tương chuyển gen dương t nh với PCR hệ T0 giống DT84 ký hiệu là: T84-01, T84-02, T84-04 T84-05 Kết cho thấy cấu trúc CPi-SMV chuyển thành công vào giống đậu tương DT84 3.2.3 Hiệu suất chuyển gen giống đậu tương DT84 Hiệu suất chuyển gen hệ T0 t nh tỷ lệ dương t nh với PCR tổng số mẫu biến nạp, kết thể bảng 3.3 3.3 Hiệu suất chuyển gen hệ T0 ố ẫu ốc t t t tự 285 ố ốc dươ v t R ệu uất c u e ê Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c 1,40 http://www.lrc.tnu.edu.vn 39 Bảng 3.3 cho thấy, tổng số 285 mẫu biến nạp có sống sót mơi trường tự nhiên (chiếm tỷ lệ 1,75%) có dương t nh với PCR Như hiệu suất chuyển gen CPi giống đậu tương DT84 1,40% 3.3 T uậ t u ê c u 3.3.1 Khả n ng tạo thực vật chuyển gen kháng virus kỹ thuật RNAi Hệ gen SMV RNA sợi đơn dương Sự ức chế RNA ngoại lai chế RNAi xảy có tương đồng cao siRNA gen đ ch (RNA virus) Mặt khác, hiệu kháng virus chuyển gen phụ thuộc nhiều vào vai trò chức gen virus mục đ ch phân hủy, lựa chọn vùng gen để thiết kế cấu trúc RNAi cho khâu quan trọng đưa đến khả thành công kỹ thuật RNAi Phân tích trình tự CP SMV cho thấy có khác biệt lớn k ch thước trình tự amino acid, lại có tương đồng cao trình tự đầu C CP Chính đầu 3‟ gen CP SMV lựa chọn để thiết kế đoạn gen CPi SMV (CPi-SMV) Gen CP gen đặc trưng Potyvirrus, mã hóa protein CP chia thành ba vùng: vùng đầu N, vùng lõi vùng đầu C Chức CP thể nhân lên, capsid hóa, di chuyển virus từ tế bào đến tế bào truyền virus rệp [52] Vùng Poty- coat CP SMV có 232 amino acid từ amino acid thứ 33 đến 264 [37] Trong nghiên cứu này, đoạn CPi-SMV sử dụng để thiết kế vector chuyển gen gồm 294 nucleotide RNAi xem chế quan trọng việc kháng lại virus thực vật [27] Trong đó, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen lặp lại đảo chiều virus mục tiêu sử dụng để chuyển vào Cấu trúc biểu thành RNA sợi đơi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) chuyển gen k ch th ch chế RNAi hoạt động có xâm nhập virus vào Vì vậy, kỹ thuật chuyển Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn 40 gen dựa chế can thiệp RNA ứng dụng để tạo giống trồng kháng lại virus Nhiều giống trồng kháng loại bệnh virus khác tạo kỹ thuật chuyển gen RNAi Năm 2004, Baulcombe công bố chế hoạt động siRNA coi chế quan trọng trog việc kháng lại virus thực vật [27] Ứng dụng công nghệ RNAi việc tạo chuyển gen kháng virus lĩnh vực mẻ giới quan tâm Việc tạo chuyển gen kháng virus mở triển vọng tạo thực phẩm an toàn cho môi trường T nh hiệu qủa kỹ thuật RNAi việc tạo trồng chuyển gen mã hoá protein virus (CP, Rep ) có khả kháng lại ch nh virus chứng minh thực tế Nhiều giống trồng kháng virus tạo kỹ thuật Năm 2007, Bonfim đtg tạo dòng đậu tương chuyển gen kháng virus Bean golden mosaic virus với t nh kháng lên đến 93% [28] Furutani đtg (2007) thành công tạo đậu tương biến đổi gen kháng SMV kỹ thuật RNAi [30] Cho đến có nhiều loại trồng chuyển gen kháng bệnh virus công nhận trồng thương mại như: đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng (papaya ringspot virus, PRSV); b đao chuyển gen kháng ba loại virus Cucumber mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, ớt cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus, … Ngoài nhiều loại trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác giai đoạn khảo nghiệm để gen công nhận giống trồng thương mại như: khoai mì chuyển gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); bắp chuyển