ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HÀ THỊ MINH HUYỀN Tên đề tài KHẢO SÁT TÌNH HÌNH KHÁNG THUỐC CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH TẠI BỆNH VIỆN C THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HÀ THỊ MINH HUYỀN Tên đề tài: KHẢO SÁT TÌNH HÌNH KHÁNG THUỐC CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH TẠI BỆNH VIỆN C THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Đại học quy Chuyên nghành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2015-2019 THÁI NGUYÊN, NĂM 2019 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HÀ THỊ MINH HUYỀN Tên đề tài: KHẢO SÁT TÌNH HÌNH KHÁNG THUỐC CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH TẠI BỆNH VIỆN C THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Đại học quy Chuyên nghành : Công nghệ sinh học Lớp : K47 - CNSH Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2015-2019 Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Văn Duy CkI.ktyh Việt Tiến Dũng THÁI NGUYÊN, NĂM 2019 i LỜI CẢM ƠN Qua trình học tập rèn luyện Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên, đồng ý Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm em phân công đến thực tập Khoa Vi sinh - Bệnh viện C Thái Nguyên với đề tài: “Khảo sát tình hình kháng thuốc số vi khuẩn gây bệnh tạo Bệnh viện C Thái Nguyên” Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới CkI.ktyh Việt Tiến Dũng toàn thể kỹ thuật viên làm việc Khoa Vi sinh – Huyết Học Bệnh viện C Thái Ngun ln tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ em trình thực tập Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Văn Duy – Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em suốt trình thực đề tài Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn Thầy/cô Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên dạy dỗ, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu khoa học suốt thời gian học tập Với điều kiện thời gian có hạn kinh nghiệm kiến thức hạn chế nên đề tài em khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận bảo, đóng góp ý kiến q Thầy/cơ để em có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức phục vụ cho việc học tập, công việc sau Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2019 Sinh viên Hà Thị Minh Huyền ii DANH MỤC VÀ TỪ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Tên thuật ngữ Nghĩa đầy đủ thuật ngữ viết tắt Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens ANSORD (Mạng lưới giám sát nguyên kháng thuốc Châu Á) CDC Center for Control and Prevention (Trung Tâm Kiểm Sốt Phịng Bệnh Hoa Kỳ) CLSI Clinnical and Laboratory standards Institude (Viện Tiêu Chuẩn Xét Nghiệm) I KIA NTBV PCR R Intermediate (Trung gian) Kligler Iron Agar Nhiễm trùng bệnh viện Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Resistant (Đề kháng) RM Red Methyl (Methyl đỏ) S Suceptible (Nhạy cảm) VP WHO Voges-Proskauer World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1 Tỷ lệ loại vi khuẩn gây bệnh bệnh nhân điều trị Bệnh viện C Thái Nguyên 25 Bảng 4.2: Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm trùng bệnh viện theo lứa tuổi 27 Bảng 4.3: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Escherichia coli Bệnh viện C Thái Nguyên từ 01/01/2019 đến 30/5/2019 29 Bảng 4.4: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Staphylococcus