174 Chương 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH SẢN PHẨM 3 1 CÔ ĐẶC BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA Sự cô đặc các thực phẩm dạng lỏng (như trà, cà phê, nước trái cây, rượu, ) và một số hóa chất, dược phẩm, enzyme là[.]
Chương CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH SẢN PHẨM 3.1 CƠ ĐẶC BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA Sự đặc thực phẩm dạng lỏng (như trà, cà phê, nước trái cây, rượu,…) số hóa chất, dược phẩm, enzyme phương pháp bảo vệ tính chất vốn có chúng, tinh sản phẩm thu được, giảm chi phí bảo quản vận chuyển Sự đặc thực phương pháp bốc có (hay khơng có) thu hồi chất bay hơi, hay phương pháp kết tinh dung môi, thẩm thấu nghịch kết tủa Phương pháp bốc xem phương pháp kinh tế nghiên cứu kỹ để đặc dung dịch Có thể thu hồi chất bay bốc với nước tháp chưng cất Tuy nhiên không tránh khỏi phân hủy nhiệt tác dụng số men dù nhiệt độ 50 - 700C Trong trình thẩm thấu nghịch bị phần đáng kể chất thơm Cô đặc phương pháp kết tủa chất cần làm có loạt ưu điểm so với phương pháp khác, đặc biệt sản phẩm bền nhiệt chứa nhiều chất thơm Ở nhiệt độ thường, q trình phân hủy hóa học sinh hóa khơng đáng kể so với nhiệt độ cao, đảm bảo chất lượng cho sản phẩm Phương pháp thường áp dụng để tinh enzyme số chất khác, dịch sản phẩm thô thu ngồi chất mong muốn cịn có chứa nhiều loại tạp chất khác Do khâu phải loại bỏ tạp chất để thu sản phẩm mong muốn nhằm làm tinh sản phẩm, nâng cao giá trị thuận lợi cho công đoạn 3.1.1 Kết tủa đẳng điện Một chất hay số protein thường có điểm đẳng điện 174 (pI) pI phân tử có tổng điện tích 0, tức khơng có lực đẩy tĩnh điện, nên phân tử kết hợp với tạo kết tủa Vì vậy, kết tủa đẳng điện chất quan tâm protein tạp chất khác Sau lọc hay ly tâm để thu loại bỏ kết tủa 3.1.2 Kết tủa muối trung tính Độ hịa tan chất (hay protein enzyme) tăng với lực ion (µ) mơi trường: 1 m = ∑ Ci Z i2 Với: Ci: nồng độ loại ion i; Zi: điện tích loại ion i (3.1) Tuy nhiên, lực µ vượt q ngưỡng độ hịa tan lại giảm nhanh chúng kết tủa Như vậy, với chất (protein enzyme) có khoảng nồng độ muối mà chúng thể kết tủa hồn tồn, gọi khoảng nồng độ muối tích Khoảng nồng độ muối tích chất thường khác Dựa vào chế tách làm sản phẩm phương pháp kết tủa muối trung tính Enzyme muối thường dùng sulfat amon natri sulfat Thao tác đơn giản cần thêm vào dịch có chứa enzyme thể tích muối trung tính bão hịa lượng muối trung tính dạng rắn có độ phần trăm bão hịa muối Các đoạn protein enzyme thu sau phải loại bỏ muối phương pháp thẩm tích phương pháp lọc gel Có hai cơng thức sau dùng để tính lượng Y ml thể tích dung dịch muối bão hòa lượng A g muối rắn, phải thêm vào 100ml dung dịch chứa protein có độ bão hịa ban đầu S1 để thu dung dịch có độ bão hịa cuối S2 Y= 100( S - S1 ) - S2 (3.2) 175 Y= 0.1( S - S1 )G Vg - S2 1000 (3.3) Trong đó: G: lượng (gam) amon sulffat 1000ml dung dịch bão hòa Thường G có giá trị: 515g 00C, 530,7g 150C, 536,3g 200C Vg: thể tích biểu kiến dung dịch amon sulffat bão hòa: Vg/1000=0,271 00C Vg/1000=0,288 150C Vg/1000=0,29 200C 3.1.3 Kết tủa dung môi hữu Khi thêm dung dịch hữu trung tính trộn lẫn với nước vào dung dịch chất cần kết tủa, làm giảm số điện mơi dung dịch Vì làm tăng lực hút tĩnh điện phân tử làm cho chúng kết hợp lại với tạo thành kết tủa Tùy tính chất loại chất (protein enzyme), dung môi hữu điều kiện kết tủa mà sử