kháng Maize steak virus (Mastrevirus); khoai tây chuyển gen kháng đồng thời loại virus Potato virus X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus); lúa chuyển gen Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn 41 kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); khoai lang chuyển gen kháng Sweet potato feathery mottle virus (Potyvirus)… [44] Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo chuyển gen kháng virus bắt đầu Từ việc tổng kết cơng trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi thực tiễn, Đỗ Năng Vịnh (2007) khẳng định RNAi kỹ thuật mạnh mẽ có triển vọng to lớn việc ứng dụng tạo chuyển gen kháng virus kỹ thuật chủ động tạo giống trồng kháng bệnh virus gây thực vật [21] Sự can thiệp RNAi đưa nhiều ứng dụng thú vị kỹ thuật gen Các phân tử RNAi có khả gây bất hoạt đưa vào tế bào k ch hoạt máy can thiệp RNAi để phá hủy phân tử mRNA có trình tự nucleotide tương đồng Kỹ thuật trở thành dụng cụ nghiên cứu quan trọng ngành sinh học y sinh dược học Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tạo nhiều giống trồng, đặc biệt đậu tương có khả kháng lại loại bệnh virus gây để giảm thiệt hại suất đem lại lợi ch kinh tế cao cho người nông dân, giảm số lượng đậu tương nhập nước ta Mọi người hy vọng kỹ thuật sử dụng lĩnh vực y học lâm sàng lẫn ngành nông nghiệp 3.3.2 Khả n ng chuyển gen đậu tương qua nách mầm Trong chuyển gen đậu tương, khó khăn thường gặp biến nạp tái sinh chuyển gen, như: hàm lượng protein tế bào mô lớn nên dễ nhiễm khuẩn vệ tinh không mong muốn, hạt giống khó bảo quản nhanh khả nảy mầm; khó khăn mùa vụ sinh thái làm giảm khả tái sinh, sinh trưởng phát triển sinh sản bình thường biến đổi gen Để khắc phục khó khăn riêng nói cần tính tốn, khảo sát nồng độ chủng loại kháng sinh phù hợp với giống cho vừa bảo đảm mẫu tái sinh không bị nhiễm khuẩn nấm lại vừa bảo đảm khả tái sinh tế bào mô tiếp Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn 42 nhận Đặc điểm mùa vụ sinh thái yếu tố di truyền giống xác lập qua chọn lọc tự nhiên nên khó thay đổi Để khắc phục nghiên cứu tái sinh đậu tương biến đổi gen lựa chọn giải pháp tính tốn thời gian biến nạp tái sinh cho trùng khớp với thời gian sinh thái giống tốt Nhìn chung, đậu tương, nghiên cứu tái sinh chuyển gen trồng vào vụ xuân hay xn hè thích hợp cho hiệu tạo chuyển gen có tỷ lệ sống cao Ngồi sử dụng buồng sinh trưởng để chủ động điều tiết nhiệt độ thời gian chiếu sáng giải pháp kỹ thuật chấp nhận [17] Về hiệu suất chuyển gen, hai giống đậu tương ĐT12 DT84 Nguyễn Thu Hiền (2011) thử nghiệm chuyển gen gus Hiệu suất chuyển gen kiểm tra giai đoạn hạt thu 7,8% giống ĐT12 4,3 % với giống DT84 Lị Thị Mai Thu chuyển thành cơng cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào hai giống đậu tương ĐT12 DT2008 Thu dòng đậu tương chuyển gen hệ T0 từ giống ĐT12 19 dòng chuyển gen từ giống DT2008 dương t nh với phản ứng PCR, hiệu suất chuyển gen đạt 1,35% 2,24% Hiệu suất chuyển gen GmEXP1 vào đậu tương nghiên cứu Lò Thanh Sơn giai đoạn đánh giá T0 đạt 0,53% Trong nghiên cứu việc chuyển cấu trúc CPi (SMV) vào giống đậu tương DT84 tiến hành thành công với hiệu suất chuyển gen kiểm tra giai đoạn T0 1,4% So với nghiên cứu chuyển gen vào giống đậu tương trước hiệu suất chuyển gen cịn thấp, việc tăng hiệu suất chuyển gen lên cao việc làm cần thiết Sự thành công việc tạo chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố tần số