aureus Bệnh viện C Thái Nguyên từ 01/01/2019 đến 30/5/2019 33 Bảng 4.5: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Streptococcus pneumoniae Bệnh viện C Thái Nguyên từ 01/01/2019 đến 30/5/2019 35 Bảng 4.6: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Bệnh viện C Thái Nguyên từ 01/01/2019 đến 30/5/2019 37 Bảng 4.7: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Klebsiella pneumoniae Bệnh viện C Thái Nguyên từ 01/01/2019 đến 30/5/2019 39 Bảng 4.8: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Acinetobacter baumannii Bệnh viện C Thái Nguyên từ 01/01/2019 đến 30/5/2019 41 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 4.1: Phân bố tình trạng nhiễm khuẩn theo lứa tuổi 27 Hình 4.2: Kháng sinh đồ vi khuẩn E coli phân lập bệnh nhân Trần Văn H ngày 23/03/2019 32 Hình 4.3: Kháng sinh đồ vi khuẩn S aureus phân lập bệnh nhân Nguyễn Hồng P ngày 14/03/2019 34 Hình 4.4: Kháng sinh đồ vi khuẩn S pneumoniae phân lập bệnh nhân Đặng Văn Đ ngày 18/02/2019 38 Hình 4.5: Kháng sinh đồ vi khuẩn P aeruginosa phân lập bệnh nhân Nghiêm Tuấn H ngày 19/04/2019 40 Hình 4.6: Kháng sinh đồ vi khuẩn A baumannii phân lập bệnh nhân Nguyễn Văn H ngày 25/02/2019 42 v MỤC LỤC Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1.Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1.Ý nghĩa khoa học đề tài 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.2.1 Định nghĩa kháng sinh chế tác động kháng sinh 2.2.1.1 Cơ chế tác động kháng sinh 2.2.2 Sự đề kháng kháng sinh vi khuẩn 2.3 Các phương pháp phát vi khuẩn kháng thuốc 10 2.3.1 Lấy bệnh phẩm 11 2.3.2 Nhuộm soi 11 2.3.3 Nuôi cấy 12 2.3.4 Xác định vi khuẩn 13 2.3.5 Kháng sinh đồ 16 2.3.6 Phương pháp giữ chủng vi sinh vật 18 Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Đối tượng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu 19 3.2 Nội dung nghiên cứu 19 3.3 Phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Phương pháp phân lập, xác định vi khuẩn lưu giữ chủng 19 3.3.2 Phương pháp: Kháng sinh đồ 23 3.4 Dụng cụ, hóa chất thiết bị sử dụng 23 3.5 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 24 vi Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Kết nghiên cứu tỷ lệ loại vi khuẩn gây bệnh bệnh nhân điều trị Bệnh viện C Thái Nguyên .25 4.2 Khảo sát tình hình kháng thuốc số loại vi khuẩn phân lập Bệnh viện C Thái Nguyên 28 4.2.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn Escherichia coli 29 4.2.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn Staphylococcus aureus 33 4.2.3 Tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn Streptococcus pneumoniae 35 4.2.4 Tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 36 4.2.5 Tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn Klebsiella pneumonae 39 4.2.6 Tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn Acinetobacter baumannii 41 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 5.1 Kết luận 44 5.2 Kiến nghị 45 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Thực trạng kháng kháng sinh mang tính tồn cầu, đặc biệt nước phát triển với bệnh truyền nhiễm chiếm tỷ lệ cao cấu bệnh tật như: Nhiễm khuẩn đường tiêu hố, đường hơ hấp, bệnh lây truyền qua đường tình dục nhiễm khuẩn bệnh viện Đây gánh nặng thực gia tăng chi phí phải bắt buộc thay kháng sinh cũ kháng sinh đắt tiền Việc kiểm soát loại bệnh chịu tác động bất