BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỐI ƯU NẤM Trichoderma harzianum ĐỂ THU NHẬN ENZYME CHITINASE Ngành Công nghệ sinh học Chuyên[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỐI ƯU NẤM Trichoderma harzianum ĐỂ THU NHẬN ENZYME CHITINASE Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện: Trần Đức Vinh MSSV: 1051110243 Lớp: 10DSH02 TP Hồ Chí Minh, 7/2014 Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh giảng dạy kiến thức truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt năm đại học Tơi xin bày tỏ lịng cám ơn chân thành cô Nguyễn Thị Hai, người nhiệt tình, tận tụy dẫn dắt, động viên, tạo điều kiện tốt giúp đỡ kiến thức chuyên ngành để tơi hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cám ơn đến thầy Thành, người nhiệt tình hỗ trợ thiết bị, vật tư giúp đỡ tơi hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Tơi cám ơn bạn phịng thí nghiệm đặc biệt người bạn nhóm ESS động viên, giúp đỡ tơi Và cuối cùng, hết, xin cám ơn ba mẹ, người hết lòng lo lắng, vất vả để tạo điều kiện cho học đến thực ước mơ Con xin cám ơn ba mẹ nhiều Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các nội dung nghiên cứu kết đề tài trung thực chưa cơng bố cơng trình trước Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước nhà trường lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng năm 2014 Sinh viên thực Trần Đức Vinh Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .4 1.1 Giới thiệu Trichoderma .4 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Lịch sử phát triển 1.1.3 Đặc điểm chung Trichoderma 1.1.3.1 Đặc điểm hình thái .6 1.1.3.2 Đặc điểm sinh trƣởng 1.1.3.3 Các sản phẩm trao đổi chất Trichoderma 1.1.4 Vai trò sinh thái .10 1.1.5 Tính ứng dụng Trichoderma giới Việt Nam 10 1.1.6 Ứng dụng Trichoderma nông nghiệp .12 1.1.6.1 Bảo vệ thực vật .12 1.1.6.2 Cải thiện suất trồng 12 1.1.6.3 Trong xử lí mơi trƣờng 13 1.1.6.4 Trong công nghiệp thực phẩm 13 1.1.6.5 Bổ sung thức ăn cho chăn nuôi 14 1.2 Cơ chế kiểm soát sinh học Trichoderma spp 14 1.2.1 Cạnh tranh 14 1.2.2 Kí sinh .15 1.2.3 Bất hoạt enzyme nấm bệnh .16 1.2.4 Tăng khả kháng thực vật 16 1.3 Những nghiên cứu enzyme chitinase 17 1.3.1 Giới thiệu chitin 17 1.3.1.1 Cấu trúc tính chất chitin 17 i Đồ án tốt nghiệp 1.3.1.2 Lịch sử phát chitin .18 1.3.1.3 Sự phân bố chitin tự nhiên 19 1.3.1.4 Điều chế chitin 20 1.3.2 Giới thiệu enzyme chitinase 20 1.3.2.1 Đặc điểm phân bố 20 1.3.2.2 Cơ chế hoạt động chitinase 22 1.3.2.3 Các nguồn thu nhận chitinase 23 1.3.2.4 Lịch sử nghiên cứu chitinase 25 1.3.2.5 Ứng dụng enzyme chitinase .26 1.3.2.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến enzyme chitinase sinh tổng hợp enzyme chitinase từ vi sinh vật .28 1.3.2.7 Những nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện thu nhận enzyme chitinase từ Trichoderma harzianum Việt Nam giới .30 1.4 Sơ lƣợc bệnh thán thƣ ớt tác nhân gây bệnh Collectotrichum sp .32 1.4.1 Bệnh thán thư ớt .32 1.4.1.1 Triệu chứng .32 1.4.1.2 Nguyên nhân gây bệnh 33 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 34 2.1 Thời gian địa điểm 34 2.1.1 Thời gian 34 2.1.2 Địa điểm 34 2.2 Thiết bị- dụng cụ- vật liệu .34 2.2.1 Thiết bị dụng cụ 34 2.2.1.1 Thiết bị 34 2.2.1.2 Dụng cụ .34 2.2.2 Giống vi sinh vật sử dụng nghiên cứu 35 2.2.3 Môi trường sử dụng để nghiên cứu 35 2.2.3.1 Môi trƣờng PDA .35 2.2.3.2 Mơi trƣờng định tính sinh tổng hợp chitinase 36 ii Đồ án tốt nghiệp 2.2.3.3 Môi trƣờng sử dụng để nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme chitinase 36 2.