biến nạp, tác nhân chọn lọc, khả tái sinh chuyển gen hoàn chỉnh từ loại tế bào mô tiếp nhận giống, ảnh hưởng môi trường tái sinh loại mô Đối với phương pháp chuyển gen thông qua A.tumefaciens hiệu suất chuyển gen khơng phụ thuộc vào yếu tố liên quan đến thực vật Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn 43 mà phụ thuộc vào yếu tố liên quan đến vi khuẩn như: kiểu di truyền cây, độ khỏe mẫu, thời gian cảm ứng, chủng vi khuẩn dạng Ti-plasmid, hoạt tính nhóm gen vir, mật độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, thao tác xử lí mẫu trước chuyển gen Trong nhóm yếu tố liên quan đến thực vật ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen khả tiếp nhận gen tái sinh mô đ ch quan tâm Cho tới có nhiều thử nghiệm thành công chuyển gen nhờ vi khuẩn A.tumefaciens tái sinh đậu tương biến đổi gen từ loại mơ đ ch khác hiệu suất cao nhắc đến chuyển gen qua nách mầm hạt chín [42], [43] Vector tái tổ hợp pk7GW-SMV-CPi chuyển thành công gen đ ch thuốc sử dụng để chuyển vào đậu tương Mô tiếp nhận gen chuyển sử dụng nách mầm hạt chín giống đậu tương DT84 Ưu nách mầm hạt ch n ch nh đặc điểm tái sinh đa chồi (hệ số tạo chồi cao) mà mô khác Sự tái sinh nách mầm sau loại bỏ chồi mầm gây tổn thương để phát sinh chồi bên cao Mỗi nách mầm có khả tái sinh hai hay nhiều chồi bên nên tái sinh tạo nhiều chuyển gen thuộc dịng, từ nâng cao hiệu suất tạo biến đổi gen Hơn nữa, việc tạo thu nhận nguyên liệu cho biến nạp dễ dàng thực cách cho hạt khử trùng nảy mầm môi trường MS Sau ngày gieo hạt, tiến hành tách đôi mầm, loại bỏ rễ mầm chồi mầm sẵn sàng nguyên liệu biến nạp với số lượng lớn Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn 44 ẾT L N Đ NG t uậ 1.1 Cấu trúc pK7GW-SMV-CPi chuyển thành công vào giống đậu tương DT84 qua nách mầm hạt chín thơng qua A.tumerfacien nhận dòng đậu tương chuyển gen hệ T0 1.2 Các dòng đậu tương chuyển gen hệ T0 xác định dương tính với phản ứng PCR chiếm 80% băng DNA thu có k ch thước khoảng 294 bp 1.3 Hiệu suất chuyển gen hệ T0 giống đậu tương DT84 1,4% Đ Tiếp tục chọn lọc, phân tích dịng đậu tương chuyển gen kháng SMV hệ T1 hệ phục vụ cơng tác chọn giống đậu tương có khả kháng virus Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn 45 T T L ỆU THAM KHẢO ệt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, (1997), Công nghệ sinh học th c v t cải tiến giống trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Ngơ Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), C y ut Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Danh Đông (1971), Sâu bệnh hạ ut v ện pháp phịng trừ, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội Chu Hồng Hà, Đỗ Xuân Đồng, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình (2011), “Nghiên cứu tạo giống đu đủ kháng bệnh đốm vòng ứng dụng chế RNAi”, H i thảo Quốc gia bệnh hại th c v t Việt nam, tr 316–326 Chu Hoàng Hà, Nguyễn Minh Hùng, Bùi Chi Lăng, Lê Trần Bình (2004), “Đánh giá t nh đa dạng dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ Việt Nam thơng qua tách dịng, xác định so sánh trình tự gen mã hố protein vỏ (CP)”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2(4), tr 451-459 Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn, (2011), “Nghiên cứu khả tái sinh biến nạp gen qua nách mầm hai giống đậu tương (Glycine max L.) DT12 DT84 te um”, Tạp chí Công nghệ sinh học,8(38), tr 1305–1310 Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2012), “Nghiên cứu tạo đậu tương chuyển gen mang cấu trúc biểu gen mã hóa kháng nguyên bề mặt virus H5N1 phục vụ sản xuất vaccine thực vật”, Tạp chí khoa học cơng nghệ Đại học Thái ngun, 89(1), tr 123-127 Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), “Phát triển hệ thống tái sinh in vitro Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn 46 đậu tương (Glycine max L Merril) phục vụ chuyển gen”, Tạp chí khoa học công nghệ - Đại học Thái Nguyên, 52(4), tr 82-88 Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), Phân l p, tạ qu ến tính chịu hạn thử nghiệm chuy m gen P5CS liên t biế v y u t V ệt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên 10 Khuất Hữu Khanh (2006), Kỹ thu t gen, nguyên lí ứng dụng Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 56-57 11 Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh chun khoa, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội 12 Nguyễn Đức Thành (2003), Chuy n gen th c v t, Nxb Khoa học kỹ thuật, tr 28-29 13 Nguyễn Quang Thạch, (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005) Giáo trình công nghê sinh họ ệ Nxb Nông Nghiệp - Hà Nội, tr 35-37 14 Phạm Văn Thiều, (2002), C y ut ĩ t u t trồng chế biến sản phẩm, Nxb Nông nghiệp Hà Nội, tr 15-26 ạn gen CP từ Soybean mosaic virus 15 Lò Thị Mai Thu (2014), Phân l phát tri n vector chuy n gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạ y ut chuy n gen kháng bệnh, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên 16 Lò Thị Mai Thu, Hoàng Hà, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu (2014), „„Đặc điểm đoạn gen mã hóa coat protein phân lập từ soybean mosaic virus, Tạp chí sinh học, 36(se), tr 283-292 17 Lò Thanh Sơn, Nghiên cứu ặ phát tri n b rễ y ut m chuy (G y em x( ) e G EXP e ê qu ến s ), Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên 18 Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2008), “Tạo thuốc kháng bệnh virus khảm dưa chuột kỹ thuật RNAi”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, (4A), tr 679 – 687 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn 47 19 Phạm Thị Vân, Nguyễn Minh Hùng, Lê Trần Bình (2009), “Xác định virus gây bệnh khảm dưa chuột (Cucumber mosaic virus – CMV) thuốc Cao Bằng Hà Tây thơng qua tách dịng giải trình tự gen mã hóa protein MP CP”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 47 (3), tr 1-7 20 Phạm Thị Vân, Chu Hồng Hà , Lê Trần Bình (2009), “Cây thuốc chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời hai loại virus gây bệnh khảm”, Tạpchí Công nghệ Sinh học, (2), tr 241-249 21 Đỗ Năng Vịnh (2007), “Công nghệ can thiệp RNAi (RNAi) gây bất hoạt gen tiềm ứng dụng to lớn”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, (3), tr 265-275 22 Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Chu Hồng Mậu, Lê Trần Bình (2009), “Thiết kế vector cấu trúc RNAi mang gen virus gây bệnh xoăn cà chua”, H i nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, tr 473 - 477 23 Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu, Lê Trần Bình (2011), “So sánh t nh kháng bệnh xoăn vàng dòng cà chua chuyển gen mang cấu trúc RNAi đơn gen đồng thời hai gen Tomato yellow leaf curl Vietnam virus”, H i thảo Quốc gia Bệnh hại th c v t Việt Nam 2011, tr 290 – 299 24 Nguyễn Thị Hải Yến (2012), Nghiên cứu tạo cà chua kháng bệ x ă v virus kỹ thu t chuy n gen, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học - VAST 25 Can thiệp RNA v i cu c sống, tạp chí KH&CN Nghệ An số 12-2012 T 26 Bartel D P (2004), “MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism andfunction”, Cell., 116, pp 281–297 27 Baulcombe D (2004), “RNA silencing in plants”, Nature, 431, pp 356-363 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn 48 28 Bonfim K., Faria J C., Nogueira, E O., Mendes E A., Aragão F J (2007),“RNAi-mediated resistance to Bean golden mosaic virus in genetically engineered common bean (Phaseolus vulgaris)”, Mol Plant Microbe Interact, 20, pp 717 – 726 29 FAO/WHO (1990) Expert consultation on protein quality evaluation Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome 30 Furutani N., Yamagishi N., Hidaka S., Shizukawa Y., Kanematsu S., Kosaka Y (2007), “Soybean mosaic virus resistance in transgenic soybean caused by posttranscriptional gene silencing”, Breed Sci., 57, pp 123–128 31 Gary Stacey, (2008), Genetics and genomics of soybean, Springer 32 Gottula J., Fuchs M., (2009), “Toward a quarter century of pathogen-derived resistance and practical approaches to plant virus disease control” Adv Virus Res 75, pp 161-83 33 Hammond S M., Bernstein E., Beach D., Hannon G J (2000), “An RNAdirected nuclease mediates post - transcriptional gene silencing in Drosophila cells”, Nature, 404, pp 293 – 296 34 Hartman G L., Sinclair J B., Rupe J C (1999), Compendium of Soybean Diseases, Fourth Edition, The American Phytopathological Society Press, Minnesota, USA 35 Hinchee M A W., Conner W D V., Newell C A., McDonnell R E., Sato S J, Gasser C S., Fischhoff D A., Re D B., Fraley R T., Horsch R B (1988), “Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated DNA transfer”, Nat Biotechnol., 6, pp 915–922 36 Hill J., Bailey T B., Benner H I., Tachibana H., Durand D P (1987), “Soybean mosaic virus: Effects of primary disease incidence on yield and seed quality”, Plant Disease, 71, pp 237-239 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn 49 37 Jayaram C., Hill J H., Miller W A (1992), “Complete nucleotide sequences of two soybean mosaic virus strains differentiated by response of soybean containing the Rsv resistance gene”, J Gen Virol., 73, pp 2067-2077 38 Matthews P.R., Wang M.B., Waterhouse P.M., Thornton S., Fieg S.J., Gubler F., Jacobsen J.V (2001), “Marker gene elimination from transgenic barley, using co-transformation with adjacent „twin T-DNAs‟ on stDNAard Agrobacterium transformation vector” Mol Breed 7: pp 195- 202 39 Nicola-Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V (2005), “Hairpin RNAmediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus” Transgenic Res 14(6), pp 989-994 40 Olhoft P.M et al., (2007), “A novel Agrobacterium rhizogenes- mediated transfomation method of soybean [Glycine max (L) Merrill] using primary-node explants from seedings”, I V t 41 Olhoft, P.M and D.A e Dev B Somers., -Plant, 43, pp 536–549 (2001), “L-Cysteine increases Agrobacteriummediated T-DNA delivery into soybean cotyledonarynode cells” Plant Cell Rep 20, pp.706–711 42 Olhoft, P.M and D.A Somers (2007), Soybean In: Pua, E.C and M.R Davey (eds.) Biotechnology in Agriculture and Forestry 61, pp 3–27 43 Paz, M.M., H., Shou., Z Guo Z., Zhang., A.K., Banerjee and Wang K., (2004), “Assessment of conditions affecting Agrobacterium- mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant” Euphytica 