An NINH SứC KHOẻ TOàN CầU CảNH BáO Và ĐốI phó với dịch Sản xuất lô thử nghiệm vắc xin cúm bất hoạt từ phân tuýp có nguồn gốc từ vi rút cúm gia cầm Đánh giá tạm thêi rđi ro vỊ an toµn sinh häc Tỉ Chøc Y Tế Thế Giới Bộ phận giám sát đối phó với bệnh truyền nhiễm Chơng trình chống cúm toàn cầu WHO Sản xuất lô thử nghiệm vắc xin cúm bất hoạt từ phân tuýp có nguồn gốc từ vi rút cúm gia cầm Đánh giá tạm thời rủi ro an toàn sinh học Tổ chức Y tế Thế giới Bộ phận giám sát ®èi phã víi c¸c bƯnh trun nhiƠm Tỉ chøc Y tế Thế giới 2003 Cách định danh trình bày tài liệu không mang ngụ ý nµo cđa Tỉ chøc Y tÕ ThÕ giíi vỊ thực trạng pháp lý quốc gia, lÃnh thổ, khu vực hay quyền, nh đờng biên giới Những đờng phân khu đồ tơng đối không hoàn toàn xác Việc sử dụng tên số công ty sản phẩm số nhà sản xuất không ngụ ý Tổ chức Y tế Thế giới đề nghị hay xác nhận u việt công ty hay sản phẩm so với công ty sản phẩm không đợc nhắc đến Ngoại trừ trờng hợp bỏ quên sai sót, tên sản phẩm độc quyền đợc biểu thị chữ đầu viết hoa Tổ chức Y tế Thế giới không đảm bảo thông tin tài liệu hoàn đầy đủ xác, đó, không chịu trách nhiệm cho hậu gây việc sử dụng tài liệu Đánh giá tạm thời rủi ro an toàn sinh học 11/2003 Chơng trình chống cúm toàn cầu WHO Mục Lục Giíi thiƯu 2 Phạm vi đánh giá rủi ro .2 Ph©n lËp vi rót Thử nghiệm khả gây bệnh .3 S¶n xuÊt v¾c xin .3 Xác định nguy c¬ 6.1 Nguy c¬ víi vi rót nhËn 6.2 Nguy phát sinh tõ s¶n phÈm gien cÊy 6.3 1.3 Nguy phát sinh thay đổi đặc tính sinh bệnh có 6.4 Những nguy gây nên chuyển thành vi sinh vật họ 6.5 Khả gây hại cho sức kh ng−êi 7 ấn định cấp độ bảo vệ t¹m thêi Tính chất công việc cân nhắc biện pháp quản lý nhằm bảo vệ søc kh ng−êi 10 Các nguy môi trờng biện pháp khống chế thêm cần thiết Tài liệu tham khảo .10 Phụ lục 1: Thử nghiệm suy giảm chủng vắc xin động vật có vú 12 Thư vi rót .12 Trang thiÕt bÞ thÝ nghiƯm .12 Chån s−¬ng 12 Chuét .13 Phụ lục 2: Các đối tác tham gia 15 Đánh giá tạm thời rủi ro an toàn sinh học 11/2003 Chơng trình chống cúm toàn cầu WHO Giới thiệu Các vi rút cúm gia cầm1 có tính gây bệnh cao đà gây ca nhiễm bệnh H5N1 ngời Hồng Công năm 1997 vµ 2003, vµ H7N7 ë Hµ Lan Nãi chung, tiÕp xúc thờng xuyên với vi rút cúm từ loài động vật lông vũ hoang dà gia cầm có khả gây nên nguy đại dịch Cùng với biện pháp thú y phơng thức hoạt động trang trại, giới nỗ lực tìm kiếm biện pháp dự phòng cấp bách cho cúm đại dịch Những biện pháp bao gồm việc phát triển nhanh chủng vắc xin an toàn có khả nuôi cấy trứng gà tế bào động vật có vú có cảnh báo đại dịch, sản xuất loại vắc xin đáp ứng nhu cầu dịch tễ Hệ gien vi rút cúm có phân đoạn Mặc dï cã thĨ dïng mét vi rót chim hoang khả gây bệnh, phân tuýp phát triển nhanh dờng nh sở để phát triển vắc xin cho đại dịch Khi phân tuýp đợc sử dụng, có khả chứa prôtêin HA (haemagglutini) NA (neurraminidase) từ vi rút ngời chim/gia cầm, prôtêin lại từ vi rút cúm ngời, chẳng hạn A/PR/8/34(H1N1) Nếu đà có sẵn vi rút không gây bệnh phù hợp, phân tuýp đợc tạo cách thông thờng Trong trờng hợp sẵn vi rút không gây bệnh phù hợp, vi rút làm vắc xin phân tuýp chứa HA vi rút cúm có khả gây bệnh cao, nơi mà gien HA bị cải biến để loại bỏ axít amin đa bazơ chuỗi liên kết peptit HA Sự cải biến HA loại bỏ yếu tố gây bệnh cao Các phân tuýp đợc sản xuất di truyền nghịch công nghệ plasmit 12 plasmit Hệ plasmit: plasmit mà plasmit mà hoá gien vi rút cúm, hoạt động dới điều khiển hÖ Pol I- Pol II HÖ 12 plasmit: plasmit mà plasmit mà hoá mộtt gien vi rút cúm hoạt động dới điều khiĨn cđa hƯ pol I plasmit sÏ biĨu thÞ prôtêin PB1, PB2, PA NP Phạm vi đánh giá rủi ro Tài liệu đợc trung tâm hợp tác nghiên cứu tra cứu cóm cđa tỉ chøc y tÕ thÕ giíi ph¸t triĨn, trung tâm cúm quốc gia đối tác khác (danh sách đối tác xin