dụng nồng độ dung mơi hữu khác Ví dụ: - Protease kết tủa etanol nồng độ 76-78%v/v - Glucoamylase kết tủa etanol nồng độ 45% v/v - Các dung môi hữu thường dùng phổ biến để kết tủa là: etanol, izopropanol, aceton Một số dung mơi sau kết tủa thu hồi lại được, nhiên cần tiến hành diều kiện nhiệt độ định nhằm đảm bảo chất lượng Phương pháp thường dùng cho chất bị biến tính dung môi hữu cơ, sử dụng quy mô lớn chi phí cao, dễ cháy 3.1.4 Thay đổi thành phần hóa học môi trường làm sản phẩm Khi thêm vào mơi trường chất đặc hiệu, người ta thu kết tủa số phân tử Bằng cách ta tách chất quan tâm 176 khỏi hợp chất Chẳng hạn số muối kim loại Mn2+ tác dụng với acid nucleic làm dễ dàng tách enzyme nội bào Có thể kết tủa acid protein kiềm tính protamin Các protein tích điện dương kết hợp với nhóm phosphat tích điện âm acid nucleic, prolamin nucleic tạo thành loại bỏ phương pháp ly tâm 3.1.5 Sử dụng chất trợ kết tủa Đối với enzyme ngoại bào, quy mơ cơng nghiệp người ta thêm vào chất kiselgua, tinh bột, lactose, dextransulfat ficoll để làm kết tủa tạo thành dạng hạt Thường người ta dùng chất có mặt rượu, natri sulfat, acid tacnic 3.1.6 Kết tủa polymer có khối lượng phân tử cao Các polymer như: dextran, polythylenglycol sử dụng với nhiều mục đích: chất làm bền, chất làm đặc (bằng thẩm tích) chất kết tủa chất thường háo nước nên làm vỏ nước phân tử sinh học dẫn đến làm thay đổi số điện mơi mơi trường xung quanh mà ảnh hưởng đến tương tác không gian nhóm háo nước phân tử chất cần Polythylenglycol dùng với nồng độ 50% (w/w) nước làm kết tủa phần lớn protein có nồng độ từ 6-20% Việc kết tủa phụ thuộc vào số yếu tố như: nhiệt độ, lực ion, pH, nồng độ protein khối lượng phân tử chất cần tinh 3.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 3.2.1 Khái niệm sắc ký Định nghĩa Mikhai S Tsvett (1906): Sắc ký phương pháp tách cấu tử hỗn hợp tách cột hấp thụ đặt hệ thống chảy Định nghĩa IUPAC (1993): Sắc ký phương pháp tách cấu tử tách phân bố hai pha, hai pha pha tĩnh đứng yên pha chuyển động theo hướng xác định a) Đặc điểm chung phương pháp sắc ký Quá trình tách dựa chuyển dịch hỗn hợp phân tích qua lớp chất bất động (pha tĩnh) chất rắn chất lỏng mang chất rắn 177 giấy chuyển dịch thực chất khí chất lỏng (pha động) Pha động (mobile phase): làm nhiệm vụ chuyển dịch đưa mẫu phân tích đến bề mặt pha tĩnh, pha động cịn có nhiệm vụ tiếp nhận phần tử chất phân tích hấp thụ trước bị giải hấp tới tương tác với phần khác pha tĩnh Pha tĩnh (stationnary phase): chất rắn chất lỏng mang bề mặt chất rắn có tác dụng giữ mẫu Hình 3.1 Sơ đồ nguyên lý a) Sắc ký cột; b) Sắc ký mỏng Sắc ký trình tách liên tục vi phân hỗn hợp chất phân bố không đồng chúng pha tĩnh pha động cho pha động xuyên qua pha tĩnh Sắc ký trình trao đổi chất phương pháp hóa lý khác: chưng cất, chiết, kết tinh khác với phương pháp khác phân chia sắc ký thực trình hấp thụ, giải hấp thụ lặp lặp lại suốt trình tách 178 Cơ chế sắc ký có nhiều để thực q trình sắc ký có hai dạng: dạng cột dạng bảng phẳng (xem Hình 3.1) b) Phân loại phương pháp sắc ký Phân loại theo trạng thái liên hợp pha động pha tĩnh: theo cách phân loại tất phương pháp sắc ký phân thành hai nhóm lớn theo pha động: - Sắc ký khí - pha động khí - Sắc ký lỏng - pha động chất lỏng, dung môi hữu Phân loại theo chế trình tách: theo cách phân loại dựa chất hấp thụ, giải hấp thụ nghĩa theo tương tác chất