Luận án tiến sĩ dược học nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ ba kích (radix morindae officinalis) của việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM VĂN KIỀN NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH (RADIX MORINDAE OFFICINALIS) CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, N[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM VĂN KIỀN NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH (RADIX MORINDAE OFFICINALIS) CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM VĂN KIỀN NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH (RADIX MORINDAE OFFICINALIS) CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 62720410 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đoàn Cao Sơn PGS TS Bùi Hồng Cường HÀ NỘI, NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực phần đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học rễ Ba kích Việt Nam (Radix Morindae officinalis)”, mã số CNHD.ĐT.075/16- 18, thuộc Chương trình “Khoa học cơng nghệ trọng điểm quốc gia phát triển cơng nghiệp hóa dược đến năm 2020” mà tơi có tham gia đồng ý Chủ nhiệm đề tài NCS PhạmVăn Kiền LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tơi nhận giúp đỡ tận tình có hiệu nhiều cá nhân, tập thể, thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin cảm ơn PGS TS Đồn Cao Sơn – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương PGS TS Bùi Hồng Cường – Phó trưởng Bộ mơn Dược học Cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình thực hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Phòng Đào tạo Sau đại học, GS TS Thái Nguyễn Hùng Thu, thầy, cô Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện, tận tình giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm để tơi hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn Bộ Cơng thương cấp kinh phí cho Đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học rễ Ba kích Việt Nam (Radix Morindae officinalis)”, mã số CNHD.ĐT.075/16-18; PGS TS Trần Việt Hùng – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh, chủ nhiệm đề tài anh, chị, em đồng nghiệp Khoa Kiểm nghiệm Đông dược dược liệu, Khoa Thiết lập chất chuẩn chất đối chiếu – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Khoa Vi sinh – Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh hỗ trợ, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình thực nghiệm để tơi hồn thành luận án Cuối cùng, tơi xin chân thành ơn gia đình tơi người bạn, đồng nghiệp ln ủng hộ, động viên khích lệ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2021 NCS Phạm Văn Kiền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ vii ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) .3 1.1.1 Vị trí phân loại Ba kích 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Phân bố, thu hái, chế biến 1.1.4 Thành phần hoá học 1.1.5 Tác dụng dược lý .5 1.1.6 Tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích .5 1.2 Monotropein nystose .6 1.2.1 Monotropein 1.2.2 Nystose 1.3 Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein nystose 12 1.3.1 Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein, nystose giới Việt Nam 12 1.3.2 Phân lập, tinh chế monotropein nystose từ Ba kích 13 1.4 Phương pháp phân tích trình tự ADN định danh lồi Morinda officinalis How 15 1.4.1 Quy trình phân tích mã vạch ADN cho thực vật .15 1.4.2 Phương pháp khuếch đại gen (PCR) 16 1.4.3 Các trình tự gen thường dùng cho thực vật 18 1.4.4 Nghiên cứu về đa dạng di truyền loài Morinda officinalis How 22 1.6 Tính cấp thiết luận án 23 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 2.1 Đối tượng nghiên cứu .25 2.2 Phương tiện nghiên cứu .25 2.2.1 Chất chuẩn dược liệu chuẩn .25 2.2.2 Hóa chất thuốc thử .25 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein nystose .27 2.3.2 Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein nystose từ dược liệu rễ Ba kích 37 2.3.3 Thiết lập chất chuẩn monotropein nystose 39 2.3.4 Định danh dược liệu rễ Ba kích Việt Nam dựa số thị ADN 44 2.3.5 Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam về số tiêu định tính, định lượng .48 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .49 3.1 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein nystose 49 3.1.1 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein 49 3.1.2 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng nystose 54 3.1.3 Thẩm định phương pháp định tính nystose dược liệu rễ Ba kích phương pháp sắc ký lớp mỏng 59 3.2 Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein nystose từ dược liệu rễ Ba kích60 3.2.1 Chiết xuất cao chiết toàn phần chứa monotropein nystose .60 3.2.2 Phân lập tinh chế monotropein 61 3.2.3 Phân lập tinh chế nystose 63 3.2.4 Xác định liệu nhận dạng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn 65 3.3 Thiết lập chất chuẩn monotropein nystose 67 3.3.1 Thiết lập chất chuẩn monotropein 67 3.3.2 Thiết lập chất chuẩn nystose 75 3.3.3 Định tính, định lượng monotropein nystose dược liệu rễ Ba kích 83 3.4 Định danh dược liệu rễ Ba kích Việt Nam dựa số thị ADN .85 3.4.1 Chiết tách ADN toàn phần từ dược liệu 85 3.4.2 Nhân đoạn gen 86 3.4.3 Giải trình tự gen định danh dược liệu 87 3.4.4 Phân tích trình tự gen .89 3.5 Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam số tiêu định tính định lượng 93 3.5.1 Bổ sung tiêu định tính, định lượng vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam .93 3.5.2 Dự thảo chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam VI .94 CHƯƠNG BÀN LUẬN 101 4.1 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein nystose 101 4.1.1 Phương pháp định tính, định lượng monotropein nguyên liệu dược liệu rễ Ba kích 101 4.1.2 Phương pháp định tính, định lượng nystose nguyên liệu dược liệu rễ Ba kích .103 4.1.3 Thẩm định phương pháp định tính nystose dược liệu TLC 105 4.2 Chiết xuất, phân lập tinh chế monotropein nystose từ dược liệu rễ Ba kích 105 4.2.1 Chiết cao toàn phần 105 4.2.2 Phân lập, tinh chế monotropein 106 4.2.3 Phân lập, tinh chế nystose .107 4.2.4 Xác minh cấu trúc monotropein nystose tinh chế 108 4.3 Thiết lập chất chuẩn monotropein nystose 109 4.4 Định danh dược liệu rễ Ba kích Việt Nam dựa số thị ADN .112 4.5 Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam số tiêu định tính, định lượng 118 4.5.1 Bổ sung tiêu định tính 118 4.5.2 Bổ sung tiêu định lượng 120 4.6 Những đóng góp luận án 122 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .123 Kết luận 123 Kiến nghị 123 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid ribonucleic AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc APG II : Angiosperm Phylogeny Group II - Nhóm phát sinh chủng lồi thực vật hạt kín ARS : ASEAN Reference Standards - Chất chuẩn khu vực ASEAN CBOL : Consortium for the Barcode of Life cpDNA : Chloroplast Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lục lạp ptDNA : Plasma tumor Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lạp thể DĐVN : Dược điển Việt Nam DNA : Deoxyribo Nucleic Acid dNTP : Deoxynucleoside triphosphate dATP : Deoxyadenosine triphosphate dCTP : Deoxycytidine triphosphate dGTP : Deoxyguanosine triphosphate EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ELSD : Evaporative light scattering detector - Detector tán xạ bay EPRS : EP Reference Standards - Chất chuẩn Dược điển Châu Âu ETS : External transcribed spacer – Vùng mã ngồi gene FHH : Diễn đàn hịa hợp thuốc thảo dược nước Tây Thái Bình Dương HPLC-DAD : Sắc ký lỏng hiệu cao detector mảng diod HPLC-ELSD : Sắc ký lỏng hiệu cao detector tán xạ bay FOS : Fructo Oligo Saccharid ICRS : Chất chuẩn Dược điển Quốc tế i IGS : Intergenic spacer – vùng chen gene IR : Vùng gen lặp lại đảo ngược (inverted repeat - IR) ISSR : Inter-Simple Sequence Repeats – Chuỗi lặp lại đơn giản ITS : Internal transcribed spacer KNV : Kiểm nghiệm viên LDL : Low density lipoprotein LSC : large single copy – vùng đơn gen lớn matK : Maturase K MeOH : Methanol mRNA : Messenger Ribonucleic acid NCBI : National Center for Biotechnology Information PTN : Phòng thử