xem phụ lục 2) Văn phác thảo đà đợc gửi đến hội viên cúm toàn giới Còn gọi cúm gà cúm chim A/PR/8/34 (H1N1) Danh pháp quốc tế quy định nguyên tắc đặt tên phân tuýp: tuýp vi rút _ địa phơng phân lập đợc vi rút_ số thứ tự theo dõi_ năm phân lập vi rút _ công thức kháng nguyên H N Ngoài gặp thích phân tuýp vi rút loài, nh chim, lợn ngựa (Chú thích ngời dịch) 2 Đánh giá tạm thời rủi ro an toàn sinh học 11/2003 Chơng trình chống cúm toàn cầu WHO bao gồm 1600 chuyên gia cúm đồng nghiệp khác viện hàn lâm, tổ chức cấp phép quốc gia, hÃng sản xuất dợc phẩm, viện nghiên cứu quan tâm đến giám sát phòng chống cúm để thảo luận Chúng đà thu đợc nhận xét cụ thể từ 40 cá nhân, tổ chức công ty dợc phẩm Những nhận xét, đánh giá đợc biên tập thống thành văn cuối Sự tạo thành phân tuýp có nguồn gốc từ vi rút cúm chim có khả gây bệnh cao đợc tiến hành dới điều kiện BSL3+ Sau đợc kiểm tra không gây bệnh, phân tuýp sẵn sàng để nhà sản xuất vắc xin sản xuất hàng loạt vắc xin thí điểm dành cho thí nghiệm nghiên cứu Đánh giá rủi ro tức thời nhằm hớng dẫn nhà sản xuất vắc xin biện pháp an toàn sinh học, nhiên, nhà sản xuất nên tự chuẩn bị đánh giá rủi ro riêng sở cân nhắc công việc thờng ngày, biện pháp khống chế an toàn sinh học, biện pháp quản lý môi trờng địa phơng Các ví dụ đợc sử dụng đánh giá rủi ro cho dự án phát triển vắc xin H5N1, nhiên, chúng đợc áp dụng cho sản xuất vắc xin từ vi rút mang bệnh Khi có thêm thông tin, đánh giá rủi ro đợc cập nhật, trờng hợp sản xuất vắc xin với quy mô lớn đánh giá rủi ro đợc xem xét lại cho phù hợp Phân lập vi rút Vi rút đợc phân lập từ truyền plasmit dòng tế bào Vero (dòng đà đợc chuẩn y để sản xuất vắc xin cho ngời) Các vi rút phân tuýp chứa prôtêin nội gien vi rút PR8, prôtêin NA đoạn prôtêin HA đà đợc cải biến vi rút gia cầm Vi rút sau đợc nuôi cấy trứng gà tế bào động vật có vú Thử nghiệm khả gây bệnh Khả gây bệnh vi rút đợc kiểm tra gà chồn sơng (phụ lục 1) Chuột đợc sử dụng, tuỳ thuộc vào khả gây bệnh vi rút cúm chim cho chuột Sản xuất vắc xin Mỗi công ty mô tả ngắn gọn trình sản xuất Xác định nguy c¬ 6.1 Nguy c¬ víi vi rót nhËn Vi rót cúm nhận chủng PR8 từ ngời Đây vi rút đà qua cấy chuyển nhiều lần chuột, chồn sơng trứng gà Kết cấy chuyển làm cho vi rút hoàn toàn khả nhân lên hoàn toàn bị suy yếu ngời Lý chọn PR8 có khả phát triển nhanh, tế bào động vật có vú phôi gà Từ cuối năm 1960, vi rút PR8 đà đợc sử dụng để sản xuất phân tuýp phát triển nhanh tổ hợp với chủng vắc xin cúm A thịnh hành Hơn nữa, sử dụng phân tuýp làm chủng vắc xin đà tăng sản lợng vắc xin lên nhiều lần Những phân tuýp đợc sản xuất tổ hợp vi rút PR8 có trứng gà chủng vắc xin hệ thống chọn lọc dựa vào việc sử dụng kháng thể chống PR8 phát triển pha loÃng cao Đánh giá tạm thời rủi ro an toàn sinh học 11/2003 Chơng trình chống cúm toàn cầu WHO Cha có rủi ro cho sức khoẻ ngời gây vi rút PR8 đợc công bố 6.2 Nguy phát sinh từ sản phẩm gien cấy Các sản phẩm gien cấy HA đợc cải biến NA vi rút H5N1 HA đợc cải biến cho a xít amin đa bazơ chuỗi liên kết peptit HA a xít amin đơn bazơ Bản thân prôtêin cúm không lây nhiễm gây hại 6.3 1.3 Nguy phát sinh thay đổi đặc tính sinh bệnh có Prôtêin dạng gai HA có tính đặc hiệu với điểm tiếp nhận (receptor) a xít sialic phân tử bề mặt tế bào Sự có mặt HA vi rút cúm A ngời có tính gắn với điểm tiếp nhận chứa gốc a xít sialic α-2, (Rogers vµ D’Souza 1999)3, vi rót cúm gia cầm tạo tính gắn với a xít sialic qua liên kết -2, Các tế bào khí quản ngời chứa chủ yếu gốc có liên kết -2, (Nelson tác giả khác 1993), đó, vi rút PR8 có đợc HA gia cầm giảm tối thiểu khả gắn với tế bào biểu mô hệ hô hấp Mặc dù tính đặc hiệu receptor 2,3 vi rút cúm chim giảm khả gắn với tế bào biểu mô hô hấp ngời, điều nghĩa phòng hoàn toàn