Luận văn nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng actinoplanes sp kctc 9161

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HÀ THỊ TÂM TIẾN NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP KCTC 9161 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2013 i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hà Thị Tâm Tiến NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP KCTC 9161 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ THỊ TUYÊN PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội - 2013 ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tuyên, Phó trưởng phịng Cơng nghệ sinh học enzyme, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, sửa luận văn giúp đỡ tơi q trình thực đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Quang Huy, Phó trưởng khoa, Phụ trách Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tâp Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền Đình Thi, Trưởng phịng Cơng nghệ sinh học enzyme, Phó Viện trưởng Viện Cơng nghệ sinh học tạo điều kiện hóa chất, thiết bị, thời gian cho thực đề tài Tôi xin cảm ơn tập thể Phịng Cơng nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, tập thể Bộ môn Sinh lý thực vật hóa sinh, trường Đại học Khoa học tự nhiên, bảo, giúp đỡ tận tình cho tơi q trình thực nghiệm chia sẻ kinh nghiệm chuyên môn Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Hùng Vương, Phòng tổ chức cán bộ, Khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học Hùng Vương quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học hồn thiện đề tài luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đồng nghiệp giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên suốt thời gian học tập Hà Nội, tháng 11 năm 2013 Học viên Hà Thị Tâm Tiến iii MỤC LỤC MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG BIỂU viii DANH MỤC HÌNH VẼ ix BẢNG KÝ HIỆU CHỮ CÁI VIẾT TẮT xii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát acarbose .3 1.2 Cơ chế hoạt động acarbose 1.3 Vai trò acarbose 1.3.1 Vai trò acarbose bệnh đái tháo đường 1.3.2 Nghiên cứu tác dụng khác acarbose .8 1.4 Vai trò Actinoplanes sinh tổng hợp acarbose 1.4.1 Đại cương Actinoplanes 1.4.2 Chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 10 1.4.3 Ứng dụng Actinoplanes sản xuất acarbose 11 1.5 Nghiên cứu hoạt chất acarbose giới 12 1.5.1 Nghiên cứu sản xuất acarbose 12 1.5.2 Nghiên cứu ứng dụng đột biến vi sinh vật .16 1.5.3 Các phương pháp tinh thu nhận acarbose 17 1.5.4 Nghiên cứu sản xuất acarbose nước 20 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 2.1 Vật liệu hóa chất 23 2.1.1 Chủng giống 23 2.1.2 Hóa chất .23 2.1.3 Môi trường 23 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 24 iv 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Lên men chìm ni cấy vi sinh vật 25 2.2.2 Lựa chọn môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 25 2.2.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy .26 2.2.4 Ảnh hưởng nguồn carbon nitrogen nuôi cấy .26 2.2.5 Ảnh hưởng tốc độ lắc, nhiệt độ pH nuôi cấy 26 2.3 Gây đột biến NTG 26 2.4 Sắc ký lớp mỏng TLC .27 2.5 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose 27 2.6 Tách chiết tinh acarbose .28 2.6.1 Tách chiết tinh sơ .28 2.6.2 Tinh acarbose sắc ký cột .29 2.7 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 31 2.8 Sắc ký lỏng ghép khối phổ 31 2.9 Xác định cấu trúc phân tử acarbose cộng hưởng từ hạt nhân 31 2.10 Phương pháp xử lý số liệu 32 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy 33 3.2 Tối ưu thành phần môi trường điều kiện nuôi cấy 35 3.2.1 Ảnh hưởng thời gian .35 3.2.2 Ảnh hưởng nguồn maltose 37 3.2.3 Ảnh hưởng nguồn glucose .38 3.2.4 Ảnh hưởng nguồn bột ngô .40 3.2.5 Ảnh hưởng pH môi trường 41 3.2.6 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 42 3.2.7 Ảnh hưởng tốc độ lắc 43 3.2.8 Môi trường điều kiện nuôi cấy tối ưu 44 3.2.9 Xác định hàm lượng acarbose HPLC 45 v 3.3 Gây đột biến chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 46 3.4 Tinh acarbose có hoạt tính