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 38 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu khả sinh tổng hợp enyme chitinase Trichoderma 38 2.3.1.1 Phƣơng pháp nuôi cấy Trichoderma môi trƣờng thạch PDA 38 2.3.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu khả sinh tổng hợp chitinase Trichoderma môi trƣờng thạch .38 2.3.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử buồng đếm hồng cầu .40 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma để sản xuất chitinase 41 2.3.4 Phương pháp thu nhận dịch môi trường chứa chitinase 42 2.3.5 Xác định hoạt tính enzyme chitinase phương pháp DNS 42 2.3.6 Phương pháp tủa enzyme cồn 45 2.3.7 Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum .46 2.3.8 Khảo sát ảnh hưởng nguồn chất chitin đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum .46 2.3.9 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum .48 2.3.10 Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường ban đầu đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 49 2.3.11 Khảo sát ảnh hưởng nguồn đường hàm lượng đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 51 2.3.12 Phương pháp thử nghiệm khả ức chế nấm bệnh Collectotrichum sp .52 2.3.13 Phương pháp xử lí số liệu 53 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 53 3.1 Kết khả phân giải chitin Trichoderma harzianum môi trƣờng thạch có chất cảm ứng chitin 1% 53 3.2 Ảnh hƣởng thành phần môi trƣờng nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 55 3.3 Ảnh hƣởng nguồn chất chitin đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 60 iii Đồ án tốt nghiệp 3.4 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 62 3.5 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng ban đầu đến khả sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 65 3.6 Ảnh hƣởng nguồn đƣờng bổ sung đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 67 3.7 Hiệu khống chế nấm gây bệnh thán thƣ ớt chitinase thu từ Trichoderma harzianum 68 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 72 4.1 Kết luận 72 4.2 Kiến nghị 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DNS Dinitrosalicylic acid GlacNac N-acetyl glucosamine kDa Kilo Dalton MT Môi trƣờng NSC Ngày sau cấy PDA Potato D-glucose agar v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG STT BẢNG NỘI DUNG TRANG khả phân giải chitin Trichoderma 3.1 harzianum mơi trƣờng định tính sinh tổng hợp 56 chitinase Hoạt tính enzyme chitinase dƣới ảnh môi 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 Đƣờng kính vịng melanin qua ngày ni cấy mẫu thí nghiệm 70 3.8 Tỉ lệ phần trăm tản nấm bị phân giải qua ngày 80 trƣờng nuôi cấy Hoạt tính enzyme chitinase dƣới ảnh hƣởng nguồn chất cảm ứng Hoạt tính enzyme chitinase dƣới ảnh hƣởng ngày ni cấy Hoạt tính enzyme chitinase dƣới ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy Hoạt tính enzyme chitinase dƣới ảnh hƣởng nguồn dƣờng tỷ lệ đƣờng bổ sung vi 58 63 65 71 74 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH STT HÌNH NỘI DUNG 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 Cấu trúc phân tử chitin 20 1.6 Cơ chế hoạt động hệ enzyme chitinase 26 1.7 2.1 Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy môi trƣờng thạch dịch chiết khoai tây (PDA) Sợi nấm cuống bào tử Trichoderma harzianum Bào tử Trichoderma harzianum quan sát dƣới kính hiển vi quang học x100 Một số sản phẩm thƣơng mại ứng dụng Trichoderma spp Việt Nam