nhiễm ngời Năm 1991, Beare Webster đà thành công gây nhiễm số vi rút cúm chim khác cho tình nguyện viên, dù vi rút nhân lên không đáng kể Beare Webster nhận thấy để nhân lên thể ngời xảy ra, cần lợng cực lớn vi rút cúm chim (từ 106.8 đến 109.2 liều gây nhiễm trứng gà), khả bị nhiễm cúm chim từ ngời qua ngời khó Vào năm 1997, sù nhiƠm vi rót cóm chim H5N1 ë ng−êi ®· xảy Hồng Công, chép trờng hợp đà thành công hơn, nhng nguyên nhân có lẽ tính độc vi rút Hồng Công ngời tiếp xúc với lợng lớn vi rút H5N1 phân chứa vi rút , lý để có trun vi rót tõ chim sang ng−êi Tuy nhiªn nghiên cứu thực nghiệm, truyền bệnh từ ngời qua ngời vi rút H5N1 năm 1997 hÃn hữu Đây trờng hợp xảy víi trun bƯnh cđa vi rót cóm chim H9N2 cho ngời năm 1999 với mức độ Vì cã thĨ kÕt ln r»ng sù tån t¹i cđa H5HA bề mặt vi rút phân tuýp H5N1xPR8 tạo nên mối liên kết vô yếu tế bào ngời, khả nhiễm bệnh với ngời thấp Để xảy nhiễm bệnh, prôtêin HA vi rút cúm phải đợc phân cắt thành HA1, HA2 men prôtêaza tế bào chủ Tính gây bệnh vi rút cúm A H5 H7 cho gia cầm đợc định chủ yếu có mặt a xít amin đa bazơ liên kết peptit HA HA vi rút có khả gây bệnh cao đợc phân cắt cách có hiệu có mặt vô số prôtêaza kiểu furin mà prôtêaza có mặt hầu hết phận thể ngời chim Tuy nhiên, HA vi rút không gây bệnh chứa gốc bazơ chuỗi liên kết peptit bị phân cắt prôtêaza dạng tripsin Những prôtêaza dạng tồn số loại tế bào nh lớp tế bào biểu mô máy hô hấp Tác giả (Rogers DSouza) năm xuất tài liệu (1999) Trích dẫn khác theo nguyên tắc Các thông tin bổ sung nh tên tài liệu, nơi xuất , xin xem phần tham khảo Đánh giá tạm thời rủi ro an toàn sinh học 11/2003 Chơng trình chống cúm toàn cầu WHO ngời ruột chim Chính thế, khả phân cắt HA định tính đặc hiệu mô nhân tố định khả gây bệnh Các chứng trực tiếp thu đợc cho thấy phân cắt HA đặc đặc hiệu receptor HA có ảnh hởng đến tính hớng mô vi rút cúm chim H7N1 (A/Fowl Plague/Rostock/34) phôi gà (Feldman tác giả khác 2000) Các chứng tơng tự có đợc từ nhiễm vi rút H5N1 năm 1997 cho thấy nguy nhiễm bệnh cao gà, chuột chồn sơng có liên quan trực tiếp đến lu giữ a xít amin đa bazơ Các nghiên cứu tiến hành trung tâm hợp tác Tôkyô tổ chức y tế giới (M Tashiro, liệu không xuất bản) loại bỏ a xít amin đa bazơ đà thay đổi nhiễm H5N1, từ trạng thái nhiễm trùng toàn thân gây tử vong sang trạng thái biểu bệnh khu trú thể gà, chuột chồn sơng Hatta số tác giả khác (2001) di truyền nghịch vừa khả phân tách lớn H5N1 HA (do có mặt a xít amin đa bazơ) tiêu chí cốt yếu gây nhiễm cho chuột dẫn đến tử vong Trong tiến hành thí nghiệm để kiểm tra khả gây bệnh vi rút cúm ngời, Gao CS (1999) đà nghiên cứu vi rút H5N1 vừa cung cấp chứng tơng đồng khả gây bệnh chuột ngời Suy đa chức chuột bị nhiễm cúm ngời H5N1 đa nhận định tính ía mô bất thờng, nhng không cã b»ng chøng nµo vỊ chÐp vi rót ngoµi phổi đựơc tìm thấy (To tác giả khác 2001) Những chứng có cho độc lực vi rút H5N1 năm 1997 với ngời có liên hệ mật thiết với có mặt a xít amin đa bazơ Vì lý này, loại bỏ a xít amin đa bazơ từ vi rút H5N1 năm 2003 cần thiết để giảm khả gây hại cho ngời Quá trình đồng thời làm tăng tính an toàn phân tuýp cho loài lông vũ Thông tin thêm đợc thể qua đánh giá rủi ro môi trờng phần sau Việc chọn chủng PR8 để tạo phân tuýp dựa tính suy yếu thể ngời Những thông tin đợc công bè chØ r»ng ph©n PR8 víi kiĨu di truyền 6:2 (6 phân đoạn từ PR8, HA NA lÊy tõ vi rót cóm ng−êi tuýp hoang d·) không gây độc cho ngời (Florent 1980; Beare Hall 1971; Beare tác giả khác 1975;Oxford tác giả khác 1978) Florent tác giả khác (1977) với nghiên cứu trung tâm hợp tác Tôkyô tổ chức y tế giới phân tuýp chứa nhiều gien PR8 yếu Trong đề án này, phân tuýp có nguồn gốc từ vi rút H5N1 năm 2003 chứa gien vi rút PR8, thành lớn đạt đợc mục tiêu