sắc ký với pha tĩnh pha động Có chế sắc ký sau: - Sắc ký hấp phụ - Sắc ký phân bố - Sắc ký trao đổi ion - Sắc ký rây phân tử - Sắc ký hấp thụ Sự tách lực khác chất chất hấp phụ rắn pha tĩnh Đối với chất hấp phụ phân chủ yếu tương tác cực Do nhóm phân cực phân tử kết tách mạnh mạch hydrocacbon không phân cực Sắc ký phân bố Do độ tan khác phân bố khác chất pha tĩnh (được giữ lại chất mang rắn) pha động Trong sắc ký lỏng, pha tĩnh thường phân cực pha động nhiên có nhiều trường hợp ngược lại pha động phân cực pha tĩnh Về nguyên tắc có nhiều tổ hợp hai pha lỏng nhiên thực tế hạn chế lớn nguyên tắc độ tan “các chất có độ tan giống hịa vào nhau” độ phân cực chất sắc ký pha tĩnh, động có ảnh hưởng đến q trình phân tách 179 Sắc ký trao đổi ion Sự tách xảy lực khác ion dung dịch trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) chất rắn pha tĩnh Chất rắn quan trọng trường hợp nhựa trao đổi ion Sắc ký trao đổi ion chủ yếu dùng dung môi nước, hỗn hợp nước, cịn dung mơi hữu mơi trường có độ điện mơi trường tương đối lớn để ion tồn tự bền Sắc ký rây phân tử Trong trường hợp này, người ta sử dụng vật liệu rắn có độ xốp lớn, có lỗ với kích thước định để rây chọn lọc cấu tử tùy theo kích thước hình dạng phân tử Các ngun liệu sử dụng: Zeolit tổng hợp sử dụng sắc ký rây chất khí Xốp vơ cơ, hữu cơ, polime tổng hợp để tách chất vô cơ, hữu đặc biệt nhóm polymer ưa nước để tách chất có hoạt tính sinh học c) Các phương pháp tính kết sắc ký Phương pháp ngoại chuẩn: so sánh chiều cao diện tích mẫu với chiều cao diện tích chất chuẩn biết trước nồng độ Phương pháp lập đường chuẩn: lập đường chuẩn tuyến tính dung dịch chuẩn có nồng độ theo diện tích chiều cao Từ đường chuẩn từ chiều cao diện tích peak mẫu suy nồng độ mẫu Với hai phương pháp này, phải đảm bảo thể tích mẫu tiêm vào máy Phương pháp nội chuẩn: so sánh gián tiếp diện tích chiều cao peak mẫu peak chuẩn theo diện tích chiều cao peak nội chuẩn 3.2.2 Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography) 3.2.2.1 Định nghĩa Sắc ký trao đổi ion (IC) phần sắc ký lỏng (LC) Một định nghĩa tổng quát để xác định ion sắc ký: “ion sắc ký bao gồm tất phân tách sắc ký lỏng nhanh chóng ion 180 cột trực tuyến với phát định lượng dòng chảy thơng qua máy dị” Định nghĩa đặc trưng cho sắc ký ion không phân biệt chế tách phát phương pháp thời gian định Nguyên tắc phân tách áp dụng sắc ký trao đổi ion: - Trao đổi ion - Hình thành cặp ion - Ion loại trừ Phương pháp sắc ký xác định chế tách tĩnh tách động sử dụng Ngày nay, sắc ký trao đổi ion đơn giản gọi sắc ký ion (IC), sắc ký cặp ion (IPC) sắc ký ion loại trừ (IEC) coi ứng dụng chuyên sâu 3.2.2.2 Bản chất trình sắc ký trao đổi ion Hình 3.2 Quá trình tách sắc ký cột hai chất A B 181 Sắc ký trao đổi ion dựa tượng trao đổi thuận nghịch ion linh động phân tử tĩnh rắn với ion dung dịch phân tích, cho dung dịch qua cột nạp đầy pha tĩnh Các pha tĩnh trường hợp gọi chất trao đổi ion, chất trình phân tách lực khác ion dung dịch trung tâm trao đổi ion ionit Sắc ký trao đổi ion (IC) dựa phản ứng hóa học stoichiometric ion mạng lưới chất rắn thơng thường mang theo nhóm chức mà sửa chữa ion kết điện cực Trong trường hợp đơn giản sắc ký cation nhóm acid sulfonic, anion sắc ký amoni nhóm bậc bốn Các ion lý thuyết với chất trao đổi hồn tồn thuận nghịch hai giai đoạn Q trình trao đổi ion dẫn đến điều kiện cân Trao đổi ion