lợi phát triển lan truyền tình trạng kháng kháng sinh vi khuẩn [36] Xu hướng kháng lại thuốc kháng sinh thường dùng, làm cho thuốc khơng cịn tác dụng lâm sàng, khơng cịn tác dụng tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Khi thuốc kháng sinh dùng điều trị cho người bệnh không tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Ngay sử dụng kháng sinh với nồng độ cao, thời gian kéo dài Việc kháng thuốc kháng sinh mối hiểm họa to lớn lẽ vi khuẩn gây bệnh thoải mái lộng hành, phát triển mà khơng cịn sợ hãi trước vũ khí người [36] Tuy nhiên, với đời thuốc kháng sinh việc sử dụng tự phát lạm dụng thuốc mức dẫn đến thực trạng vi khuẩn kháng thuốc ngày gia tăng Nhất nơi sử dụng thuốc kháng sinh nhiều tập trung nhiều bệnh nhân bệnh viện [15] Thực sự, vi sinh vật kháng kháng sinh mối đe dọa chung toàn cầu Bệnh viện C Thái Nguyên số bệnh viện khu vực Phía Đơng Bắc Việt Nam, tập trung nhiều bệnh nhân nặng tuyến cuối bệnh viện sở khu vực nên nơi nghi ngờ có khả kháng thuốc cao Nhiễm trùng bệnh viện không làm tăng thêm số ngày nằm viện, chi phí điều trị bệnh nhân mà cịn tăng nguy đa kháng thuốc, kháng sinh tăng tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân 2 - Vì vậy, tơi tiến hành thực đề tài “Khảo sát tình hình kháng thuốc số vi khuẩn gây bệnh tạo Bệnh viện C Thái Nguyên” Nhằm mục đích đánh giá thực trạng vi khuẩn kháng thuốc, cung cấp thơng tin tình hình gây bệnh tình hình kháng thuốc kháng sinh số vi khuẩn gây bệnh bệnh viện 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1.Mục tiêu tổng quát Khảo sát tình hình kháng thuốc số vi khuẩn gây bệnh Bệnh việc C Thái Nguyên 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Khảo sát tỷ lệ loại vi khuẩn gây bệnh bệnh nhân điều trị Bệnh viện C Thái Nguyên - Khảo sát tình hình kháng thuốc số vi khuẩn chủ yếu 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài - Kết nghiên cứu đề tài cung cấp nguồn tài liệu khoa học phục vụ cho nghiên cứu giảng dạy - Đánh giá thực trạng vi khuẩn kháng thuốc Bệnh viện C Thái Ngun cung cấp thơng tin tình hình gây bệnh tình hình kháng thuốc kháng sinh số vi khuẩn gây bệnh bệnh viện - Các khảo sát nguồn tài liệu tham khảo cho nghiên cứu thuộc lĩnh vực liên quan 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Xây dựng kháng sinh đồ cho bệnh nhân cụ thể giúp góp phần xây dựng chế độ hóa trị liệu liên quan cho bệnh nhân, góp phần hạn chế lây lan chủng vi khuẩn kháng thuốc cộng đồng 3 Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh 2.1.1 Tình hình nghiên cứu giới Nhiễm trùng bệnh viện mối lo ngại giới Hàng năm thống kê vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện khả kháng thuốc giới cập nhập quan tâm Theo nghiên cứu Pitt T L cộng năm 2003 Anh có tới 50% chủng P aeruginosa kháng Gentamycine, 39% kháng Ceftazidime, 32% kháng Piperacine 30% kháng Ciprofloxaxin (2003) [30] Theo nghiên cứu Pereira L.P năm 2004 đề kháng Ciprofloracine chí ghi nhận trẻ em người trưởng thành trước chưa sử dụng kháng sinh Quinolon Theo Báo cáo Pereira L.P năm 2004 Barbodas, Jamaica Trinidad, họ Enterobacteriaceae kháng Cephalosporin hàng [28] Theo báo cáo WHO năm 2008 đề kháng Acitrobacter với kháng sinh khác Aminoglucoside khoảng 20%, Ciprofloracine (30%), Ceftazidime (70%), Piperacine/Tazobactam (50%), Cefotaxime (89%) châu Âu, tỷ lệ kháng cao báo cáo vùng Địa Trung Hải