khoa học đặt Vì thế, ph©n mang néi gien cđa vi rót PR8 với NA HA đà cải biến vi rút H5N1 đợc dự đoán yếu với ngời Tất chứng nói nhân lên vi rút ngời dựa vào phân tuýp chøa HA cã nguån gèc tõ vi rót cóm ngời, mà có u gắn với receptor phổ biến tế bào biểu mô hô hấp ngời (gốc a xít sialic -2, 6) Những phân tuýp tạo đề án chứa H5 HA gia cầm có u gắn với gốc -2, Do đó, việc gắn phân tuýp H5N1 với tế bào ngời nhân lên tế bào có hội xảy Mặc dù dịch cúm Hồng Công năm 1997, vi rút cúm H5N1, loại vi rút có lực với a xít sialic -2,3 nhân lên ngời, nhng khả gây bệnh vi rút cúm không phụ thuộc vào HA mà thể đột biến Vi rút H5N1 (1997) có gien bất thờng PB2 NS1 có ảnh hởng đến khả gây bệnh vi rút Những biến đổi gien PB2 vi rút H5N1 1997 nguyên nhân làm chúng suy yếu chuột Đánh giá tạm thời rủi ro an toàn sinh học 11/2003 Chơng trình chống cúm toàn cầu WHO (Hatta tác giả khác 2001) biến đổi protêin NS1 đà tạo điều kiện cho vi rút kháng lại tác động interferon cytokine khác đợc sản xuất hệ miễn dịch tự nhiên thể Biến đổi NS1 tạo kiểu hình có độc tố cao cho phép chép tiến hành không kiểm tra đợc vivo Trong trờng hợp này, vi rút cã ¸i lùc u víi c¸c receptor cđa nã, nã nhân lên (dù không lây truyền) Ngợc lại, vi rút có tổ hợp nội gien prôtêin PR8 nhạy cảm với hệ miễn dịch tự nhiên, nên phòng cho ngời khong bị bệnh cúm gia cầm Điều giải thích đợc nhiều dịch cúm chim xảy trớc năm 1997, dấu hiệu truyền bệnh từ chim sang ngời đợc công bố Điều giải thích nhiều năm tiÕp xóc víi mét l−ỵng lín vi rót cóm chim phòng thí nghiệm (1 vi rút A/FPV/Dobsbon mang gien mà giúp nhân lên tế bào động vật có vú), công nhân bị nhiễm bệnh vi rút Các phân tuýp H5N1xPR8 tạo đề án không chứa tổ hợp gien gây bệnh cho gà, chuột chồn sơng Các phân tuýp có nguồn gốc từ PR8 đợc sử dùng thờng xuyên để sản xuất vắc xin bất hoạt 30 năm qua Công việc liên quan đến sản xuất hàng vài ngàn lít dịch trứng nhiễm khuẩn, mà dịch có khả tạo thành bọt khí nhỏ vi rút phân tuýp nhà máy sản xuất Đa số phân tuýp đợc tạo từ chủng vi rút ngời tuýp hoang dại mà cha có luân chuyển rộng lớn Do đó, đội ngũ công nhân nhạy cảm với vi rút tuýp dại, đà trờng hợp cụ thể bị bệnh có liên quan đến việc tiếp xúc với phân tuýp Điều góp phần khẳng định thêm suy yếu phân tuýp PR8 ngời Tuy vậy, không giống trờng hợp sản xuất vắc xin thông thờng, công nhân tham gia vào sản xuất lô vắc xin thử nghiệm cho đại dịch, ngời mà cha có miễn dịch ®èi víi vi rót cóm gia cÇm tr−íc ®ã, họ nhạy cảm với vi rút dù khả thấp Sự ổn định di truyền vi rút phân tuýp yếu tố quan trọng vi rút chim H5 H7 không gây bệnh, tuýp hoang dà nguồn vi rút có tính gây bệnh cao Các nghiên cứu phân tuýp H5N3 không gây bệnh A/Ngỗng/Hồng Công/437/99 PR8 cho thấy độc tố vi rút sau 10 lần cấy chuyển trứng gà Các vi rút phân tuýp H5N1 đợc kiểm tra phát yếu tố khả gây bệnh thử nghiệm gây bệnh qua đờng tĩnh mạch gà (chỉ số IVP 1.2 hơn) (OIE 2001) chồn sơng (sự nhân lên vi rút triệu chứng lâm sàng phù hợp với triệu chứng gây vi rút mẹ đợc làm yếu độc tính nh (PR8) phân biệt với nhiễm vi rút cúm gia cầmH5N1) (phụ lục 1) Các thử nghiệm an toàn chuột đợc tiến hành Sau vi rút phân tuýp đợc cung cấp cho nhà sản xuất vắc xin Chồn sơng đợc sử dơng réng r·i nh− lµ mét chØ sè tèt vỊ ®éc tÝnh cđa vi rót cóm ®èi víi ng−êi Th−êng vi rút cúm ngời gây hôn mê, sổ mũi gây sốt; nhân lên vi rút thờng giới hạn hệ hô hấp PR8 đà đợc kiểm nghiệm chồn sơng hầu nh nhẹ không gây triệu chứng lâm sàng, nữa, chép vi rút xảy đờng hô hấp Tuy nhiên vi rút H5N1 đợc phát năm 1997 Hồng Công Đánh giá tạm thời rủi ro an toàn sinh học 11/2003 Chơng trình chống cúm toàn cầu WHO đà nhân lên toàn thể ngời, với biểu lâm sàng nh sốt, sụt cân dẫn đến tử vong (Zitzow tác giả khác 2002) Vì chồn sơng mô hình