thông thường bao gồm giai đoạn vững bề mặt có nhóm ion cố định Bởi điều kiện electroneutrality ln ln có điện tích trái dấu nhận ion vùng lân cận nhóm chức Ion nhận thường bắt nguồn từ giai đoạn di động cịn gọi eluent ion Nếu mẫu bổ sung, có hai ion chất phân tích A- Bsau thời gian ngắn thay eluent ion E- giữ lại cố định trước chúng trao đổi ion eluent Đối với anion sắc ký, kết cân sau đây: Resin – N+R3E- + A- resin – N+R3A- + E- (3.4) Resin – N+R3E- + B- resin – N+R3B- + E- (3.5) Tính thuận nghịch phản ứng trao đổi ion: Phản ứng trao đổi ion phản ứng thuận nghịch Dựa tính chất người ta dùng dung dịch chất hồn ngun, thơng qua chất trao đổi ion hiệu lực để khôi phục lại lực trao đổi 2HR + Ca2+ → CaR2 + 2H+ (nhựa trao đổi) CaR2 + 2H+ → 2HR + Ca2+ (hồn ngun) Tính acid, kiềm: tính chất Cationit RH Anionit ROH, giống chất điện giải acid, kiềm Tính trung hịa thủy phân: tính trung hòa thủy phân chất trao đổi ion giống chất điện giải thơng thường 182 Tính chọn lựa chất trao đổi ion: hàm lượng ion thấp dung dịch, nhiệt độ bình thường, khả trao đổi tăng hóa trị ion trao đổi tăng a) Nhựa trao đổi ion (Ionit) Ionit hợp chất polymer vơ hữu khơng tan có chứa nhóm hoạt động, bao gồm ionit vơ tự nhiên (nhóm zelite, nhóm đất sét, nhóm glauconit, ) ionit vô tổng hợp (các xenlulose permunit, zeolite) chất hữu tự nhiên, ionit hữu tổng hợp, gọi nhựa trao đổi ion Các ionit vô hữu tự nhiên sử dụng thực tế có độ bền độ bền hóa, khả trao đổi ion thấp, sử dụng nhiều ionit hữu tổng hợp chứa nhựa trao đổi ion Ionit cấu tạo từ hợp chất polymer hữu gồm sườn hydrocacbon có mang nhóm chất hoạt động Các nhóm chức nối với ion linh động lực hút tĩnh điện Có hai loại ionit: cation (nhựa trao đổi cation), anion (nhựa trao đổi anion) Ngồi cịn có loại ionit đặc biệt iomit lưỡng tính (trao đổi anion cation) ionit có chứa nhóm tạo phức: ionit chứa nhóm oxy hóa khí: ionit lỏng màng trao đổi ion Hình 3.3 Sơ đồ tổng hợp nhựa ionit 183 Tính chất vật lý nhựa trao đổi ion (ionit): Màu sắc: vàng, nâu, đen, thẫm Trong trình sử dụng nhựa, màu sắc nhựa thường hiệu lực thâm chút Hình thái: nhựa trao đổi ion thường dạng tròn Độ nở: đem nhựa dạng keo ngâm vào nước, thể tích biến đổi lớn Độ ẩm: % khối lượng nước khối lượng nhựa dạng khô (độ ẩm khơ), dạng ướt (độ ẩm ướt) Tính chịu nhiệt: loại nhựa bị ảnh hưởng nhiệt độ có giới hạn định, vượt giới hạn nhựa bị nhiệt phân giải không sử dụng Nhiệt độ hoạt động tốt từ 20-500C Tính dẫn điện: chất trao đổi ion ẩm dẫn điện tốt, tính dẫn điện phụ thuộc vào dạng ion Kích thước hạt: Resin có dạng hình cầu d= 0,04 – 1,00 mm Tính chịu mài mịn: vận hành, chất trao đổi ion cọ xát lẫn nở ngót, dễ vỡ vụn Đây tiêu ảnh hưởng đến tính thực dụng Tính chịu oxy hóa: chất oxy hóa mạnh làm nhựa bị lão hóa (trơ) Cationit Cationit chứa nhóm hoạt động anion R-, ion linh động M+ Anion R- nhóm sulphonate, nhóm phosphate, carboxylate amino diacetate Nhựa trao đổi cation trao tổng hợp phương pháp ngưng tụ sản phẩm phản ứng ngưng tụ phenol dẫn xuất phenol với fomalin Do phenol chứa OH- nên sản phẩm thu có tính acid yếu thích hợp làm việc môi trường kiềm Để khắc phục nhược điểm này, người ta đưa vào mạng lưới không gian cation nhóm chất khác để thu cation acid mạnh Các nhóm chức nhóm sulphonate, nhóm phosphate, nhóm carboxylate nhóm amino diacetate nói Cationit chứa nhóm chức nối với 184 nhân benzene có tính acid mạnh so với