ức chế α-glucosidase 48 3.4.1 Chọn lựa phương pháp tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 48 3.4.1.1 Tinh sắc ký hấp thụ silica gel 48 3.4.1.2 Tinh sắc ký lọc gel sephadex G100 49 3.4.1.3 Tinh cột than hoạt tính 50 3.4.2 Chọn lựa phương pháp tinh acarbose từ dịch qua cột than 51 3.4.2.1 Tinh sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 51 3.4.2.2 Tinh sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose 51 3.4.3 Tinh thu nhận acarbose 52 3.4.4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase 55 3.5 Xác định cấu trúc hóa học acarbose 56 3.6 Quy trình tách chiết tinh acarbose 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .60 Kết luận 60 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO .61 PHỤ LỤC 68 vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 23 Bảng 2.2 Danh sách thiết bị thí nghiệm sử dụng 24 Bảng 2.3 Các môi trường khảo sát nghiên cứu .25 Bảng 3.1 Khối lượng chế phẩm qua bước tinh acarbose 55 vii DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc hóa học acarbose Hình 1.2 Cơ chế hoạt động acarbose ruột non Hình 1.3 Khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 11 Hình 3.1 Sắc ký đồ TLC mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trường lên men 33 Hình 3.2 Hoạt tính ức chế α-glucosidase môi trường lên men 34 Hình 3.3 Sắc ký đồ TLC mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo thời gian .35 Hình 3.4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo thời gian .36 Hình 3.5 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hưởng nồng độ maltose đến khả sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 37 Hình 3.6 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hưởng nồng độ glucose đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 39 Hình 3.7 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hưởng nồng độ bột ngô đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 40 Hình 3.8 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hưởng pH môi trường đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 41 Hình 3.9 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 43 viii Hình 3.10 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 43 Hình 3.11 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trường trước sau tối ưu 44 Hình 3.12 Sắc ký đồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 916 môi trường tối ưu 45 Hình 3.13 Sắc ký đồ TLC hoạt chất acarbose sinh tổng hợp từ dòng đột biến chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .47 Hình 3.14 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose sinh tổng hợp từ dòng đột biến chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 47 Hình 3.15 Sắc ký đồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men biến thể N217 gây đột biến từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 48 Hình 3.16 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 qua cột silica gel .49 Hình 3.17 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 qua cột sephadex G100 49 Hình 3.18 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 qua cột than hoạt tính 50 Hình 3.19 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose qua cột sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 51 Hình 3.20 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose qua cột sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose 52 Hình 3.21 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose qua cột than hoạt tính 52 Hình 3.22 Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ chuẩn acarbose 53 Hình 3.23 Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 54 ix Hình 3.24 Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ hoạt chất acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 54 Hình 3.25 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 sau qua cột tinh 55 Hình 3.26 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR hoạt chất acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 56 Hình 3.27 Phổ proton 1H-NMR hoạt chất acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 57 Hình 3.28 Cấu trúc phân tử acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 58 Hình 3.29 Qui trình tinh hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 59 x Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 3.6 Quy trình tách chiết tinh acarbose Từ liệu nghiên cứu trên, chúng tơi xây dựng quy trình tách chiết, tinh hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 quy mơ phịng thí nghiệm Dịch lên men (8 ngày) (1) Hịa vào than hoạt tính pH 3, khuấy giờ, để lạnh sau 12 giờ, rửa đến lần nước cất Hỗn hợp than hoạt tính dịch lên men (2) Nhồi lên cột Sắc ký cột than hoạt tính (Hệ dung mơi ethanol từ 5% đến 20%) (3) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, đặc 90% Sắc ký cột than hoạt tính (Hệ dung mơi ethanol từ 5% đến 15%) (4) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 90% Sắc ký cột amberlite XAD 1600T (Hệ dung môi gồm: acetone 10%) (5) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, đặc 20% Sắc ký cột amberlite IRA67 (Rửa nước) (6) Dịch acarbose tinh (7) Cô cạn kết tủa methanol acarbose Hình 3.32 Qui trình tinh hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 60 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Môi trường điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 gồm thành phần (g/l): 50 maltose, 30 glucose, 15 bột ngô, 1,0 monosodium glutamate, 2,0 CaCl2, 2,5 CaCO3, 1,0 K2HPO4 điều kiện pH 6,5, nhiệt độ 25oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút thời gian 192 giờ, cho suất đạt 9,98 g/l acarbose tăng gấp 3,4 lần so với trước tối ưu Khả ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose sinh từ Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trường tối ưu tăng 5,4% so với môi trường trước tối ưu, đạt 54,2% Đã tạo dòng đột biến N217 từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 có khả sinh tổng hợp acarbose cao, cho suất 10,94 g/l tăng 0,96 g/l so với chủng tự nhiên cho hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose đạt 52,8% tăng gấp 1,35 lần đối chứng Xây dựng quy trình tách chiết, tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 sử dụng kết hợp sắc ký cột than hoạt tính, sắc ký trao đổi cation amberlite XAD 1600T sắc ký trao đổi anion amberlite IRA67 Hiệu suất thu hồi acarbose đạt 73,1% Hoạt chất acarbose thu có băng đậm ngang chuẩn sắc ký đồ TLC (Rf = 0,28), có độ tinh 98% Hoạt tính ức chế α-glucosidase dịch acarbose tinh đạt 68,7% tăng 1,6 lần so với dịch lên men Kiến nghị Xây dựng quy trình lên men sản xuất acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 quy mô pilot Thử nghiệm, đánh giá chất lượng chế phẩm acarbose tạo ra, định hướng sản xuất thuốc điều trị đái tháo đường type Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 61 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bộ Y tế (2012), "Dược thư quốc gia Việt Nam 2", Công báo số 119, 1, tr 8-12 Lê Văn Chi (2004), "Tăng đường huyết sau ăn", Tạp chí Thơng tin Tim mạch học, 8, tr 37-42 Phạm Hữu Điển (2003), "Một số hợp chất thiên nhiên từ thực vật có tác dụng hạ đường huyết", Tạp chí Dược học, (7), tr 10-12 Nguyễn Lân Dũng (2006), Phân loại xạ khuẩn, Thư viện Học liệu mở Việt Nam, tr 1-11 Vũ Ngọc Lộ (2005), "Những dược liệu có tác dụng hạ đường huyết trị tiểu đường", Tạp chí Dược học, (353), tr 7-9 Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, NXB Giáo dục Việt Nam Nguyễn Thị Nương, Đỗ Thị Tun, Lê Thanh Hồng, Quyền Đình Thi (2013), "Nghiên cứu thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose Actinoplanes sp KCTC 9161" Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, 1, tr 403-406 Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hương, Đỗ Anh Vũ (2008), "Tác dụng hạ đường huyết dây thìa canh Gymnema sylvestre", Tạp chí Dược học, (391), tr 3133 Cơng Sơn, Thế Ân (2013), Phòng trị bệnh ung thư, tiểu đường, NXB Hồng Đức, Hà Nội 10 Quyền Đình Thi, Đỗ Thị Tuyên, Lê Thị Trang, Lê Thanh Hoàng (2012), "Nâng cao sinh tổng hợp acarbose từ dòng đột biến Actinoplanes VTCC-A1779", Tạp chí Hóa học, 50(5A), tr 