tốt có để dự đoán khả gây bệnh cao cho ngời suy giảm khả gây bênh cho ngời 6.4 Những nguy gây nên chuyển thành vi sinh vật họ Các vi rút cúm dễ dàng hoán vị gien trình phân tuýp hoá Vì đặt giả thuyết việc taọ thành phân tuýp thứ cấp từ phân tuýp H5N1xPR8 vừa đợc sinh vi rút cúm ngời động vật xuất tự nhiên Mặc dù phân tuýp H5N1xPR8 đợc coi không lây truyền suy yếu ngời, phân tuýp thứ phát với vi rút cúm ngời có khả gây nên nguy gây dịch Nói chung sản xuất phân tuýp phòng thí nghiệm khó khăn mặt kỹ thuật, có vài phòng thí nghiệm giới đạt đợc thành công với kỹ thuật Hơn nữa, kinh nghiệm từ việc sản xuất không thành công vắc xin phân tuýp H5N1 năm 1997 (các vi rút gia cầm lợn Anh; vi rút gia cầm PR8 úc Mỹ) cho thấy việc tạo phân tuýp vi rút ngời vi rút gia cầm khó khăn Khi cân nhắc khó khăn với điều kiện thí nghiệm để gây nhiễm H5N1xPR8 cho ngời tạo phân tuýp thứ cấp, nguy việc tạo thành phân tuýp thứ cấp có khả xảy Cũng nên ý thêm rằng, nông dân trang trại nuôi gà lợn hàng ngày tiếp xúc với vi rút cúm động vật nhng có ca bị nhiễm bệnh ngời gây phân tuýp vi rút cúm ngời vi rút cúm chim Nguy phân tuýp thứ cấp loài động vật đợc đề cập đến phần đánh giá rủi ro với môi trờng 6.5 Khả gây hại cho sức khoẻ ngời Do tính đặc hiệu receptor vi rút cúm gia cầm, giảm độc tính PR8 loại bỏ a xít amin đa bazơ chuỗi liên kết peptit, phân tuýp H5N1xPR8 đợc dự đoán khả gây bệnh cho ngời nh không gây hại cho sức khoẻ ngời Nh đà trình bày trên, dù hàng rào tế bào đích hoạt động đế ngăn trở nhiễm bệnh, nguy phân tuýp thứ cấp đợc tạo với vi rút thông thờng ngời xảy ra, phân tuýp có khả nhân lên thể ngời Trong trờng hợp xấu nhất, phân tuýp trở nên thích nghi tốt để gây nhiễm ngời; gây dịch toàn cầu Tuy nhiên, khả xảy cố hÃn hữu ấn định cấp độ bảo vệ tạm thời Vi rút gốc PR8 chất có độc tính sinh học nhóm 2, prôtêin HA vi rút H5N1 đợc xử lý để vi rút đợc phân lập không gây bệnh virus Để giảm thiểu nguy gây hại cho sức khoẻ ngời, cấp độ bảo vệ tạm thời sÏ lµ an toµn sinh häc cÊp 2+ (BSL2+: BSL2 điều kiện khống chế khác chỗ) Đánh giá tạm thời rủi ro an toàn sinh học 11/2003 Chơng trình chống cúm toàn cầu WHO Tính chất công việc cân nhắc biện pháp quản lý nhằm bảo vệ sức khoẻ ngời Mỗi phòng thí nghiệm phải cân nhắc biện pháp quản lý sở công việc định tiến hành đặc điểm trang thiết bị thí nghiệm, nhiên phần sau đợc dùng làm hớng dẫn: ã Tốt phòng thí nghiệm BSL2+ (an toàn sinh học cấp 2+) đợc trì áp lực âm tất thao tác vi rút bên ống nghiệm hàn kín phải đợc tiến hành phòng an toàn vi sinh vật Tuy nhiên điều sản xuất, nên đợc thay biện pháp khống chế khác: ã sử dụng hệ thống ngăn chặn phù hợp khác; ã nhân viên cần đợc bảo vệ mặt nạ an toàn, có lọc HEPA không tránh khỏi thao tác với vi rút ống nghiệm, ã phơng pháp phòng bệnh thuốc chống vi rút cho nhân viên làm việc khu sản xuất khu kế cận ã không bắt buộc phải tắm, mặc quần áo bảo vệ rửa tay đủ để bảo vệ sức khoẻ ngời bảo vệ môi trờng với mức độ an toàn này, ã Không cần thiết phải khử khuẩn nớc thải từ bồn chậu rửa tay, dịch thải từ bồn rửa tay đà đợc khử trùng biện pháp thông thờng, thải nớc rửa tay không gây nên nguy môi trờng Quy tắc làm việc cần đợc ban hành với mà yêu cầu là: ã ã ã ã ã Có biện pháp để giảm tiếp xúc phân tuýp H5N1 với vi rút cúm ngời gia cầm Nhân viên cần đợc tiêm phòng vắc xin cúm thông thờng để hạn chế khả nhiễm bệnh họ vi rút cúm thông thờng ngời Nếu lợng lớn vắc xin H5 đợc sản xuất nhân viên nên đợc tiêm phòng loại vắc xin Cũng nên có sách sức khoẻ nghề nghiệp đề cập đến biện pháp phòng điều trị cho trờng hợp tình cờ phơi nhiễm với vi rút phân tuýp H5N1 Cân nhắc tập quán làm việc để giảm thiểu tạo thành bọt khí vi rút làm vắc xin Có biện pháp khử độc an toàn cho chất thải trang thiết bị Phải