cationit có nhóm chức mạch nhánh Cationit tổng hợp phương pháp ngưng tụ bền tia không bền môi trường có chứa chất oxy hóa Sản phẩm thu dạng khối to, đa chức, khó điều chỉnh mức liên kết ngang Các cationit tổng hợp phương pháp trùng hợp monomer ưa chuộng cationit ngưng tụ có độ bền học, hóa học bền nhiệt cao, lại chứa lại nhóm chức nên dễ điều chỉnh mức liên kết ngang Sản phẩm thu sản phẩm tròn nhỏ nên thuận tiện sử dụng Sản phẩm trùng hợp phổ biến trùng hợp styrene với divinylbenzene (DVB) Ngồi styrene, cịn trùng hợp acid metacrylic hay acid acrylic với duvinylbenzene để sản xuất cationit acid yếu Muốn thu sản phẩm cationit acid mạnh hơn, tiếp tục sulpho hóa (hoặc phosphate hóa…) sản phẩm cationit acid yếu nói Anionit Anionit có dạng R+X- với nhóm hoạt động R+ thường amin Do nhóm amin gắn mạng lưới cao phân tử nên anionit mang tính bazơ Độ bazơ phụ thuộc vào độ bazơ nhóm amin (amin thẳng > amoniac > amin thơm; amin bậc > amin bậc > amin bậc > amin bậc 1) Anionit phổ biến thường chứa amin bậc Anionit tổng hợp phương pháp ngưng tụ phương pháp trùng hợp Để tổng hợp anionit phương pháp thứ nhất, người ta ngưng tụ amin mạch thẳng amin thơm với formalin halogenepoxy Anionit ngưng tụ có tính bazơ yếu, độ bền hóa học kém, khơng bền mơi trường chứa chất oxy hóa Anionit tổng hợp phương pháp tổng hợp có tính bazơ mạnh, bền hóa bền nhiệt tốt lại đơn chức nên sử dụng rộng rãi anionit ngưng tụ Quá trình sản xuất anionit phương pháp trùng hợp tiến hành cách trùng hợp styrene dẫn xuất styrene với divinylbenxene DVB (đã clometyl hóa) tiếp tục amin hóa với trimetylamin dimetyletanolamin để thu anionit bazơ mạnh Ionit lưỡng tính Mạng lưới khơng gian ionit lưỡng tính vừa chứa nhóm chức acid vừa chứa nhóm chức bazơ nên có khả trao đổi cation lẫn anion 185 Ionit lưỡng tính tổng hợp hai phương pháp ngưng tụ trùng hợp Thứ tự ưu tiên trao đổi: - Đối với nhựa caitonit acid mạnh (SAC), Fe3+>Al3+>Ca2+>Mg2+>K+>H+>Li+ - Đối với nhựa Cationit acid yếu (WAC) H+>Fe3+>Al3+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+ Đối với nhựa Anionit kiềm mạnh (SBA), nhựa Anionit kiềm yếu (WBA) Ở hàm lượng ion thấp, nhiệt độ bình thường ion hóa trị, khả trao đổi tăng số điện tử ion trao đổi lớn (bán kính hydrate hóa lớn) Ở hàm lượng ion cao, khả trao đổi ion không khác nhiều Hiện nay, loại nhựa trao đổi ion sản xuất chủ yếu phương pháp ngưng tụ trùng hợp monomer Điều kiện sử dụng nhựa trao đổi ion (ionit): - Nhựa sử dụng để trao đổi ion không dùng để lọc huyền phù, chất keo nhũ màu Sự có mặt chất rút ngắn tuổi thọ nhựa - Loại bỏ chất hữu nhựa phức tạp - Sự có mặt khí hịa tan nước với lượng lớn gây nhiễu loạn hoạt động nhựa - Các chất oxy hóa mạnh Cl2, O3,… tác dụng xấu lên nhựa b) Pha động sắc ký trao đổi ion Rửa giải gradient với tăng lực ion thay đổi pH có giá trị lớn sắc ký trao đổi ion Giả sử xét cột mà anion A- bị lưu giữ mạnh anion B- Ta tách A- khỏi B- cách rửa giải với ion C- có lực với cột yếu A- B- Khi nồng độ C- tăng lên, C- bị thay di chuyển dọc theo 186 cột khỏi cột Khi nồng độ C- tiếp tục tăng lên A- bị rửa giải Trong hình sau cho thấy tăng dần nồng độ H+ sử dụng để tách trao đổi ion Trật tự rửa giải giống với trật tự hệ số chọn lọc cation Hệ số chọn lọc lớn nồng độ H+ địi hỏi cao để rửa giải cation khỏi cột Hình 3.4 Rửa giải La (III) từ cột nhựa trao đổi cation sử dụng gradient nồng độ H+ để tách cất cation