Tách chiết, tinh sạch và ứng dụng hợp chất các hoạt tính sinh học từ nấm vân chi

BỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠO TRƯỜNGĐẠIHỌCNÔNGLÂMTP.HCM NGUYỄNNGỌCTHUẦN TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ ỨNG DỤNG HỢP CHẤTCĨHOẠTTÍNHSINHHỌCTỪ NẤMVÂNCHI (Coriolopsisaspera) Chun ngành: Cơng nghệ thực phẩmMãsố:9.54.01.01 LUẬNÁNTIẾNSĨNGÀNHCƠNGNGHỆTHỰCPHẨM Cánbộ hướngdẫn:PGS.TS.ĐàmSaoMai PGS.TS.LêTrungThiên TP.HCM–Năm2022 LỜICAMĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn củaPGS.TS.ĐàmSaoMaivàPGS.TS.LêTrungThiên.Cácsốliệu,kếtquảtrongluậnánhồntồnt rungthựcvàchưađược aicơngbốtrongbấtkỳcơngtrìnhnàokhác Tácgiảluậnán Nguyễn NgọcThuần LỜICẢMƠN Trongqtrìnhthựchiệnđềtài“Táchchiết,tinhsạchvàứngdụnghợpchấtcóhoạttínhsinhhọc từnấmvânchiCoriolopsis aspera”, tơi nhận nhiều sựgiúp đỡ, tạo điều kiện tập thể lãnh đạo, nhà khoa học, cán bộ, giảng viên,chuyên viên Khoa Cơng nghệ Hóa học Thực phẩm – Trường Đại học Nông LâmTP.HCM; tập thể Ban Ban Giám hiệu, Ban lãnh đạo - Trường Đại học Công nghiệpTP.HCM; tập thể Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học, cán phịng, ban chứcnăng Trường Đại học Nơng Lâm TP.HCM Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn chân thành vềsựgiúpđỡđó Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô PGS TS Đàm Sao Mai thầy PGS TS LêTrung Thiên Cô thầy truyền đạt cho nhiều kiến thức, nhiều kinh nghiệm vàđặcbiệtcónhữngýkiếnđónggóp,traođổithậtsựbổích,thiếtthựcvềluậnántiếnsĩcủatơi Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới bạn bè, đồng nghiệp côngtác Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM gia đình động viên, khích lệ, tạođiềukiệnvàgiúpđỡtơitrongsuốtqtrìnhthựchiệnvàhồnthànhluậnánnày Nghiêncứusinh TĨMTẮT Nghiên cứu nhằm tìm điều kiện trích ly, tinh thành phần dịch caochiết từ nấmCoriolopsis asperađể định danh làm giàu chất có hoạt tính sinhhọc dịch trích ly từ nấm Từ nghiên cứu ứng dụng tạo sản phẩm bột hịa tantừdịchtríchlyđượclàmgiàucácchấtcóhoạttínhsinhhọctheohướngcólợichosứckhỏe.Luậná nbaogồm4nộidung: Nộidungđầutiênlàkhảosát5phươngphápxửlýngunliệunhưphươngphápsiêm,visóng,đ unnướcnóng,kếthợphóahọcvàsiêm,kếthợpnitơlỏngvàsiêm.Kếtquảđạtđượcphươngphápkếthợp nitơ lỏng siêu âm trích ly thu thànhphầnTPC,TFC,TTCcao.Tiếptheolàkhảosátảnhhưởng3loạidungmơinhưaceton,methanol, ethanol đếnhàmlượngTPC,TFC,TTCvàRSA.Kếtquảthuđượcdungmơi ethanol methanol 80% trích ly hàm lượng TPC, TFC, TTC RSA cao.Do dung môi ethanol phù hợp chế biến thực phẩm nên lựa chọn để tiếnhànhthựchiệntốiưuhóađiềukiệntríchly Kếtquảtốiưuhóatheophươngphápđápứng bề mặt với mơ hình Box-Behnken thu thơng số nhiệt độ trích ly 40oC, tỷ lệdung mơi ethanol với ngun liệu 53:1, thời gian trích ly 8,04 giờ, nồng độ ethanol79,6% cho hàm mục tiêu tương ứng TPC 7,8407 mg GAE/g DW, TFC 1,3307mgQE/gDW,TTC2 , mgOAE/gDW,RSA4,5940µgVitC/gDW Nội dung định tính nhóm chất có hoạt tính sinh học dịch cao CoAEOtheo phương pháp thay đổi màu sắc tượng dịch cao CoAEO sau chothuốcthử.Kếtquảthuđượccácchấtchuyểnhóabậc2nhiềunhưnhómchấtphenolic,tannin, alkaloid, terpenoid, steroid Cịn nhóm chất flavonoid