có t liệu biện pháp khẩn cấp đối phó với cố chẳng hạn nh cố tràn Phải có chơng trình đào tạo cho nhân viên Các nguy môi trờng biện pháp khống chế thêm cần thiết Mặc dù vËt chđ chØ cã thĨ nhËn mét sè c¸c phụ xác định đó, nhng vi rút cúm có khả gây nhiễm tự nhiên cho loài động vật (chim, lợn, ngựa, ngời, động vật có vú dới nớc, chồn sơng) Bởi phân tuýp H5N1 có tính đặc hiệu receptor gia cầm, chim loài dễ nhiễm bệnh mặt lý thuyết Đánh giá tạm thời rủi ro an toàn sinh học 11/2003 Chơng trình chống cúm toàn cầu WHO Phần ®ãng gãp cđa c¸c néi gien cđa PR8 cho sù nhân lên độc lực phân tuýp chim gì? Brown tác giả khác (2001) đà chØ r»ng sù thÝch nghi cđa mét vi rót cúm H3N2 nhằm tăng độc lực chuột gây số đột biến gien khác vi rút Đà thấy ba đột biến giống với đột biến vi rút độc tính H5N1 Hồng Công đột biến (PR-556) nh cđa vi rót PR8 Do vËy cã thĨ cho r»ng có đợc gien PR8 tăng thêm nguy cho loài vật Tuy nhiên Hatta số tác giả khác (2002), di truyền , lại võa chØ r»ng, sù chiÕm gi÷ chØ mét gien PR8 vi rút cúm gia cầm loại trừ đợc vi rút nhân lên vịt Trên sở công trình này, vi rút chim với prôtêin nội gien PR8 đợc dự đoán không nhân lên chim Các chứng thực nghiệm cho thấy vi rút PR8 không bị suy yếu ngời mà gà Hơn nữa, phân tuýp PR8 (các gien nội prôtêin) vi rút H5N1 Hồng Công (NA HA với a xít amin đơn bazơ) chép gà không gây tử vong Các nghiên cứu tơng tự vừa đợc thực với vi rút H5N1 Hồng Công trung tâm hợp tác Memphis tổ chức y tế giới, nơi mà phân tuýp PR8 không chép không gây bệnh gà Sự loại bỏ các a xít amin đa bazơ từ phân tuýp H5xPR8 hai nghiên cứu có vai trò quan trọng việc giảm nguy cho gà Có thể nhận thấy lợn dễ bị nhiễm bệnh phân tuýp H5N1, vi rút với receptor đặc hiệu đợc biết chép đợc loài Cũng loài dễ nhiễm phân tuýp thứ cấp tạo phân tuýp H5N1 vi rút lợn Thực tế có đến phân tuýp bội ba vi rút cúm lợn, gà ngời sống thể lợn Mỹ (Webby tác giả khác 2000) Mỗi phòng thí nghiệm nên đánh giá nguy nhiễm bệnh gia cầm lợn vùng lân cận áp dụng biện pháp khống chế phòng thí nghiệm Sự lu ý phòng thí nghiệm nhằm ngăn chặn khả vi rút cúm động vật khác thời gian tiến hành công việc tạo phân tuýp, loại bỏ nguy tạo thêm phân tuýp phòng thí nghiệm Chuột gây nhiƠm thùc nghiƯm bëi mét sè c¸c vi rót cóm: chủng PR8 đợc biết độc cho chuột phân tuýp H5N1 nhân lên chuột Do vậy, cần đợc tiến hành bớc để ngăn chặn tiếp xúc chuột hoang chạy trốn chuột thí nghiệm Mỗi phòng thí nghiệm nên thảo luận biện pháp khống chế loài gặm nhấm chỗ Do vậy, tổng kết, không cần thêm biện pháp để bảo vệ môi trờng ấn định hàm lợng BSL2+ Đánh giá tạm thời rủi ro an toàn sinh học 11/2003 Chơng trình chống cúm toàn cầu WHO Tài liệu tham khảo Almond JW (1977) A single gene determines the host range of influenza virus Nature, 270:617-618 Beare AS, Hall TS (1971) Recombinant influenza A viruses as live vaccines for man Lancet, 2:1271-1273 Beare AS, Schild GC, Craig JW (1975) Trials in man with live recombinants made fromA/PR/8/34 (H0N1) and wild H3N2 influenza viruses Lancet, 2:729-732 Beare AS, Webster RG (1991) Replication of avian influenza viruses in humans Archives of Virology, 119:37-42 Brown EG et al (2001) Patterns of mutation in the genome of influenza A vi rót on adaptation to increased virulence in the mouse lung: identification of functional themes Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98: 6883-6888 Couceiro JNSS et al (1993) Influenza vi rót strains selectively recognize sialoligosaccharides on human respiratory epithelium: the role of the host cell in selection of haemagglutinin receptor specificity Vi rót Research, 29:155-165 Feldmann A et al (2000) Targeted infection of endothelial cells by avian influenza vi rót A/FPV/Rostock/34 (H7N1) in chicken embryos