bao gồm Hi Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Ý Nhật Bản [33] Theo báo cáo Adjei M A năm 2010 Úc (1992) Philippin (2001) Ciprofloracine báo cáo thất bại điều trị nhiễm khuẩn lậu cầu khuẩn [25] Các kháng sinh nhóm Carbapenem kháng sinh lựa chọn cuối điều trị nhiễm khuẩn theo báo cáo WHO vào năm 2010 Anh có xuất chủng kháng kháng sinh Carbapenem xảy từ năm 2000 với vi khuẩn Aciterobacter Giữa năm 2004 năm 2008 tỷ lệ đề kháng với Meropenem tăng từ 13 lên 29% [33] Theo báo cáo CDC năm 2011 Klebsiella E coli dần kháng với Carbapenems [34] Điều làm tăng mối lo ngại tình hình kháng kháng sinh giới 2.1.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam Ở Việt Nam có nhiều nghiên cứu kháng thuốc Theo báo cáo vào năm 2000-2001 Song J H cộng năm 2004 [32], tỷ lệ kháng Penicillin chiếm 71,4% Erythromycine 92,1% Streptococcus pneumoniae (nguyên nhân thường gặp gây nhiễm khuẩn hô hấp Việt Nam) ghi nhận cao số 11 nước mạng lưới giám sát nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORD) [11] Theo báo cáo khác phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh Việt Nam năm 2015 tỷ lệ đề kháng kháng sinh ghi nhận tăng đột biến theo thời gian, vào năm 1990 Thành phố Hồ Chí Minh có 8% chủng S pneumoniae kháng với Penicillin, đến năm 1990 - 2000, tỷ lệ tăng 56% xu hướng tương tự tỉnh phía Bắc Việt Nam [11] Một nghiên cứu khác vào năm 2000 - 2001, có tới 25% số vi khuẩn phân lập bệnh viện Thành phố Hồ Chí Minh đề kháng với kháng sinh Cephalosporin hàng Theo tổng kết Bộ Y tế năm 2004, phần lớn kháng sinh sử dụng thường xuyên bị kháng Ceftriaxone 70%, Ceftazidime 64%, Cipfloxacine 55% [17] Cũng theo kết nghiên cứu thực trạng kháng kháng sinh bệnh viện lớn Hà Nội (Việt Đức, Saint Paul, Bệnh viện 108, Bệnh viện Quân Y 103 Bùi Khắc Hậu cộng từ năm 2005-2008) [9] cho thấy P aeruginosa đề kháng có với kháng sinh Tetracyne (92,1%), Ceftriaxone (58,5%) Gentamycine (54%) Trong báo cáo sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh 15 bệnh viện Việt Nam năm 2008 - 2009 tình trạng kháng kháng sinh Việt Nam mức độ cao [11] Theo nghiên cứu 13 kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh Bệnh viện Thống Nhất Cao Minh Nga năm 2008 [16] P aeruginosa kháng cao với kháng sinh thường dùng nhóm Aminoglycid đó, Gentamicin (chiếm 62,9%), Amikacin (chiếm 49,0%), Imipenem (chiếm 36,1%) Các nghiên cứu khác có tới 75% chủng Pneumococci kháng với loại kháng sinh trở lên [26] Theo kết nghiên cứu công bố năm 2009 Le T M [27] cho thấy 42% chủng Enterobacteriaceae kháng với Ceftazidime, 60% kháng với Gentamycine 70% kháng với Nalidixic axit, tỷ lệ kháng cao ghi nhận người khỏe mạnh cộng đồng Cũng theo báo cáo năm 2011 Lý Ngọc Kính cộng [19] tình hình kháng thuốc số đơn vị điều trị tích cực tỷ lệ vi khuẩn kháng Gentamycine, Tobramycine kháng cao 50% với nhóm Quinolon, nhạy cảm với Vancomycine, Colistin, Carbapenem Theo báo cáo Trần Thị Lan Phương cộng năm 2008 S pneumoniae Acinetobacter vi khuẩn thường gây nhiễm trùng bệnh viện kháng với hầu hết kháng sinh thông thường [19] 2.2 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn 2.2.1 Định nghĩa kháng sinh chế tác động kháng sinh Định nghĩa kháng sinh đời: Theo Bộ Y tế năm 2015, Kháng sinh (antibiotic) chất kháng khuẩn tạo từ chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn…) có tác dụng ức chế phát