lưu giữ mạnh La (III) dị tìm phản ứng với thuốc thử tạo màu sau rửa giải Khi tìm giá trị pH cho phép tách cụ thể, điều kiện cần biết giá trị pKa cấu tử mẫu c) Cơ chế trao đổi ion Mạng lưới ionit mạng không gian cao phân tử không đồng mạch liên kết hydrocacbon Khả trao đổi ion ionit phụ thuộc lớn vào mạng lưới cấu trúc ionit, cụ thể mức liên kết ngang, số lượng chất nhóm chức Nói khả trao đổi ion ionit phụ thuộc vào cấu trúc tính ưa nước ionit định cấu trúc, mà tính ưa nước làm cho ionit có khả trương nước, cho phép ion từ dung dịch có khả khuếch tán nhiều hay bên mạng lưới 187 Khi ngâm nhựa vào nước, nhựa trương nở, nhóm chứa ion trở nên linh động bị phân ly phần Các phản ứng xảy ion pha tĩnh ion dung dịch tương đồng phản ứng trao đổi cấu tử tiếp xúc với trực tiếp dung dịch theo phản ứng hóa học thơng thường Tuy nhiên, dung dịch chứa nhiều ion có khả trao đổi ion với nhựa có cạnh tranh ion dung dịch trình trở nên phức tạp Ion lớp điện tích kép theo mức độ hoạt động lớn nhỏ phân ra: lớp hấp phụ lớp khuếch tán Lớp ion có tính hoạt động tương đối bị hấp phụ bám chặt vào bề mặt cao phân tử gọi lớp hấp phụ hay lớp cố định, bao gồm lớp ion bên phận ion ngược dấu Cạnh lớp hấp phụ, ion có tính hoạt động tương đối lớn, có khả khuếch tán vào dung dịch nên gọi lớp khuếch tán Khi nhựa trao đổi ion gặp dung dịch nước có chất điện giải, tác dụng sau diễn ra: Tác dụng trao đổi: ion ngược dấu lớp khuếch tán ion ngược dấu khác dung dịch trao đổi lẫn Nhưng q trình trao đổi ion khơng giới hạn lớp khuếch tán, quan hệ cân động, dung dịch có số ion ngược dấu trước tiên trao đổi đến lớp khuếch tán, sau trao đổi với ion ngược dấu lớp hấp phụ Tác dụng nén ép: nồng độ muối dung dịch tăng lên làm cho lớp khuếch tán bị nén ép lại Từ đó, số ion ngược dấu lớp khuếch tán biến thành ion ngược dấu lớp hấp phụ… Phạm vi hoạt động lớp khuếch tán nhỏ lại bất lợi cho q trình trao đổi ion Do cần ý nồng độ dung dịch hoàn nguyên lớn, khơng khơng thể nâng cao mà cịn giảm thấp hiệu hồn ngun Tốc độ q trình trao đổi ion: trình hấp phụ, tốc độ trao đổi ion tùy thuộc tốc độ trình thành phần sau: - Khuếch tán ion từ pha lỏng đến bề mặt hạt rắn - Khuếch tán ion qua chất rắn đến bề mặt trao đổi - Trao đổi ion (tốc độ phản ứng) - Khuếch tán ion thay bề mặt hạt rắn 188 - Khuếch tán ion thay từ bề mặt hạt rắn vào dung dịch 3.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng Các yếu tố ảnh hưởng đến khả áp dụng hiệu trình bao gồm: - Dầu mỡ làm tắc nghẽn nhựa trao đổi Chất rắn lơ lững lớn 10ppm gây nhựa làm mù - pH ảnh hưởng đến việc lựa chọn nhựa trao đổi ion - Oxy hóa nước ngầm làm hỏng nhựa trao đổi ion Đối với sắc ký trao đổi ion cationit acid mạnh, cation có bán kính nhỏ khả hydrate hóa dung dịch nước lớn, lực tương tác với pha tĩnh yếu nên bị giữ lại Cịn cột cationit acid yếu khả lưu giữ chủ yếu tương tác pha tĩnh với H có tính acid phân tử nước bị hydrate hóa nên thứ tự ngược lại, cịn cột anionit bazơ thứ tự rửa giải phụ thuộc vào khả tương tác pha tĩnh với chất tan 3.2.2.4 Ứng dụng sắc ký trao đổi ion Sắc ký trao đổi ion đóng vai trò quan trọng việc tách tinh chế phân tử sinh học đóng góp đáng kể vào hiểu biết trình sinh học, sắc ký ion trao đổi phổ biến với kỹ thuật tách khác khoa học đời sống, giai đoạn lọc tách phân tích mẫu sinh học phức tạp Ion trao đổi thường xuyên kết hợp với kỹ thuật khác Phương pháp sắc ký trao đổi