Journal of Virology, 74:8018-8027 Florent G (1980) Gene constellation of live influenza A vaccines Archives of Virology, 64:171-173 Florent G et al (1977) RNAs of influenza vi rót recombinants derived from parents of known virulence for man Archives of Virology, 54:19-28 Gao P et al (1999) Biological heterogenicity, including systemic replication in mice, of H5N1 influenza: A vi rót isolates from humans in Hong Kong Journal of Virology, 73:3184-3189 Hatta M et al (2001) Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses Science, 293:1840-1842 Hatta M et al (2002) Human influenza A viral genes responsible for the restriction of its replication in duck intestine Virology, 295:250-255 Katz JM et al (2000) Molecular correlates of influenza A H5N1 vi rót pathogenesis in mice Journal of Virology, 74:10807-10810 Lu X et al (2003) Pathogenicity and antigenicity of a new influenza A (H5N1) vi rót isolated from duck meat Journal of Medical Virology, 69:553-559 10 Đánh giá tạm thời rủi ro an toàn sinh học 11/2003 Chơng trình chống cúm toàn cầu WHO Matsuyama T et al (1980) Aspects of virulence in ferrets exhibited by influenza vi rót recombinants of known genetic constitution Journal of Infectious Diseases, 141:351-61 OIE (2001) Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines 4th Edition Office International des Epizooties, 12 rue de Prony, 75017 Paris, France www.oie.int Oxford JS et al (1978) Analysis of virion RNA segments and polypeptides of influenza A vi rót recombinants of defined virulence Nature, 273:778-779 Reuman PD, Keely S, Schiff GM (1989) Assessment of signs of influenza illness in the ferret model Laboratory Animal Science, 42:222-232 Rogers GN, D’Souza BL (1989) Receptor binding properties of human and animal H1 influenza vi rót isolates Virology , 173:317-322 Seo SH, Hoffman E, Webster RG (2002) Lethal H5N1 influenza viruses escape host antiviral cytokine responses Nature Medicine, 9:950-954 Smith H, Sweet C (1988) Lessons for human influenza from pathogenicity studies with ferrets Reviews of Infectious Diseases, 10:56-72 Subbarao K et al (2003) Evaluation of a genetically modified reassortant H5N1 influenza A vi rót vaccine candidate generated by plasmid-based reverse genetics Virology, 305:192-200 To K et al (2001) Pathology of fatal human infection associated with avian influenza A H5N1 virus Journal of Medical Virology, 63:242-246 Webby RJ et al (2000) Evolution of swine H3N2 influenza viruses in the United States Journal of Virology, 74:8243-8251 Zitzow LA et al (2002) Pathogenesis of avian influenza A (H5N1) viruses in ferrets Journal of Virology, 76:4420-4429 11 Đánh giá tạm thời rủi ro an toàn sinh học 11/2003 Chơng trình chống cúm toàn cầu WHO Phụ lục 1: Thử nghiệm suy giảm chủng vắc xin động vật có vú Vắc xin thử nghiệm chứa đoạn nội gien cđa PR8 vµ NA vµ HA cđa vi rót cúm chim đợc kiểm tra khả gây bệnh chúng chồn sơng cách cho lây nhiễm qua mũi Những nghiên cứu chuột góp phần nghiên cứu suy giảm vi rút Để có đợc kết tốt nhất, tính chất bệnh lý dòng vắc xin nên đợc so sánh, tốt thí nghiệm với PR8 gốc vi rút cúm gia cầm tuýp hoang Sau hớng dẫn cho bớc thí nghiệm đánh giả kết Thử vi rút 50% liều lợng nhiễm bệnh trứng gà, tế bào động vật có vú chứa vi rút làm vắc xin vi rút mẹ thoả mÃn hàm lợng trứng (EID 50) tế bào (ICID50) Chuẩn độ chủng vi rút mang vắc xin chđng vi rót mĐ cịng sÏ tiÕn hµnh cïng phòng thí nghiệm, lấy với hàm lợng phải ®đ lín ®Ĩ cã thĨ so s¸nh víi c¸c liỊu đủ cao tơng ứng chuột chồn sơng (107 đến 106 EID 50 TCID 50) Tốt phòng thí nghiệm khác sử dụng chủng cho PR8, trình truyền bệnh biến đổi tính độc cho chuột Các đặc điểm tính độc chủng cho PR8 nên đợc định rõ cách kỹ phòng thí nghiệm