saponin mứctrungbình,chỉcónhómchấtcoumarinít.Cuốicùnglàtinhsạchđểxácđịnhchấttrongdịch cao CoAEO Kết tinh chất sạch, từ cao chiết ethylacetate thu hợp chất trametenolic B, cerevisterol, ergosterol, ergosterolperoxitvàtừcaonướcthuđược5hợpchấtnhưtrans-phydroxycoumaricacid,methylferulat,methyl(2-hidroxyphenyl)acetat,umbelliferone,8hydroxy-3,4-dimethylisocoumarin Nộidungthứ3làthửhoạttínhchốngoxyhóacủadịchcaoCoAEOtheophươngphápDPPH.Kếquả đãđođượcIC50(mg/l)bằng0,064vớichứng(+)làaxítascorbicbằng 0,035 mg/ml Tiếp theo thử khả ức chế tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) củacao CoAEO theo phương pháp MTT Kết thu IC50 98,3µg/ml vớichứng (-) DMSO chứng (+) Ellipticine 3,63 (µg/ml) tế bào ungthư gan (Hep-G2) đo theo IC50 88,6 (µg/ml) với chứng (-) DMSO 0vàchứng(+)làEllipticinebằng3,98(µg/ml).KếtiếplàthửkhảnăngkhángVSVcủacaoCoAE Otheophươngphápđổđĩathạchvàđođườngkínhvịngtrịnkhángkhuẩn.KếtquảthuđượccaoC oAEOcókhảnăngkhángtrên5chủngVSVnhưV.parahaemolyticusATCC 17802,L monocytogenesATCC 19111,B cereusATCC11778,S.aureusATCC25923,E.faecalisATCC29212.Saucùnglàthửđộctínhcấ pvà bán trường diễn dịch cao CoAEO chuột theo phương pháp Lorke theohướngdẫn407(2001)củatổchứcHợptácvàPháttriểnKinhtế(OECD)vềthửnghiệmhóa chất Thí nghiệmđộctínhcấpchochuộtuốngdịchcaochiếtCoAEOởmứcliềucao (0, 2000, 4000 6000 mg /kg thể trọng) 14 ngày kết không thấy chuộtchếttrêncáclơthínghiệm,cịnthínghiệmđộctínhbántrường diễn cho chuột uốngdịchcaochiếtCoAEOởmứcliều(100,200,300và400mg/kg)trong90ngàykếtquảkhơng thấydấuhiệubấtthườngtrêncáclơthínghiệm.Điềuđócóthểkếtluậnrằngvới hàm lượng TTC dịch cao 781,8 mg oleanolic/kg thể trọng 52,12 mgoleanolic/kgthìkhơnggâyđộctrênchuột Nộidungcuốicùnglàkhảosátlựachọntỷlệhỗnhợpchấtmangbaogồmmaltodextrin:gum arabic:gelatin Kết thu tỷ lệ 94:5:1 phù hợp để nghiêncứu tối ưu hóa cơng đoạn sấy phun Thực tối ưu hóa cơng đoạn sấyphun theo phương pháp đáp ứng bề mặt với mô hình Box-Behnken Kết thu đượcthơngsốdự đốn nhiệt độ sấy đầu vào 133oC, hàm lượng chất mang 16% (w/w),lưu lượng nạp liệu 22,5ml/phút phần mềm cho kết dự đoán hàm mụctiêu hiệu suất thu hồi bột 42,201%, độ ẩm bột 2,936% độ giảm chốngoxy hóa khả 9,224%, độ giảm TFC 2,358%, độ giảm TPC 4,124%, độ giảm TTC0,909%.Kếtquảkiểmchứngđốivớicáchàmmụctiêuhồntồngiốngvớikếtquảdựđốn.Cuố icùngnghiêncứuthờigianbảoquảnbộttheophươngphápQ10.Kếtquảthuđượcthờigianbảoquảns ảnphẩmbộtCoAEOhịatanởnhiệtđộmát20oC(khảnăngchốngoxyhóagiảm20%sovớibanđầu) sẽlà:45,2ngàytươngtựthờigianbảoquản nhiệt độ mát 20oC (hàm lượng triterpene tổng giảm 20% so với ban đầu) là: 69,5ngày Tính tốn độ an toàn sinh học 100g sản phẩm bột CoAEO hịa tan dựatrênkếtquảthựcnghiệmđộctínhcấpvàbántrườngdiễn.KếtquảchothấyhàmlượngTTC (mg oleanolic)nằmdướimức781,8mgoleanolic/kgthểtrọngvà52,12mgoleanolic/kg Từkhóa:CaochiếtCoAEO,Coriolopsisaspera,nấmvânchi,táchchiết,tinhsạch ABSTRACT Thestudy aimedtoinvestigatetheextractionandpurificationconditionsofthecomponents in the extract from the fungus Coriolopsis aspera to identify and enrichthe biologically active substances in mushroom extract Accordingly, the study onproduction of soluble