nghiệm PCR : Polymerase chain reaction – Kỹ thuật khuếch đại gen QTL : Quantiative Trait loci RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA rbcL : Rubisco large subunit gene SKLM : Sắc ký lớp mỏng SSC : Small single copy - Vùng đơn gen nhỏ TBE : Tris/Borate/EDTA TCCL : Tiêu chuẩn chất lượng TLC : Thin layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng TIS : Transcription start site – Điểm khởi đầu chép TRIS : Tris(hydroxymethyl)aminomethane USPRS : USP Reference Standards - Chất chuẩn Dược điển Mỹ UV-VIS : Ultraviolet-Visible - Tử ngoại – khả kiến WHO : World health organization - Tổ chức Y tế giới ii DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1 Vị trí phân loại chi Morinda Bảng 1.2 Tóm tắt chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Bảng 1.3 Chương trình gradient dung mơi định lượng nystose 11 Bảng 1.4 Một số đơn vị cung cấp chất chuẩn monotropein nystose 13 Bảng 2.1 Danh mục mã hoá mẫu Ba kích 25 Bảng 2.2 Nội dung thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein [52] 29 Bảng 2.3 Nội dung thẩm định phương pháp định lượng nystose [52] 34 Bảng 2.4 Chương trình gradient pha động sắc ký lỏng điều chế .38 Bảng 2.5 Nồng độ thành phần tham gia phản ứng 45 Bảng 2.6 Các mồi chung cho trình tự ITS gen chloroplast 46 Bảng 2.7 Chương trình PCR cho đoạn mồi ITS1-ITS4 [84] .46 Bảng 2.8 Chương trình PCR cho đoạn mồi ITS U4-ITS P5 [36] .46 Bảng 2.9 Chương trình PCR cho đoạn mồi matK 1326R-390F [39] .47 Bảng 2.10 Chương trình PCR cho đoạn mồi rcbLaF-rcbLaR [54], [56] 47 Bảng 2.11 Chương trình PCR cho đoạn mồi trnH-pbsA [48] 47 Bảng 2.12 Nồng độ thành phần tham gia phản ứng giải trình tự đoạn gen .48 Bảng 3.1 Độ thích hợp hệ thống sắc ký phương pháp định lượng monotropein .49 Bảng 3.2 Kết khảo sát độ tuyến tính phương pháp định lượng monotropein 50 Bảng 3.3 Kết khảo sát độ xác phương pháp định lượng monotropein nguyên liệu 51 Bảng 3.4 Kết khảo sát độ xác phương pháp định lượng monotropein dược liệu BK5 52 Bảng 3.5 Kết đánh giá độ phương pháp định lượng monotropein nguyên liệu 52 iii Bảng 3.6 Kết khảo sát độ phương pháp định lượng monotropein dược liệu BK5 53 Bảng 3.7 Độ thích hợp hệ thống phương pháp định lượng nystose .54 Bảng 3.8 Kết khảo sát độ tuyến tính phương pháp định lượng nystose 56 Bảng 3.9 Kết độ xác trung gian phương pháp định lượng nystose nguyên liệu 57 Bảng 3.10 Kết độ xác phương pháp định lượng nystose dược liệu BK5 58 Bảng 3.11 Kết khảo sát độ phương pháp định lượng nystose nguyên liệu 58 Bảng 3.12 Kết khảo sát độ phương pháp định lượng nystose dược liệu BK5 59 Bảng 3.13 Số liệu phổ 1H-NMR (D2O, 500 MHz) chất phân tích tham khảo * (D2O, 600 MHz) 66 Bảng 3.14 Số liệu phổ 13C-NMR (D2O, 125 MHz) chất phân tích tham khảo * (D2O, 100 MHz) 67 Bảng 3.15 Kết khối lượng làm khô nguyên liệu monotropein 68 Bảng 3.16 Kết xác định tạp chất nguyên liệu monotropein 69 Bảng 3.17 Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn monotropein 70 Bảng 3.18 Số lượng lọ chuẩn monotropein .70 Bảng 3.19 Kết đánh giá đồng lô chất chuẩn monotropein .71 Bảng 3.20 Kết đánh giá liên phòng chất chuẩn monotropein 72 Bảng 3.21 Kết hàm lượng chất chuẩn monotropein 72 Bảng 3.22 Kết định lượng độ ổn định chất chuẩn monotropein (6 tháng) .73 Bảng 3.23 Kết định lượng độ ổn định chất chuẩn monotropein (1 năm) 74 Bảng 3.24 Kết xác định tạp chất liên quan độ ổn định chất chuẩn monotropein (6 tháng) 74 iv Bảng 3.25 Kết xác định tạp chất liên quan độ ổn định chất chuẩn monotropein (1 năm) 74 Bảng 3.26 Tổng hợp kết nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn monotropein sau năm 75 Bảng 3.27 Kết khối lượng làm khô nguyên liệu nystose 76 Bảng 3.28 Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn nystose 77 Bảng 3.29 Số lượng lọ chất chuẩn nystose 78 Bảng 3.30 Kết đánh giá đồng lô chất chuẩn nystose 78 Bảng 3.31 Kết đánh giá liên phòng chất chuẩn nystose 79 Bảng 3.32 Kết hàm lượng chất chuẩn nystose 79 Bảng 3.33 Kết định lượng nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose (6 tháng) 80 Bảng 3.34 