Trang thiết bị thí nghiệm Nghiên cứu động vật với chủng vắc xin chủng mẹ tuýp hoang cần đợc tiến hành trang thiết bị an toàn sinh học cấp 3+ (BSL3+) Những nhân viên tiến hành thí nghiệm nên mang máy hô hấp nhân tạo cá nhân dùng lợng không khí (PAPRs) biện pháp sức khỏe nghề nghiệp nên đợc vận dụng chỗ Chồn sơng Cơ sở thí nghiệm: Các vi rút H5N1 phân lập từ ngời Hồng Công năm 1997 gây bệnh nghiêm trọng cho chồn sơng Biểu lâm sàng sụt cân nhanh chóng, sốt hôn mê, gây di chứng thần kinh và/hoặc tử vong Phân lập vi rút từ phận thể vào ngày từ thứ đến thứ năm sau gây bệnh kết thần kinh bệnh học vào ngày thứ 14 cho thấy có tăng độ độc chồn sơng (Zitzow tác giả khác 2002) Tuy nhiên, vi rút H5N1 khác có khả gây bệnh cao lấy từ thịt vịt nhập vào Hàn Quốc từ Trung Hoa năm 2001 không cho thấy đặc điểm tính độc hiển nhiên chồn sơng (Lu tác giả khác 2003) Do chđng mĐ H5N1 hoang, cïng víi vËt cho PR8 nội gien, phải đợc kiểm tra kỹ tính độc cho chồn sơng Các nghiên cứu tác giả khác PR8 không độc có khả chép phổi chồn sơng (Matsuyama tác giả khác 1980), dù đặc điểm cần phải đợc chứng minh chủng cho sản xuất chủng vắc xin Mặc dù tiến hành thí nghiệm thử khả gây bệnh chủng vắc xin chủng mẹ lúc tốt nhất, nhng hạn chế không gian phòng thí nghiệm, điều dờng nh không khả thi Trong trờng hợp này, đánh giá kỹ chủng mẹ trớc kiểm tra chủng vắc xin cần thiết cho thí nghiệm tiến hành 12 Đánh giá tạm thời rủi ro an toàn sinh học 11/2003 Chơng trình chống cúm toàn cầu WHO Quy trình tiến hành: Chồn sơng loại giao phỗi xa 4-8 tháng tuổi đợc tiêm giảm đau hỗn hợp thuốc gây mê (ví dụ ketamine [25mg/kg], xyalazine [2mg/kg] atropin [0.05mg/kg] thuốc xông phù hợp Liều chuẩn 107EDI 50/TCID50 (phù hợp cả) (106, đợc liều lợng cao hơn) nớc muối đệm phốt phát đợc nhỏ từ từ vào lỗ mũi động vật đợc giảm đau để đảm bảo vi rút đợc hít vào không bị nuốt đẩy Một nhóm từ 4-6 chồn sơng đợc gây bệnh Một nhóm từ 2-3 chồn sơng đợc gây chết không đau đớn vào ngày thứ sau gây bệnh, sau tế bào chúng đợc thu hồi để ớc lợng chép vi rút; mũi và/hoặc gạc, phổi (các mẫu mô lấy từ thuỳ đợc tích huyết, nÃo (mẫu mô từ phần trớc sau đợc tích huyết), lách ruột Các mô phổi khác đợc gom vµ nhm b»ng hematoxylin vµ eosin (H&E) cho kiĨm tra dới kính hiển vi mô bệnh học Các chồn sơng lại đợc quan sát 14 ngày để kiểm tra sụt cân, hôn mê (dựa sở số lần công bố trớc [Reuman, 1989]), triệu chứng hô hấp thần kinh Các triệu chứng thần kinh đợc khẳng định mô nÃo thu đợc vào ngày thứ 14 sau gây bệnh thời điểm kết thúc thí nghiệm xử lý nh đà mô tả cho kiểm tra mô bệnh học Dự đoán kết quả: Lợng vi rút chủng vắc xin mô hệ hô hấp không đuợc lớn chủng mẹ; có giảm đáng kĨ chÐp vi rót ë phỉi Sù chÐp cđa chđng v¾c xin thư nghiƯm cịng sÏ chØ xảy giới hạn hệ hô hấp chép xảy lách ruột Trong phân lập vi rút từ nÃo không mong muốn, lợng lớn vi rót cã cn mịi, cã thĨ cã sù phát vi rút nÃo sở kết thí nghiệm với vi rút không độc ngời H3N2 (Zitzow 2000) Tầm quan trọng kết đợc củng cố thêm phân tích mô nÃo vào ngày thứ 14 sau gây bệnh Các tổn thơng thần kinh đợc tìm thấy phần tế bào nhuộm H&A khẳng định đợc chép vi rút nÃo triệu chứng thần kinh Các triệu chứng thần kinh mô bệnh học có suy giảm hợp lý chủng vắc xin thử nghiệm Cũng nh triệu chứng lâm sàng chẳng hạn sụt cân hôn mê suy giảm chủng vắc xin, suy đoán vi rút cúm tuýp hoang cung gây triệu chứng Chuột Cơ sở thí nghiệm: Các vi rút có khả gây bệnh cao H5N1 phân lập đợc từ châu từ năm 1997 có khả gây bệnh cao cho chuột BALB/c không cần thích nghi vật chủ Mặc dù vi rút ®Ịu chÐp ®Õn mét chn ®é cao trªn hƯ hô hấp chuột, chúng khác khả phân tán thể, khả chép nÃo gây chết cho chuột Các vi rút đợc xếp thành nhóm lớn: nhóm độc với chuột (LD50>106.0EID50) nhóm độc cao với chuột (LD50