113-116 11 Quyền Đình Thi, Vũ Văn Hạnh (2011), "Tuyển chọn chủng Bacillus sp sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase để điều trị bệnh đái tháo đường type 2", Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 9, tr 729-735 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 62 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 12 Hà Thị Tâm Tiến, Nguyễn Thị Nương, Đỗ Thị Tuyên, Quyền Đình Thi (2013), "Ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản đến sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp VTCC-A1779 biến thể", Tạp chí Y học Việt Nam, (2), tr 71-75 13 Đỗ Thị Tuyên, Lê Thanh Hoàng, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi (2011), "Sàng lọc số chủng Actinoplanes sp sinh tổng hợp cao chất acarbose có tính ức chế α-glucosidase", Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 9, tr 861-865 Tài liệu tiếng anh 14 Beenken KE, Hawkins AR, Frost JW, Brown KA (2012), "Impact of extracellular nuclease production on the phenotype of Staphylococcus aureus under in vitro and in vivo conditions", Infect Immun, 80(5), pp 1634-1638 15 Bischoff H (1994), "Pharmacology of alpha-glucosidase inhibition", Eur J Clin Invest, 24(3), pp 3-10 16 Blanch M, Calsamiglia S, Devant M, Bach A (2010), "Effects of acarbose on ruminal fermentation, blood metabolites and microbial profile involved in ruminal acidosis in lactating cows fed a high-carbohydrate ration", J Dairy Res, 77, pp 123-128 17 Bock K, Pedersen H (1984), "The solution conformation of acarbose", Carbohydrate Research, (132), pp 142-149 18 Cavalleri B, Pagani H, Volpe G, Selva E, Parenti F (1884), "A new antibiotic from Actinoplanes: fermentation, isolation and prelimilary physico-chemical characteristics", The Journal of Antibiotics, 37(4), pp 309-317 19 Choi BT, Shin CS (2003), "Reduced formation of by product component C in acarbose fermentation by Actinoplanes sp CKD 485-16", Biotechnol Prog, 19, pp 1677-1682 20 Cordero BF, Obraztsova I, Couso I, Leon R, Vargas MA, Rodriguez JF (2011), "Enhancement of lutein production in Chlorella sorokiniana by improvement of cuture conditions and random mutagenesis", MarDrugs, 9(9), pp 16071624 21 Couch JN (1950), "Actinoplanes, a new genus of the actinomycetales", Journal of the Elisha Michell Scientific Society, (66) Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 63 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 22 Dehghan P, Gagari BP (2013), "Efects of high performance inulin supplementation on glucemic status and lipid profile in women with type diabetes: A randomized, Placebo-controlled cilinical trial", Health Promotion Perspectives, 3(1), pp 55-63 23 Frommer W, Junge B, Muller L, Schmidt D (1979), "New enzyme inhibitors from microorganisms", Planta Med, 35(3), pp 195-217 24 Frommer W, Plus W, Schafer D, Schmidet D (1975), "Glycoside-hydrolase enzyme inhibitors", United States Patent, US 3876766 25 Hayashim T (2008), "The alpha-glucosidase inhibitor acarbose reduces the net electronegative charge of low-density lipoprotein in patients with newly diagnosed type diabetes", Clin Chim Acta, 390, pp 110-114 26 Hemker M, Stratmann A, Goeke K, Schroder W, Lenz JG, Piepersberg W, Paper H (2001), "Identification, cloning, expression and charecterization of the extracellular acarbose-modifying glycotransferase, AcbD from Actinoplanes sp strain SE50", Journal of Bacteriology, 183(15), pp 4484-4492 27 Hong CL, Kim KH, Choi BT, Choi S, Choi R (2003), "Process for preparing acarbose with high purity", United States Patent, US 6649755B1 28 Hu ZC, Zheng YG (2011), "Enhancement of 1,3-dihydroxyacetone production by a UV-induced mutant of Gluconobacter oxydans with DO control strategy", Appl Microbiol Biotechnol, 165(5-6), pp 1152-1160 29 Huh JH, Kim DJ, Zhao XQ, Li M, Jo YY, Yoon TM (2004), "Widespread activation of antibiotics biosynthesis by S-adenosylmethionine in Streptomycetes", FEMS Microbiol Lett, 238, pp 439-447 30 Jung H, Jeya M, Kim S, Kumar SR, Zhang Y, Lee J (2009), "Biosynthesis, biotechnological