healthy products from the extracts enriched with biologicallyactivesubstances wasconducted.The thesisconsistsof4topics: Thefirstcontentwastoinvestigatefivemethodsofrawmaterialprocessing,includingthe methods using chemical ultrasonic, microwave, hot water, combination of andultrasoniccombinationandcombinationofliquidnitrogenandultrasound.Highcontents of TPC, TFC, TTCwas obtained from the extraction method of combiningliquidnitrogenandultrasonic.Subsequently,theinfluenceofsolventssuchasacetone, methanol,ethanolonthe contents ofTPC, TFC, TTC andRSA wascarriedout.Andas a result, 80% ethanol and methanol were the solvents help efficiently extract thecomponents when high amounts of TPC, TFC, TTC and RSA were obtained However,onlyEthanolwaschosentooptimizetheextractionconditionsduetoitssuitabilityfor foodprocessing.OptimizationconditionsobtainedusingsurfaceresponsemethodwithBox-Behnken model includedtheextraction temperatureof400C,ratioofethanoltoraw materials of 53:1, the extraction time of 8.04 hours and the ethanol concentrationof79.6%withthecorrespondingobjectivefunctionsofTPC7.8407mg GAE/g DW,TFC1.3307 mgQE/gDW,TTC2.0843 mgOAE/gDW,RSA4.5940µgVitC/ gDW The next content was the qualification study onthe biologically active substances inthe CoAEO extract using the method of color change and phenomenon of CoAEOsolutionafteraddingthereagent.Asaresult,alargenumberofsecondarymetabolitessu chasphenoliccompounds,tannins,alkaloids,terpenoids,andsteroidswereobtained And the amounts of flavonoids and saponins were moderate while that ofcoumarins was low Finally, the extract was subject to purification to determine thesubstances present in the CoAEO extract As a result, substances were purified, ofwhich4compoundswereobtainedfromethylacetateextract(trametenolicB,cerevisterol,erg osterol,ergosterolperoxide)and5compoundswerefromtheaqueous extract(trans-p-hydroxycoumaricacid,methylferulat,methyl(2hydroxyphenyl)acetate,umbelliferone,8-hydroxy-3,4-dimethylisocoumarin) ThethirdcontentwastocharacterizetheCoAEOextractintermsofcertainbioactivities,incl udingantioxidant,anticancerandantibacterialactivities.Theantioxidant activities were evaluated based on free radical scavenging capacity withthe IC50 value 0.064 (mg/l), compared to 0.035 (mg/ml) of the positive control (+)(ascorbic acid) Notably, the CoAEO extract was demonstrated to be able to inhibitcervical cancer cells (HeLa) with the IC50 value of 98.3 µg/ml compared to 3,63(µg/ml) of the positive control (+) (Ellipticine)and liver cancer cells (Hep-G2) withIC50 values of 88.6 (µg/ml) compared to 3,98 (µg/ml) of Ellipticine In addition, theCoAEOextractwasalsoresistantagainstfivestrainsofmicroorganisms,includingV.parahae molyticus ATCC 17802, L monocytogenes ATCC 19111, B ceråeus ATCC11778,S.aureusATCC25923,E.faecalisATCC29212withinhibitionzonediameter sof0.82±0.02cm;0.75±0.03cm;0.52±0.02cm;0.25±0.05cm;0.40±0.06cm, respectively.Toensurethesafetyoftheextract,theacuteandsubchronictoxicitytestswereperformedusingLorkemethodandtheguideline407(2001)onchemica