giới Quả ớt bình thƣờng ớt bị bệnh thán thƣ Collectotrichum spp Buồng đếm hồng cầu Neubauer TRANG 10 11 14 35 43 Vịng phân giải chitin T harzianum mơi 3.1 trƣờng dinh dƣỡng chứa chitin 1% sau ngày nuôi 54 cấy 10 3.2 11 3.3 Biểu đồ cột thể thay đổi hoạt tính chitinase theo môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng A, B trƣớc ủ sau ủ ngàyvới bào tử Trichoderma harzianum vii 55 58 Đồ án tốt nghiệp 12 3.4 13 3.5 14 3.6 15 3.7 16 3.8 17 3.9 Môi trƣờng C, D trƣớc ủ sau ủ ngày với bào tử Trichoderma harzianum Biểu đồ cột thể thay đổi hoạt tính chitinase theo chất cảm ứng Biều đổ đƣờng thể biến đổi hoạt tính chitinase theo thời gian nuôi cấy Biểu đồ cột thể thay đổi chitinase theo pH môi trƣờng ban đầu Mặt sau (a) mặt trƣớc (b) tản nấm Collectotrichum sp sau ngày ủ với enzyme chitinase Mặt sau (c) mặt trƣớc (d) tản nấm Collectotrichum sp sau ngày ủ với enzyme chitinase viii 59 60 63 65 77 77 Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết đề tài Trichoderma spp tác nhân kiếm sốt sinh học có hiệu quả, có nhiều nghiên cứu cho thấy khả đối kháng chúng với loài nấm hại thực vật chế khác Trong số đó, chế sinh tổng hợp enzyme ngoại bào có vai trị quan trọng, đặc biệt hệ enzyme chitinase Đây hệ enzyme có khả phân hủy chitin- thành phần cấu tạo nên vách tế bào đa số loài nấm hại trồng kể trùng, từ ức chế phát triển dịch bệnh Ngoài ra, chitinase cịn nhiều ứng dụng có ý nghĩa khác nhƣ dùng để xúc tác để tạo hợp chất có tác dụng giúp tăng sản xuất dịch nhầy, cải thiện khả bôi trơn khớp để giảm triệu chứng thối hóa khớp, để tổng hợp hợp chất chitooligosaccharides… Trong lồi Trichoderma spp Trichoderma harzianum đƣợc chứng minh có khả sinh tổng hợp chitinase tốt (Theo M.H Et-Katatny, 2000) Hiện nay, dân số ngày gia tăng cách nhanh chóng, nhu cầu lƣơng thực gia tăng theo Song khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa nhƣ Việt Nam lại đa dạng loại nấm bệnh gây hại thực vật chúng phát triển nhanh nhiệt độ độ ẩm thuận lợi này, gây nhiều khó khăn cho việc trồng trọt ảnh hƣởng đến bảo quản sau thu hoạch Để bảo vệ suất trồng chất lƣợng nông sản sau thu hoạch, nông dân sử dụng chất hóa học để ngăn cản công nấm bệnh Ngay cà dùng thuốc diệt nấm chuyên dụng hàng năm giới nấm bệnh thực vật gây thiệt hại 15% sản lƣợng thu hoạch Hơn nữa, sử dụng thuốc hóa học cách chủ quan lại dao hai lƣỡi, chất hóa học nguy tiềm tàng mà ngày nhà khoa học phát chúng gây bệnh ung thƣ số bệnh lý nguy hiểm khác Để khắc phục vấn đề này, nhà khoa học nghiên cứu thời gian dài tìm đƣợc chìa khóa thích hợp Đó hợp chất sinh Đồ án tốt nghiệp học, thân thiện với môi trƣờng nhƣ không ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời Và hợp chất sinh học ứng dụng enzyme chitinase, đƣợc sinh từ số vi sinh vật định Xuất phát từ vấn đề trên, sinh viên định thực đề tài “Xác định số điều kiện nuôi cấy tối ƣu nấm Trichoderma harzianum để thu nhận enzyme chitinase.” Mục đích nghiên cứu Tìm đƣợc điều kiện nuôi cấy tối ƣu để thu nhận enzyme chitinase từ Trichoderma harzianum Nội dung nghiên cứu Định tính khả sinh tổng hợp chitinase từ chủng Trichoderma harzianum Khảo sát ảnh hƣởng thành phần môi trƣờng, thời gian nuôi cấy đến tổng hợp chitnase từ Trichoderma harzianum Khảo sát ảnh hƣởng số nguồn chất cảm ứng, pH môi trƣờng, nguồn đƣờng bổ sung đến khả sinh hoạt tính enzyme chitinase Hiệu khống chế nấm gây bệnh thán thƣ ớt chitinase thu từ Trichoderma harzianum Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Phần mềm thống