production, and application of teicoplanin: current state and perspective", Applied Microbiology and Biotechnology, 84(3), pp 417-428 31 Keri V, Deak L (2002), "Method for purification of acarbose", United States Patent, US 20020183262A1 32 Klein A, Selber K, Wehlmann H, Rosen W, Puhler A, Schwientek P, Kalinowski J, Wehmeier UF (2013), "New Actinomycete intergrative and conjugative element from Actinoplanes sp SE50/110 as plasmid for genetic Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 64 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên transformation of related Actinobacteria", International Publication Number, WO 2013/083566 A1 33 Lange PM, Rauenbusch E (1987), "Polymers for the purification of acarbose", United States Patent, US 4666776 34 Lechevalier H, Lechevalier M (1970), "In the Actinomycetales", Veb G Fisher, pp 393-405 35 Lee JS, Hai T, Paper H, Kim TJ, Suh JW (2008), "Three trehalose synthetic pathways in the acarbose-producing Actinoplanes sp SN223/29 and evidence for the Tre role in biosynthesis of component C", Appl Microbiol Biotechnol, 80(5), pp 767-778 36 Lee S, Saueribrei B, Niggemann J, Egelkraut E (1997), "Biosynthesic studies on the alfa-glucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp source of the maltose unit", J Antibiot (Tokyo), 50, pp 767-778 37 Lee SS, Egelkrout E (1998), "Studies on the a-glucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp.: glutamate is the primary source of the nitrogen in acarbose", J Antibiot, 51(11), pp 225-227 38 Li KT, Hou J, Wei SJ, Cheng X (2012), "An optimized industrial fermentation processes for acarbose production by Actinoplanes sp A56", Bioresource Technology, 118, pp 580-583 39 Lin CL, Huang TL, Chen JK, Wu CH (2007), "Purification process for manufacturing a high pure acarbose", United States Patent, US 7253278 B2 40 Lin CL, Huang TL, Chen JK, Wu CS (2005), "Purification process for manufacturing a high pure acarbose", United States Patent, US 20050118686A1 41 Mahmud T (2003), "The C7N aminocyclitol family of natural products", Nat Prod Rep, 20, pp 137-166 42 Mori Y, Shiozaki M, Matsuura K, Tanaka T, Yokoyama J, Utsunomiya K (2011), "Evaluation of efficacy of acarbose on glucose fluctuation and postprandial glucose using continuous glucose monitoring in type diabetes mellitus", Diabetes Technol Ther, 13, pp 467-470 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 65 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 43 Parenti F, Coronelli C (1979), "Member of the genus Actinoplanes and their antibiotics", Annual Review of Microbiology, 33(1), pp 389-341 44 Parenti F, Pagani H, Beretta G (1975), "Lipiarmycin, a new antibiotic from Actinoplanes", The Journal of Antibiotics, 28(4), pp 247-252 45 Rauenbush E (1990), "Highly pure acarbose", United States Patent, US 4904769 46 Rodriguez JF, Antonio DL, Manuel C, Fatima C (2008), "Application of ion exchange to purify acarbose from fermemtation broths", Biochemical Engineering, 40, pp 130-137 47 Schmidet DD, Frommer W, Junge B, Muller L, Wingender W, Truscheit E, Schafer D (1997), "Alpha-glucosidase inhibitors new complex oligosaccharides of microbial origin", Die Naturwissenschaften, 64(10), pp 535-536 48 Schwientek P (2012), "Genomics and Transcriptomics of the industrial Acarbose producer Actinoplanes sp SE50/110", Bielefeld University, Germany, 155 pages 49 Schwientek P, Szczepanowski R, Ruckert C, Kalinowski J, Klein A, Selber K, Wehmeier UF, Stoye J, Puhler A (2012), "The complete genome sequence of acarbose producer Actinoplanes sp SE50/110", BMC Genomic, 13(112), pp 18 pages 50 Shah MM, Cheryan M (1995), "Acetate production by Clostridium thermoaceticum in corn steep liquor media", J Ind Microbiol, 15, pp 424-428 51 Silveira MM, Wisbeck E, Hoch I, Jonas R (2001), "Production of glucose– fructose oxidoreductase and ethanol by Zymomonas mobilis ATCC 29191 in medium containing corn steep liquor as a source of vitamins", Appl Microbiol Biotechnol, 55 52 Sun LH, Li MG, Wang YS, Zheng YG (2012), "Significantly enhanced production of acarbose in fed-batch fermentation with the addition of Sadenosylmethionine", Microbiol Biotechnol, 22, pp 826-831 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 66 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 53 Truscheit E, Frommer W, Junge B, Muller L, Schmidet D (1981), "Chemistry and biochemistry of microbial a-glucosidase inhibitors", Angjewandte Chemie International Edition in English, 20(9), pp 744-761 54 Tsujino D, Nishimura R, Taki K, Morimoto A, Tajima N, Utsunomiya K (2011), "Comparing the efficacy of α-glucosidase inhibitors in suppressing postprandial hyperglycemia using continuous glucose monitoring: a pilot study-the major study", Diabetes Technol Ther, 13, pp 303-308 55 Ventura M, Canchaya C, Tauch A, Chandra G, Fitzgerald GF, Chater KF, Van Sinderen D (2007), "Genomics of Actinobacteria: tracing the evolutionary history of an ancient phylum", Microbiology and Molecular Biology Reviews, 71(3), pp 495-548 56 Wang Y, Yu L, Zheng YG, Wang YH, Shen YC (2013), "Acarbose isolation with gel type strong acid cation exchange resin: Equilibrium, Kinetic and Thermodynamic studies", ChinJChemEng, 21(10), pp 1106-1113 57 Wang YJ, Dong F, Yu L, Zheng YG (2012a), "Study on acarbose adsorption performance of cation exchanger SAC 001x7", ChinJChemEng, (3), pp 493498 58 Wang YJ, Liu LL, Feng ZH, Liu ZQ, Zheng YG (2011), "Optimization of media composition and culture conditions for acarbose production by Actinoplanes utahensis ZJB-08196", Microbiol Biotechnol, 27, pp 2759-2766 59 Wang YJ, Liu LL, Wang YS, Xue YP, Zheng YG, Shen YC (2012b), "Actinoplanes utahensis ZJB-08196 fed-batch fermentation at elevated osmolality for enhancing acarbose production", Bioresource Technology, 103, pp 337-342 60 Wehmeier UF (2003), "The biosynthesis and metabolism of acarbose in Actinoplanes sp SE 50/110", Biocatalysis and biotransformation, 21(4-5), pp 279-284 61 Wei SJ, Cheng X, Huang L, Li KT (2010), "Medium optimization for acarbose production by Actinoplanes sp A56 using the response surface methodology", African Journal of Biotechnology, 9, pp 1849-1854 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 67 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 62 Whistler RL, Durso DF (1949), "Chromatographic Separation of Sugar on Charcoal", Purdue University, 72, pp 667-679 63 Xue YP, Qin JW, Wang YJ, Wang YS, Zheng YG (2013), "Enhanced production of acarbose and concurrently reduced formation of impurity C by addition of validaminein fermentation of Actinoplanes utahensis ZJB-08196", BioMed Research International, pages 64 Yamaki K, Mori Y (2006), "Evaluation of α-glucosidase inhibitory activity in colored foods : a trial using slope factors of regression curves", Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 53(4), pp 229-231 PHỤ LỤC Bảng P1 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trường lựa chọn Môi trường Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Ức chế α-glucosidase (%) 68 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Lần Lần Lần Trung bình MT1 50,9 52,7 53,1 52,2 ± 1,2 MT2 42,3 47,1 45,8 45,1 ± 2,5 MT3 0 0 MT4 51,0 43,8 46,0 46,6 ± 4,1 MT5 49,2 51,0 53,0 51,0 ± 1,9 Bảng P2 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo thời gian Ức chế α-glucosidase (%) Thời gian (giờ) Lần Lần Lần Trung bình 48-72 0 0 96 19,1 15,9 20,8 18,6 ± 2,5 120 36,8 35,9 41,1 38,0 ± 2,9 144 51,9 44,7 42,0 46,2 ± 5,1 168 51,8 47,3 51,7 50,3 ± 2,6 192 57,3 52,5 55,8 55,2 ± 2,4 216 56,6 48,4 51,7 52,2 ± 4,1 Bảng P3 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo nồng độ maltose Ức chế α-glucosidase (%) Nồng độ maltose (g/l) Lần Lần Lần Trung bình 20 39,0 35,2 35,6 36,6 ± 2,1 30 50,8 48,5 47,7 49,0 ± 1,6 40 54,7 47,7 46,8 49,7 ± 4,3 50 54,8 50,4 50,4 51,9 ± 2,5 60 50,1 50,3 47,2 49,2 ± 1,7 Bảng P4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo nồng độ glucose Ức chế α-glucosidase (%) Nồng độ glucose (g/l) Lần Lần Lần Trung bình 10 28,1 27,7 32,1 29,3 ± 2,4 20 29,2 34,6 33,8 32,6 ± 2,9 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 69 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 30 41,0 42,7 45,6 43,1 ± 2,3 40 42,5 44,1 44,0 43,5 ± 0,9 50 43,8 43,9 45,5 44,4 ± 1,0 Bảng P5 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo nồng độ bột ngô Ức chế α-glucosidase (%) Nồng độ bột ngô (g/l) Lần Lần Lần Trung bình 24,7 24,2 26,4 25,1 ± 1,1 26,1 34,1 31,4 30,6 ± 4,0 10 50,9 50,2 45,5 48,9 ± 2,9 15 55,3 56,0 52,2 54,5 ± 2,0 20 48,2 48,4 52,7 49,8 ± 2,5 25 47,5 47,7 48,9 48,0 ± 0,8 Bảng P6 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo giá trị pH môi trường Ức chế α-glucosidase (%) Giá trị pH môi trường Lần Lần Lần Trung bình 6,0 39,6 35,6 40,1 38,4 ± 2,4 6,5 43,3 46,4 44,8 44,8 ± 1,5 7,0 42,9 39,6 40,3 40,9 ± 1,7 7,5 29,4 35,7 32,4 32,5 ± 3,2 8,0 31,9 29,2 34,1 31,7 ± 2,4 8,5 31,9 30,3 30,7 31,0 ± 0,8 Bảng P7 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy Ức chế α-glucosidase (%) (oC) Lần Lần Lần Trung bình 25 48,3 47,2 46,8 47,5 ± 0,7 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 70 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 28 40,3 45,1 43,3 42,9 ± 2,4 30 39,4 47,2 44,4 43,7 ± 3,9 37 41,0 46,1 43,7 43,6 ± 2,6 Bảng P8 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo tốc độ lắc nuôi cấy Ức chế α-glucosidase (%) Tốc độ lắc (vòng/phút) Lần Lần Lần Trung bình 100 42,6 41,0 45,5 43,0 ± 2,3 150 47,8 45,6 48,3 47,3 ± 1,4 200 47,3 47,3 44,5 46,4 ± 1,6 220 46,0 40,1 43,7 43,3 ± 3,0 Bảng P9 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 trước sau tối ưu Môi trường ưu Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Lần Trung bình Trước 48,5 49,5 48,5 48,8 ± 0,6 Sau 53,3 53,7 55,5 54,2 ± 1,2 Bảng P10 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Ức chế α-glucosidase (%) Mẫu Lần Lần Lần Trung bình Dịch lên men 39,3 46,1 43,2 42,9 ± 3,4 Cột than 16,7 17,5 15,2 16,5 ± 1,2 Cột amberlite IRA 400 22,1 18,4 20,5 20,3 ± 1,9 Cột DEAE-sepharose 33,7 28,9 28,3 30,3 ± 3,0 Cột than 57,1 57,9 59,1 58,0 ± 1,0 Dịch tinh 68,0 67,9 70,2 68,7 ± 1,3 Bảng P11 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men dòng đột biến từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Dòng đột biến Ký hiệu Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Ức chế α-glucosidase (%) Lần 71 Lần Lần Trung bình Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên ĐC TN 39,8 38,9 39,0 39,2 ± 0,5 N211 40,1 42,4 40,2 40,9 ± 1,3 N212 36,5 37,8 37,9 37,4 ± 0,8 N213 50,9 50,9 50,2 50,7 ± 0,4 N214 49,4 49,7 50,0 49,7 ± 0,3 N215 46,4 48,8 47,6 47,6 ± 1,2 N216 47,9 48,6 51,7 49,4 ± 2,0 N217 52,0 53,3 53,0 52,8 ± 0,7 N111 49,7 49,7 48,8 49,4 ± 0,5 N112 50,4 53,4 47,7 50,5 ± 2,9 10 N121 51,4 51,0 48,9 50,4 ± 1,3 11 N122 40,1 41,4 41,6 41,1 ± 0,9 12 N123 40,8 37,9 35,2 38,0 ± 2,8 13 N124 39,8 37,8 43,0 40,2 ± 2,6 14 N125 42,7 41,4 39,7 41,3 ± 1,5 15 N311 49,4 52,2 50,4 50,7 ± 1,4 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 72 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Hình P1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân COSY mẫu acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Hình P2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C13CPD DEPT mẫu acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 73 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Hình P3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân HMBC HSQC mẫu acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 74 ... NHIÊN Hà Thị Tâm Tiến NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP KCTC 9161 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC... hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 sau qua cột tinh 55 Hình 3.26 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR hoạt chất acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161. .. tăng khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng A utahensis ZJB-08196, sau 192 khả sinh tổng hợp acarbose cao nhất, đạt 6113 mg/l acarbose Thời gian thích hợp lên men chủng Actinoplanes sinh tổng hợp acarbose