triển vi sinh vật khác [3] Định nghĩa khác kháng sinh là: “Kháng sinh (antibiotic) hợp chất nồng độ thấp có khả ức chế, tiêu diệt vi khuẩn cách đặc hiệu, cách gây rối loạn phản ứng sinh học tầm phân tử (nồng độ thấp: nồng độ điều trị nhỏ nhiều lần so với liều độc với thể; đặc hiệu: kháng sinh có tác dụng loại vi khuẩn hay nhóm vi khuẩn)” [15] 2.2.1.1 Cơ chế tác động kháng sinh Kháng sinh có tác động vào nhiều trình ngăn cản trình vận chuyển thành phần tạo màng, ức chế enzyme tổng hợp yếu tố màng vi khuẩn Chúng làm rối loạn trình nhân lên vi khuẩn làm chúng nhân lên khơng có vách vách khơng hồn chỉnh dễ bị tiêu diệt điều kiện mơi trường xung quanh Ví dụ: Kháng sinh nhóm β-lactam, Vancomycin… Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn Các kháng sinh nhóm β-lactam, Fosfomycin Vancomycin ngăn cản sinh tổng hợp lớp peptidoglycan nên không tạo khung murein - tức vách khơng hình thành Tế bào sinh khơng có vách, vừa khơng sinh sản vừa dễ bị tiêu diệt bị li giải, đặc biệt vi khuẩn Gram (+) Như vậy, kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn với tế bào phát triển (degenerative bactericide) [24] Gây rối loạn chức màng bào tương Chức đặc biệt quan trọng màng bào tương thẩm thấu chọn lọc, bị rối loạn thành phần (ion) bên tế bào bị thoát nước từ bên ạt vào trong, dẫn tới chết, ví dụ Polymyxin B, Colistin Với chế tác động này, Polymyxin có tác dụng diệt khuẩn tuyệt đối (absolute bactericide) Tức giết tế bào nhân lên tế bào trạng thái nghỉ - không nhân lên [24] Ức chế tổng hợp axit nucleotic: gồm cấp độ - Ức chế tổng hợp DNA: Ngăn cản chép DNA tạo DNA con, ví dụ kháng sinh gắn vào enzym gyrase nên DNA khơng mở vịng xoắn, nhóm Quinolon [24] - Ức chế tổng hợp RNA: Ngăn cản sinh tổng hợp RNA, ví dụ gắn vào enzym RNA-polymerase rifampicin [24] - Ức chế sinh tổng hợp chết chuyển hóa cần thiết cho tế bào: Ví dụ sinh tổng hợp acid folic coenzym cần cho trình tổng hợp purin pyrimidin (và số acid amin) bị ngăn cản sufamid trimethoprim Trimethoprim sufamid tác động vào hai điểm khác chặng đường tổng hợp acid folic nên hai loại thuốc có tác dụng hiệp đồng (synergic) [24] Như vậy, kháng sinh tác động lên vị trí định thành phần cấu tạo, ảnh hưởng đến khâu định phản ứng sinh học khác tế bào vi khuẩn, dẫn đến ngừng trệ sinh trưởng phát triển tế bào [24] Nếu vi khuẩn không bị li giải không bị nắm bắt (thực bào) tiêu diệt, khơng cịn tác động kháng sinh (ngừng thuốc) vi khuẩn hồi phục/sống trở lại (reversible) Chỉ cần tế bào sống sót, với tốc độ sinh sản nhanh chóng, sau vài số lượng tế bào vi khuẩn đếm (ví dụ E coli 20 phút “đẻ lứa” sau giờ: từ tế bào mẹ - ban đầu phát triển thành 215 tế bào sau 10 lên đến tỷ); nguy hiểm tế bào sống sót đề kháng kháng sinh [24] Ức chế tổng hợp protein Tham gia tổng hợp protein ngồi ribosom cịn có mRNA tRNA Điểm tác động ribosom 70S vi khuẩn: Tại tiểu phần 30S ví dụ streptomycin (nơi RNA thông tin trượt qua), tetracylin (nơi RNA vận chuyển mang acid amin tới) tiểu phần 50S Erythromycin, Cloramphenicol kết phân tử protein khơng hình thành tổng hợp khơng có hoạt tính sinh học [24] 2.2.2 Sự đề kháng kháng sinh vi khuẩn 2.2.2.1 Định nghĩa phân loại đề kháng kháng sinh Kháng sinh có tác dụng ức chế tiêu diệt vi khuẩn mơi trường có kháng sinh mà vi khuẩn phát triển coi đề kháng kháng sinh [7] Kháng thuốc thật gồm kháng thuốc tự nhiên kháng thuốc