ltestingoftheOrganizationforEconomicCooperationandDevelopment(OECD).TheacutetoxicitytestforratsadministeredwithCoAEOextra ctathighdoses(0,2000,4000and6000mg/kgbodyweight)for14daysresultedinnodeath,whilesub-chronictoxicitytestsof CoAEO extract in rats at doses (100, 200, 300 and 400mg/kg) for 90 days didnotshowanyabnormality.Therefore,itcouldbeconcludedthathighTTCconcentrationso f781.8mgoleanolic/kgand52.12mgoleanolic/kgbodyweightwerenottoxictorats Thelastcontentwastodeterminetotheoptimalratioofcarriermixtureofmaltodextrin:gum arabic:gelatin.Asaresult,amixtureofmaltodextrin:gumarabic:gelatin (94:5:1) was confirmed to be optimal for spray drying process Theoptimization conditions of spray drying predicted by response surface method withBox-Behnken model included: the input drying temperature of 1330C, the carriercontentof16%(w/w)andthefeedflowrateof22.5ml/min.Giventhisconditions,theobjective functionswerepredictedbysoftwaretoberecoveryefficiencyof42,201%, powder moisture content of 2.936% and reducing/antioxidant capacity of 9.224%, TFCreduction of 2.358%, TPC reduction of 4.124% and TTC reduction of 0.909% Thetest results for the objective functions were the same as the predicted results ThestoragetimeofsolubleCoAEOpowderproductatacooltemperatureof200C(oxidationresi stancereducedby20%)were45.2days whilethestoragetimeatacooltemperatureof200C(totaltriterpene content reduced by 20%) were 69.5 days ThebiosafetyoftheCoAEOpowder(100g)testedusingtheacuteandsub-chronictoxicityshowed thattheTTCcontent(mgoleanolic)waslessthan781,8mgoleanolic/kgand52,12mgoleanolic/kgbodyweight Keywords:CoAEOextract,Coriolopsis aspera,extraction,purification MỤCLỤC LỜICAMĐOAN ii LỜICẢMƠN iii TÓMTẮT iv MỤCLỤC x DANHMỤCCÁCKÝHIỆU,CÁCCHỮVIẾTTẮT xiii DANHMỤCCÁCBẢNG xv DANHMỤCCÁCHÌNHVẼ,ĐỒTHỊ xvii MỞĐẦU Mụctiêu luậnán Ýnghĩakhoahọcvàthực tiễncủa luậnán Nhữngđiểmmớicủaluậnán .2 Chương1TỔNGQUAN 1.1 Giớithiệunấmvânchi 1.2 Thànhphầnhóahọccủa nấmvânchi 1.2.1 Polysaccharide 1.2.2 Terpenoidvàsteroid .5 1.2.3 Hợpchấtphenolic 1.2.4 Cáchợpchấtkhác 1.3 Cácyếutố ảnhhưởngđếnhiệusuấttríchly 1.3.1 Ảnhhưởng nhiệtđộ 1.3.2 Ảnhhưởngthờigian 1.3.3 Ảnhhưởngloạidungmôi 1.3.4 Ảnhhưởngtỷlệdungmôivớinguyênliệu 1.3.5 Ảnhhưởngkỹthuậtchiếtxuất 10 1.3.6 Một sốảnhhưởngkhác .16 1.4 Tinhsạch địnhdanhchất 16 1.4.1 Kỹthuậtsắc ký lọcgel 17 1.4.2 Kỹthuậtsắc ký bảngmỏng(TLC) 17 1.5 Hoạttínhsinhhọc .18 1.5.1 Hoạttínhchốngoxyhóa 18 1.5.2 Hoạttínhkhángvisinhvật 19 ... uảthểlồiCoriolopsisaspera.Vìlýdonày,chúngtơiđềxuấtđềtài ? ?Tách chi? ??t, tinh ứng dụng hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm vân chi( Coriolopsisaspera)” Mụctiêucủaluậnán  Nghiên cứu điều kiệntrích ly, tinh thành phần trongdịch chi? ??tnấmCoriolopsis... Ýnghĩakhoahọc Đềtàiđãthuđượcmộtsốkếtquảnghiêncứumớicóýnghĩakhoahọcliênquanđếncác thành phần hóa họcvàtínhchấtsinhhọccủamộtsốhoạtchấttừnấmVânchi,cũng điều kiện để thu nhận làm giàu chất có hoạt tính sinh. .. asperađể định danh làm giàu chất có hoạt tính sinhhọc dịch trích ly từ nấm Từ nghiên cứu ứng dụng tạo sản phẩm bột hịa tantừdịchtríchlyđượclàmgiàucácchấtcóhoạttínhsinhhọctheohướngcólợichosứckhỏe.Luậná