ion sử dụng hiệu việc tách phân tích hợp chất phức tạp dạng khí lỏng, chí chất rắn… phương pháp trao đổi ion thường sử dụng để khử độ cứng nước muối hòa tan dạng ion Ca2+ ;Mg2+; khử độ khống nước loại hồn tồn cation, anion có nước; tinh chế chất hóa học; tách chiết protein; điều chế hợp chất hóa học điều chế phân bón hóa học dạng lỏng từ nước thảy; tách lượng nhỏ số nguyên tố… 189 Sắc ký trao đổi ion hiệu cao: Là phương pháp sắc ký nhựa trao đổi ion dùng làm pha tĩnh dạng bột mịn Nhựa trao đổi ion (ionit) hợp chất cao phân tử có chứa nhóm chức có khả trao đổi + Nhựa trao đổi cation (cationit) có hai loại: cationit acid mạnh có chứa nhóm –SO3-H+ sử dụng rộng rãi, cationit acid yếu có nhóm –COOH + Nhựa trao đổi anion (anionit) có hai loại: anionit bazơ mạnh có nhóm amoni bậc –N(CH3)3+OH- anionit yếu có nhóm trao đổi amin bậc hay Các nhựa trao đổi ion chế tạo đồng trùng hợp styrene divinyl bebzene với divinyl benzene có hàm lượng tha đổi từ đến 16% để tăng mức liên kết ngang polymer, dẫn đến trương nở khơng hịa tan nước Các nhân benzene sau gắn vào nhóm –SO3H để tạo nhựa cationjt nhóm amin –NR3+ tạo nhựa anionit Nếu acis metaacrylic dùng để thay cho styrene nhựa cationit acid yếu –COOH tạo thành Cân trao đổi ion: Quá trình trao đổi ion nhựa cationit acid mạnh với Ca2+ dung dịch viết: 2H+ (rắn) + Ca2+ (dd) Ca2+(r) +2H+ (dd) Ca 2+ [ H ] dd r Áp dụng định luật khối lượng ta có: K ' = 2+ Ca [ H ]r dd Ở pha rắn nhựa ionit Biểu thức biểu diễn lại sau: Ca 2+ r = K = ;K ' Ca 2+ dd 190 [ H ]dd [ H ]r K hệ số phân bố Ca2+ dung dịch nhựa ionit Ion có K lớn bị lưu giữ mạnh ionit, K nhỏ bị lưu giữ yếu K phụ thuộc vào điện tích kích thước ion bị hydrate hóa Nói chung, nhựa trao đổi ion ưu tiên trao đổi với ion có điện tích cao hơn, bán kính hydrate hóa nhỏ 3.2.3 Sắc ký lọc gel Đây dạng sắc ký đặc biệt dựa vào khác kích thước phân tử hợp chất Người ta gọi sắc ký theo cỡ (Size Exclusion Chromatography) hay sắc ký rây 3.2.3.1 Nguyên tắc Pha tĩnh sắc ký gel dung môi lỗ gel cịn pha động dung mơi chạy qua Nói cách khác pha động pha tĩnh dung môi hỗn hợp dung môi Chất nhồi cột (gel) cho sắc ký hạt nhỏ (cỡ 10mm) chứa mạng lưới lỗ đồng chất tan dung mơi khuếch tán vào Gel thường dùng chế tạo từ dextran, poliacrilanit số hợp chất thiên nhiên tổng hợp khác Trong sắc ký gel, người ta tách phân tử có kích thước lớn (khơng bị hấp phụ lên gel kích thước phân tử vượt kích thước lỗ gel) khỏi phân tử có kích thước bé Các phân tử kích thước bé xun vào lỗ gel, sau người ta rửa chúng khỏi gel Trong lỗ đó, phân tử bị bẫy cách hiệu bị tách từ dòng chảy pha động Thời gian cư ngụ trung bình lỗ phụ thuộc vào kích thước hiệu dụng phân tử Các phân tử có kích thước lớn so với kích thước trung bình lỗ chất nhồi khơng bị lưu giữ Cịn phân tử có đường kính nhỏ đáng kể kích thước lỗ thâm nhập sâu vào sâu lỗ cần nhiều thời gian để khỏi lỗ, dẫn đến bị rửa giải sau Nằm hai loại phân tử có kích thước trung bình xâm nhập vào lỗ nhiều hay tùy thuộc đường kính chúng Chú ý sắc ký lọc gel khác với trường hợp xét trước đây, 191 khơng có tương tác hóa học vật lý phân tử chất tan pha tĩnh Với loại sắc ký lọc gel, người ta tiến hành tinh vi người ta điều chỉnh kích thước lỗ gel Ví dụ cách thay đổi dung mơi để thay đổi độ trương gel Sắc ký lọc gel thực dạng cột hay dạng lớp mỏng 3.2.3.2 Các loại hạt gel sắc ký gel Việc tách sắc ký gel tùy thuộc