thu Kháng thuốc tự nhiên: Một số lồi vi khuẩn định khơng chịu tác dụng số kháng sinh định, ví dụ Pseudomonas không chịu tác dụng penicillin G tụ cầu không chịu tác dụng colistin Những vi khuẩn khơng có vách Mycoplasma khơng chịu tác dụng kháng sinh ức chế sinh tổng hợp vách, ví dụ β-lactam [7] Kháng thuốc thu được: Do biến cố di truyền đột biến hay nhận dược gen đề kháng mà vi khuẩn từ không trở thành có gen đề kháng, tức từ nhạy cảm trở nên kháng kháng sinh [7] 2.2.2.2 Cơ chế kháng thuốc vi khuẩn Cơ chế kháng thuốc vi khuẩn đột biến gen nhận gen kháng thuốc Đột biến kháng thuốc phát sinh trước gặp mơi trường kháng sinh đột biết khơng kháng thuốc bị chết, cịn đột biết có trước biểu gen kháng lại Đột biến bước mức độ đề kháng kháng sinh không phụ thuộc vào nồng độ thuốc kháng sinh tiếp xúc sau lần tiếp xúc mà tính đề kháng cao Streptomycin, Lincomycin… Đột biến nhiều bước (mức độ đề kháng phụ thuộc vào nồng độ kháng sinh chúng trải qua nhiều lần đột biến đề kháng mạnh Penicillin, Chloramphenicol, Aminoglycoside… Tần suất xuất đột biến nhỏ khoảng từ 10-6 đến 10-11 [18] Nhận gen kháng thuốc Trong tế bào vi khuẩn có tồn phân tử DNA xoắn kép dạng vịng khép kín nằm ngồi nhiễm sắc thể vi khuẩn có khả tự chép plasmid Có loại plasmid kháng thuốc (plasmid R) plasmid mang nhiều gen mã hóa cho kháng với nhiều loại kháng sinh khác Chúng khơng có khả di truyền dọc từ hệ qua hệ khác mà cịn có khả di truyền ngang vi khuẩn qua q trình tiếp hợp Ngồi ra, vi khuẩn cịn có Transposon “gen nhảy” chứa nhiều đoạn gen, chúng có khả nhảy từ plasmid vào nhiễm sắc thể từ plasmid sang plasmid khác lúc vơ tình phương tiện chuyển gen kháng thuốc [18] Trong vi sinh y học có Transposon mang gen đề kháng Tn3 mang gen kháng Ampicillin, Tn5 mang gen kháng Kanamycin, Tn10 chứa gen kháng Tetraclin, Tn4 chứa gen kháng kháng sinh Ampicillin, Streptomycin, Sulfamid [7] Cơ chế lan truyền đề kháng Vi khuẩn mang gen đề kháng kháng sinh di truyền dọc truyền từ hệ ngày qua hệ khác truyền ngang từ vi khuẩn qua vi khuẩn khác Cơ chế lan truyền tế bào truyền từ phân tử DNA sang phân tử DNA khác tế bào, tế bào thơng qua hình thức tiếp hợp (là vận chuyển vật liệu di truyền từ vi khuẩn đực sang qua tiếp xúc nhau), biến nạp (là vận chuyển đoạn DNA từ vi khuẩn cho nạp vào vi khuẩn nhận), tải nạp (là vận chuyển vật liệu di truyền từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận qua phage) để chuyển gen đề kháng từ tế bào sang tế bào khác loài khác loài [13] Trong quần thể vi sinh vật chọn lọc tác dụng kháng sinh vi khuẩn đề kháng phát triển thay vi khuẩn nhạy cảm, quần thể đại sinh vật vi khuẩn đề kháng lây lan từ người sang người khác qua đường trực tiếp gián tiếp [13] Các chế kháng kháng sinh khác vi khuẩn a, Giảm tích lũy bên tế bào vi khuẩn Vi khuẩn làm giảm nồng độ thuốc kháng sinh bên tế bào chế sau: + Nhờ hệ thống bơm chủ động: Nồng độ kháng sinh tế bào giảm dần kháng thuốc vận chuyển tích cực khỏi tế bào vi khuẩn (sự đề kháng vi khuẩn với Tetracycline, Macroline, Quinolone) + Làm giảm tính thấm màng tế bào vi khuẩn vi khuẩn làm thay đổi kênh porin màng tế bào làm giảm tính thấm màng tế bào với kháng sinh nhóm β-lactam + Làm hệ thống vận chuyển qua màng kháng sinh khơng lọt vào tế bào vi khuẩn, đề kháng vi khuẩn với nhóm Aminoglycoside [13] b, Vi khuẩn tạo số enzyme làm biến đổi phá hủy cấu trúc hóa học