kê, tính tốn - Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010 - Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lý số liệu 4.2 Kết đạt đề tài - Tìm đƣợc điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho chủng Trichoderma harzianum sinh tổng hợp chitinase Đồ án tốt nghiệp Kết cấu đồ án - Chƣơng 1: Tổng quan - Chƣơng 2: Vật liệu phƣơng pháp - Chƣơng 3: Kết biện luận - Chƣơng 4: Kết luận đề nghị Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Trichoderma Trichoderma số vi nấm có lợi, điều đƣợc chứng minh chúng đƣợc sử dụng nhƣ tác nhân kiểm soát sinh học nấm gây bệnh (Chet, 1987; Chet et al., 1998) Trichoderma phát triển mạnh thảm thực vật Trichoderma chi nấm diện đất, chúng phát triển nhiều loại chất khác (gỗ, loài nấm khác…), nhiều loài chi có khả sống cộng sinh với Có thể nói Trichoderma số lồi vi nấm đƣợc ni cấy thơng dụng Chúng đƣợc tìm thấy khắp nơi trừ vĩ độ cực Nam cực Bắc Nấm Trichoderma phổ biến khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, chúng diện rễ cây, đất hay xác sinh vật chết, xác bã hữu hay kí sinh lồi nấm khác Mỗi dịng nấm Trichoderma khác yêu cầu nhiệt độ độ ẩm khác (Harman, 2000) Khi cộng sinh với cây, Trichoderma giúp tránh đƣợc khỏi xâm hại loài nấm gây bệnh khác chế nhƣ công, ký sinh lấy chất dinh dƣỡng từ loài nấm hại khác Và yếu tố quan trọng để giúp chúng xâm nhập vào bên nấm hại khả sinh tổng hợp hệ enzyme ngoại bào Đồ án tốt nghiệp 1.1.1 Phân loại Giới (Kingdom): Nấm (Fungi) Ngành (Phylum): Nấm túi (Ascomycota) Lớp (Class): Sordariomycetes Phân lớp (Subclass): Hypocreomycetidae Bộ (Order): Hypocreales Họ (Family): Hypocreaceae Chi (Genus): Trichoderma Loài (Species) : Trichoderma spp 1.1.2 Lịch sử phát triển Chủng nấm Trichoderma đƣợc phát Persoon vào năm 1794, vào thời điểm ông mô tả đƣợc loài: 1- Trichoderma caesium Pers (1794) 2- Trichoderma nigrescens Pers (1794) 3- Trichoderma viride var viride Pers (1794) Cho đến năm 1801, Persoon Gray mô tả chi tiết đƣợc lồi nấm Trichoderma là: 1- Trichoderma caesium Pers (1794) 2- Trichoderma nigrescens Pers (1794) 3- Trichoderma viride var viride Pers (1794) 4- Trichoderma aureum Pers (1796) Đồ án tốt nghiệp 5- Trichoderma laeve Pers (1796) 6- Trichoderma dubium Pers (1801) 7- Trichoderma fuliginoides Pers (1801) Trong suốt kỷ đến năm 1999 nhà khoa học giới phát thêm khoảng 90 loài Từ năm 2000 trở lại phát thêm khoảng 50 loài Cho đến năm 2013, có 150 lồi nấm Trichoderma đƣợc mô tả 1.1.3 Đặc điểm chung Trichoderma 1.1.3.1 Đặc điểm hình thái Hình 1.1: Khuẩn lạc Trichoderma harzianum ni cấy môi trƣờng thạch dịch chiết khoai tây (PDA) (Nguồn: http://www.lookfordiagnosis.com) Chủng nấm Trichoderma spp thuộc nhóm nấm bất tồn (là nấm sinh sản vơ tính bào tử bụi mang giá bào tử có hình dạng khác xếp thành chuỗi (đính bào tử) đầu có cuống bào tử), có khuẩn lạc màu lục tăng trƣởng có diện ánh sáng mặt trời Sợi nấm Trichoderma phân nhánh mạnh, thƣờng hình thành dạng gần nhƣ vịng trịn đồng tâm Các sợi nấm thƣờng mọc tạo góc với trục khoảng 90 độ Đồ án tốt nghiệp Khuẩn ty vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, cuối nhánh phát triển thành khối trịn mang bào tử trần khơng có vách ngăn, không màu liên kết với thành chùm nhỏ đầu cành nhờ chất nhầy Hình 1.2: Sợi nấm cuống bào tử Trichoderma harzianum (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Trichoderma) Bào tử nấm Trichoderma mịn, trơn láng có màu xanh màu vàng Bào tử hầu hết lồi có hình elip, 3-5 x 2-4 µm (L/W=1.3), bào tử hình cầu (L/W