vào đặc điểm lỗ rỗng hệ mạng không gian ba chiều Hạt gel phải có kích cỡ giống nhau, có tính trơ mặt hóa học, bền mặt học, lỗ rỗng hạt gel phải có hình dạng đồng Mỗi loại gel có khả xác định việc tách loại trọng lượng phân tử, tùy vào kích thước lỗ rỗng hạt gel Vì thế, muốn tách hỗn hợp chứa nhiều loại hợp chất có nhiều loại trọng lượng phân tử khác phải sử dụng loạt loại gel khác nhau, để loại tách riêng nhóm hợp chất có khoảng trọng lượng phân tử xác định Hạt gel có kích thước nhỏ tốt bảo đảm dịng chảy Trong thực tế người ta hay dùng loại gel mềm, gel nửa cứng gel cứng Gel mềm: hợp chất cao phân tử có số liên kết ngang khơng đáng kể Hệ có hệ số thể tích – tỷ số thể tích dung mơi gel với thể tích dung mơi ngồi gel – Với loại gel mềm trương thể tích tăng đáng kể Các loại gel sephadex, dextran, tinh bột, agar,… thuộc loại gel mềm Loại gel dùng để tách hợp chất có khối lượng phân tử thấp, hình thức thực kiểu lớp mỏng Loại gel nửa cứng: thường chế tạo phương pháp trùng hợp Loại gel dùng phổ biến sản phẩm đồng trùng hợp styrol đivinybenzen hay sản phẩm trùng hợp hóa vinylaxetat Hệ số thể tích gel từ 0,8 – 1,2 Khi trương, thể tích chúng tăng khơng nhiều (từ 1,2 đến 1,8 lần) Loại sắc ký gọi sắc ký gel xuyên thấu 192 Gel cứng: thường silicagel hay thủy tinh xốp với lỗ xốp có kích thước xác định Loại gel thực chất khơng phải gel Loại gel cứng có hệ số thể tích khơng lớn (0,8 – 1,1) Loại gel thường dùng sắc ký gel cao áp Loại cứng nên dễ nhồi cột, bền hơn, cho phép sử dụng khoảng rộng dung môi bao gồm nước, cân thiết lập nhanh dung môi mới, bền nhiệt độ cao Các loại silicagel hạt thủy tinh có kích thước lỗ trung bình khoảng 40 ÷ 2500 Å có sẵn thị trường Để giảm hấp phụ, bề mặt chất thường chuyển hóa chất hữu Những nhược điểm hạt silicagel có khuynh hướng lưu giữ chất tan hấp phụ có tiềm xúc tác cho phản ứng phân hủy phân tử chất tan 3.2.3.3 Các bước thực sắc ký gel Sắc ký gel thực cột hình ống trụ thủy tinh Nhồi gel vào cột Sử dụng cột thủy tinh Các hạt gel trương nở diện dạng huyền phù dung môi phù hợp cho vào cột theo kỹ thuật nhồi cột sệt Huyền phù chỉnh cho thật sệt rót vào cột chảy thành dịng dễ dàng Sau rót huyền phù gel vào cột, cân cột cách cho dung môi giải ly chảy ngang qua cột, lượng dung mơi tích 2-3 lần thể tích cột Vận tốc dịng chảy nhanh so với lúc thực nghiệm thực để tách chất Kiểm tra chặt chẽ cột cách cho lượng mẫu thử vào đầu cột Mẫu thử thường chọn dextran Blue 2000, có màu xanh dương, quan sát mắt thường di chuyển mẫu cột Thể tích dung dịch mẫu < 10% thể tích cột Cho dung mơi giải ly để đuổi hồn tồn lượng mẫu thử khỏi cột Nếu cột gel nạp chặt chẽ, mẫu thử khỏi cột dãy nằm ngang ngắn, dãy hẹp Cách thử giúp biết thể tích trống Vo cột thể tích dung mơi cần thiết để đuổi hợp chất 193 ... thơng qua chất trao đổi ion hiệu lực để khôi phục lại lực trao đổi 2HR + Ca2+ → CaR2 + 2H+ (nhựa trao đổi) CaR2 + 2H+ → 2HR + Ca2+ (hồn ngun) Tính acid, kiềm: tính chất Cationit RH Anionit ROH,... nhiệt cao, lại chứa lại nhóm chức nên dễ điều chỉnh mức liên kết ngang Sản phẩm thu sản phẩm tròn nhỏ nên thu? ??n tiện sử dụng Sản phẩm trùng hợp phổ biến trùng hợp styrene với divinylbenzene (DVB)... (IEC) coi ứng dụng chuyên sâu 3 .2. 2 .2 Bản chất trình sắc ký trao đổi ion Hình 3 .2 Quá trình tách sắc ký cột hai chất A B 181 Sắc ký trao đổi ion dựa tượng trao đổi thu? ??n nghịch ion linh động phân