phân tử kháng sinh: Một số vi khuẩn có khả đề kháng với số kháng sinh β-lactam nhờ enzyme β-lactamase enzyme có khả thủy phân vòng β-lactam thuốc kháng sinh Một số vi khuẩn kháng Chloramphenicol nhờ tiết enzyme Chloramphenicol acetyltransferase, enzyme gây tượng acetyl hóa phân tử Chloramphenicol khiến chúng khơng cịn khả bám vào tiểu phần 50S ribosom vi khuẩn [13] c, Làm thay đổi đích tác động nên kháng sinh khơng gắn vào đích: - Sự đề kháng vi khuẩn đột biến xảy tiểu phần β enzyme RNA-polymerase kháng Rifampicin - Vi khuẩn phế cầu kháng Penicillin G tụ cầu kháng Methicillin nhờ biến đổi phân tử protein gắn penicillin - Vi khuẩn đề kháng nhóm Quinolone đột biến gen mã hóa cho enzyme DNA gyrase nhiễm sắc thể vi khuẩn [13] d, Vi khuẩn tăng tổng hợp enzyme chuyển hóa để bù lượng enzyme bị kháng sinh tác động: Ví dụ: Vi khuẩn đề kháng với Trimethoprim nhờ tăng tổng hợp enzyme dihydrofolate reductsse [13] e, Vi khuẩn thay đổi đường chuyển hóa làm cho thuốc kháng sinh khơng tác động vào q trình chuyển hóa vi khuẩn 10 Vi khuẩn đề kháng với Sulfonamide số vi khuẩn không cần sử dụng PAPA tự tổng hợp mà chúng sử dụng PAPA sẵn có mơi trường [13] 2.2.2.3 Các biện pháp hạn chế gia tăng kháng kháng sinh Các biện pháp hạn chế gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh gồm: - Chỉ dùng kháng sinh để điều trị bệnh nhiễm khuẩn (những kháng sinh kháng khuẩn khơng có tác dụng với virus) - Chọn kháng sinh theo kết kháng sinh đồ: Nên ưu tiên kháng sinh có phổ hẹp, tác dụng đặc hiệu vi khuẩn gây bệnh khuếch tán tốt đến ổ vi khuẩn - Dùng kháng sinh đủ liều lượng thời gian (cho đợt điều trị) - Đề cao biện pháp khử trùng tiệt trùng, ngăn ngừa lan truyền vi khuẩn đề kháng - Liên tục giám sát kháng kháng sinh vi khuẩn để có chiến lược sử dụng kháng sinh hợp lý 2.3 Các phương pháp phát vi khuẩn kháng thuốc Để phát vi khuẩn kháng thuốc có nhiều phương pháp khác Trong phổ biến phương pháp sinh học phân tử kháng sinh đồ Trong phương pháp sinh học phân tử, kỹ thuật thường dùng PCR, multiplex PCR PCR (Polymerase Chain Reaction) hay gọi phản ứng chuỗi trùng hợp Kary Mullis phát minh năm 1980 trình nhân đoạn DNA lặp lặp lại nhiều lần Nếu ta có mồi phát gene kháng thuốc phù hợp với đoạn DNA kháng thuốc vi khuẩn qua phản ứng PCR nhanh chóng phát vi khuẩn kháng thuốc hay không Phương pháp thực nhanh chóng ngày có kết Multiplex PCR hình thức cải biên PCR sử dụng nhiều mồi để phát lúc với nhiều mẫu Tuy nhiên, việc chạy phản ứng PCR tốn chọn kháng sinh phù hợp với bệnh nhân cụ thể mà phương pháp kháng sinh đồ làm điều Kháng sinh đồ phương pháp phổ biến dùng bệnh viện, để chọn kháng sinh, nồng độ kháng sinh phù hợp với bệnh nhân điều trị Tuy nhiên phương pháp tốn thời gian Để thực kháng sinh đồ cần phân lập 11 vi khuẩn có bệnh phẩm Phân lập trình tách riêng loại vi khuẩn gây bệnh số nhiều vi khuẩn mẫu bệnh phẩm Để phân lập vi khuẩn cần trải qua bước sau: 2.3.1 Lấy bệnh phẩm Bệnh phẩm chất có chứa vi khuẩn gây bệnh lấy từ người bệnh Bệnh phẩm phân (trong nhiễm khuẩn đường ruột), máu (trong nhiễm trùng máu), chất dịch (dịch não tủy, dịch khớp gối, dịch màng bụng, dịch màng phổi), chất dịch hốc tự nhiên (dịch họng, dịch âm đạo) Để lấy bệnh phẩm kỹ thuật, phải đảm bảo nguyên tắc sau: - Đúng vị trí: Lấy nơi có biểu bệnh lý, viêm nhiễm nên lấy ranh giới nơi lành nơi tổn thương - Đúng thời gian: Lấy