136, pp.167–179 44 Reddy D V R., Sudarshana M R., Fuchs M., Rao N C and Thottappilly G., 2009 “Genetically Engineered Virus-Resistant Plants in Developing Countries: Current Status and Future Prospects” Advances in Virus Research 75, pp 185220 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn 50 45 Ren- Gao X., Hong-Feng X and Zhang R., (2006), “A multi-needle-assised transfomation of soybean cotyledonary node cells”, Biotechnol Lett, 28, pp 1551– 1557 46 Ren GX, Zhang B, Hong FX (2007) “Overexpression of a NTR1 in transgenic soybean confers tolerance to water stress” Plant Cell Tiss Organ Cult 9: pp.177-183 47 Saghai M M A., Soliman K M., Jorgenser R A., Allard R W., ( 1984), “Ribisomal DNA space – length polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chrommosomal location and population dynamics”, Proc Natl Acad Sci USA, 81, pp 8014-8018 48 Smith NA., Singh SP., Wang MB., Stoutjesdijl PA., Green AG., Waterhouse PM., (2000), Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs Nature 407, pp 319-320 49 Sun ZN., Yin GH., Song YZ., An HL., Zhu CX., Wen FJ., (2010), “Bacterially Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences of Tobacco Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different Ability to Protect Tobacco from Viral Infection” Appl Biochem Biotechnol, 162 (5), pp 1517 50 Urcuqui I S., Haenni A L., and Bernardi F., (2001), “Potyvirus proteins: a wealth of functions” Virus Research 74: pp 157-175 51 Waterhouse PM., Graham MW., Wang MB., (1998), “Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA” Proc Natl Acad Sci USA 95(23), pp.13959-13964 Internet 52 http://xttm.agroviet.gov.vn/Site/viVN/76/tapchi/67/112/5022/Default.aspx 53 https://books.google.com.vn/books?Genetics+and+genomics+of soybean 54 www.gso.gov.vn Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn 51 55 http://www.hcmbiotech.com.vn/print.php?id=1388&p=news&f1=title_vn&f2=d etail_vn 56 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 57 http://www.mekonginfo.org 58 http://www.tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Bệnh_khảm_vàngậu_nành) 59 http://tiennong.vn/vn/bh/benh-kham-kham-vo-hat-dau-tuong-soybean-mosaicvirus_131.aspx 60 http://m.tribenhtri.vn/item/gia-tri-dinh-duong-cua-cay-dau-tuong 61 http://www.intechopen.com/books/howtoreference/a-comprehensive-survey-ofinternational-soybean-research-genetics-physiology-agronomy-and-nitrogenrelationships/gene-duplication-and-rna-silencing-in-soybean 62 http://soydiseases.illinois.edu/index.cfm?category=diseases&disease=79 63 http://www.vietrade.gov.vn/nong-sn-khac/4258-nganh-u-tng-vit-nam-nm-2013va-mt-s-d-bao.html 64 http://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90%E1%BA%ADu_t%C6%B0%C6%A1ng Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN c http://www.lrc.tnu.edu.vn ... tài ? ?Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng chuyển gen kháng Soybean mosaic virus? ?? ục t ê c u Tạo dòng chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV giống. .. đậu tương DT84 Nộ du ê c u Nghiên cứu lây nhiễm A tumefaciens mang cấu trúc RNAi vào mô nách mầm hạt chín giống đậu tương DT84 Tái sinh in vitro, chọn lọc tạo dòng đậu tương chuyển gen mang cấu. .. Hiệu suất chuyển gen hệ T0 giống đậu tương DT84 1,4% Đ Tiếp tục chọn lọc, phân tích dòng đậu tương chuyển gen kháng SMV hệ T1 hệ phục vụ cơng tác chọn giống đậu tương có khả kháng virus Số hóa