lúc bệnh phẩm có nhiều vi khuẩn chưa dùng kháng sinh - Phải vô khuẩn: Không để vi khuẩn nhiễm từ bên nhiễm vào bệnh phẩm làm cho sai kết không gây nhiễm khuẩn thêm cho bệnh nhân Bệnh phẩm lấy xong phải ghi đầy đủ họ tên người bệnh, khoa, tuổi, phịng điều trị… đóng gói quy cách gửi phòng xét nghiệm Bệnh phẩm cần chuyển làm xét nghiệm ngay, chưa có điều kiện phải giữ chúng mơi trường có dung dịch bảo quản nhiệt độ thích hợp để đảm bảo giữ vi khuẩn sống [7] 2.3.2 Nhuộm soi Đây phương pháp sơ đánh giá có mặt vi khuẩn mẫu bệnh phẩm, biết hình thái tính chất bắt màu vi khuẩn định hướng cho ni cấy, phương pháp vừa nhanh, vừa đơn giản, tốn [7] Phổ biến phương pháp nhuộm gram phát minh nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 - 1938) nhằm phân biệt thành vi khuẩn Gram (-) Gram (+) dựa cấu trúc thành tế bào Nguyên lý: Vi khuẩn Gram (+) có thành tế bào dày có nhiều lớp peptidoglucan chất có khả giữ phức hệ tím tinh thể-iot bắt màu tím 12 nhuộm vi khuẩn Gram Âm lại có lớp peptidoglucan mỏng giữ màu hồng fuchsin Sau nhuộm với tím Gentian, tinh thể màu tím bám vào lớp peptidoglucan cố định logul phức hợp tím tinh thể-iot bám chặt vào thành peptidoglycan sau dùng cồn tẩy vi khuẩn Gram (+) có màu tím hỗn hợp khử màu làm nước làm giảm khoảng trống phân tử nên tím tinh thể bám vào lớp peptidoglucan nên nhuộm với màu fuchsin khơng có vị trí để fuchsin bám vào lớp peptidoglucan Ngược lại, vi khuẩn Gram (-) tẩy cồn chúng có lớp peptidoglucan mỏng dù tím tinh thể bám vào tác dụng cồn bị tẩy tác dụng cồn tạo nên khoảng trống để fuchsin bám vào [7] 2.3.3 Nuôi cấy Vi khuẩn phát triển khác số môi trường khác Nếu nuôi vi khuẩn môi trường lỏng vi khuẩn phát triển làm đục mơi trường, cịn ni chúng mơi trường đặc mọc khuẩn lạc Khuẩn lạc tập hợp quần thể vi khuẩn phát triển từ vi khuẩn ban đầu Quan sát hình thái khuẩn lạc màu sắc, kích thước… nhận biết sơ vi khuẩn Có loại khuẩn chính: Khuẩn lạc R, S M Để ni cấy bệnh phẩm, thường nuôi cấy môi trường phân lập mơi trường ngồi chất dinh dưỡng cần thiết cịn có số chất khác có tác dụng ức chế kích thích chọn lọc vi khuẩn khác phát triển [7] Ví dụ: Bệnh phẩm phân ni cấy mơi trường DCL (Dezoxicolat Xitrat Lactoza) môi trường ức chế cầu khuẩn phát triển mơi trường có thành phần Xitrat Sau cấy phân cất tủ ấm 370C, 24h E coli có khuẩn lạc màu hồng, samolella, shigella có khuẩn lạc màu trắng Khi nuôi cấy vi khuẩn môi trường thạch máu quan sát có vịng tan huyết khơng có vi khuẩn có khả gây tan huyết Tan huyết khả sản xuất enzyme phá hủy hồng cầu gây tan máu Có dạng tan huyết tan huyết α (Vòng tan huyết khơng hồn tồn), β (Tan huyết hồn tồn) γ (Xung ...ĐẠI H? ?C THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI H? ?C NÔNG LÂM HÀ THỊ MINH HUYỀN Tên đề tài: KHẢO SÁT TÌNH HÌNH KHÁNG THU? ?C CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH TẠI BỆNH VI? ??N C THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI H? ?C. .. khuẩn gây bệnh Bệnh vi? ? ?c C Thái Nguyên 1.2.2 M? ?c tiêu c? ?? thể - Khảo sát tỷ lệ loại vi khuẩn gây bệnh bệnh nhân điều trị Bệnh vi? ??n C Thái Nguyên - Khảo sát tình hình kháng thu? ?c số vi khuẩn chủ... thu? ?c, cung c? ??p thơng tin tình hình gây bệnh tình hình kháng thu? ?c kháng sinh số vi khuẩn gây bệnh bệnh vi? ??n 1.2 M? ?c tiêu đề tài 1.2.1.M? ?c tiêu tổng quát Khảo sát tình hình kháng thu? ?c số vi khuẩn