Kết định lượng nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose (1 năm) 81 Bảng 3.35 Tổng hợp kết nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose sau năm 82 Bảng 3.36 Kết định lượng monotropein dược liệu rễ Ba kích 83 Bảng 3.37 Kết định lượng nystose dược liệu rễ Ba kích 84 Bảng 3.38 Kết đo mật độ quang dịch tách chiết ADN toàn phần 86 Bảng 3.39 Kết BLAST search NCBI trình tự ITS 87 Bảng 3.40 Kết BLAST search NCBI trình tự matK 88 Bảng 3.41 Kết BLAST search NCBI trình tự rbcL 88 Bảng 3.42 Kết BLAST search NCBI trình tự trnH-pbsA 88 Bảng 3.43 Kết so sánh độ tương đồng độ phủ mẫu Ba kích so với M officinalis KR869730 M officinalis AY551330 89 Bảng 3.44 Khoảng cách di truyền mẫu trình tự ITS 90 Bảng 3.45 Khoảng cách di truyền mẫu trình tự matK .91 Bảng 3.46 Khoảng cách di truyền mẫu trình tự rbcL 92 v Bảng 3.47 Khoảng cách di truyền mẫu trình tự trnH-psbA 93 Bảng 3.48 Tóm tắt tiêu bổ sung vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam 94 vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Công thức cấu tạo monotropein [14] Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo nystose [85] Hình 1.3 Sơ đồ chu kỳ phản ứng chuỗi polymerase [15] 17 Hình 1.4 Vị trí vùng ITS cụm đa gen 18S–5.8S–26S rRNA [70] .19 Hình 1.5 Vị trí gen cpDNA Trifolium subterraneum [88] 21 Hình 1.6 Vị trí tương đối matK so với trnK cpDNA [75] 22 Hình 3.1 Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu phương pháp định tính, định lượng monotropein 50 Hình 3.2 Sắc ký đồ giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) monotropein 54 Hình 3.3 Độ đặc hiệu phương pháp định lượng nystose nguyên liệu 55 Hình 3.4 Độ đặc hiệu phương pháp định lượng nystose dược liệu rễ Ba kích 56 Hình 3.5 Kết đánh giá độ đặc hiệu phương pháp định tính nystose dược liệu rễ Ba kích 60 Hình 3.6 Quy trình chiết xuất dịch chiết tồn phần 61 Hình 3.7 Sơ đồ phân lập, tinh chế monotropein từ cao chiết MeOH 63 Hình 3.8 Sơ đồ phân lập, tinh chế nystose từ cao chiết nước 65 Hình 3.9 Cơng thức cấu tạo monotropein 66 Hình 3.10 Cơng thức cấu tạo nystose 67 Hình 3.11 Sắc ký đồ tạp chất liên quan monotropein 69 Hình 3.12 Chất chuẩn monotropein, SKS: 0119.C005.01 .73 Hình 3.13 Sắc ký đồ SKLM thử tạp chất liên quan nguyên liệu nystose 76 Hình 3.14 Chất chuẩn nystose, SKS: 0119.C006.01 80 vii Hình 3.15 Kết thử tạp chất liên quan nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose 82 Hình 3.16 Kết điện di tách chiết ADN toàn phần .85 Hình 3.17 Kết khuếch đại đoạn ITS với đoạn mồi ITS P5- ITS U4 ITS4-ITS1 86 Hình 3.18 Kết khuếch đại đoạn gen chloroplast .87 Hình 3.19 Kết gióng hàng trình tự ITS 89 Hình 3.20 Kết gióng hàng trình tự matK 90 Hình 3.21 Kết gióng hàng trình tự rbcL 91 Hình 3.22 Kết gióng hàng trình tự trnH-psbA 92 viii ĐẶT VẤN ĐỀ Ba kích (Morinda officinalis) thuốc quý có giá trị sử dụng Y học cổ truyền, biết đến với nhiều tác dụng: Bổ thận, tráng dương, mạnh gân cốt, tăng lực, tăng sức đề kháng, chống viêm [10], [12], [16], [18]… Những năm gần đây, nhu cầu sử dụng dược liệu rễ Ba kích chế phẩm từ dược liệu rễ Ba kích ngày tăng Thị trường dược liệu rễ Ba kích đa dạng, bao gồm nguồn cung cấp dược liệu nhập từ Trung Quốc, trồng theo quy hoạch phát triển vùng trồng dược liệu [13], nguồn thu hái tự nhiên Do đa dạng nguồn cung cấp nên chất lượng dược liệu rễ Ba kích chưa kiểm sốt chặt chẽ Hiện nay, dược liệu rễ Ba kích hay bị nhầm lẫn hình dáng, việc định danh dược liệu hình thái học cơng tác khó khăn sau thu hái xử lý khơng thể thu thập đầy đủ thông tin đặc điểm thực vật mẫu dược liệu Cần có phương pháp bổ trợ định danh dược liệu để đảm bảo tính dược liệu rễ Ba kích, phương pháp định danh dược liệu giải trình tự ADN phương pháp đáp ứng yêu cầu đặt Để kiểm soát chất lượng dược liệu rễ Ba kích, cần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu kiểm sốt đầy đủ tiêu hình thái số “marker” (những chất có hoạt tính sinh học có hàm lượng cao có dược liệu [86]) Đồng thời, phải thiết lập chất chuẩn “marker” để cung cấp cho hệ thống kiểm nghiệm nhằm giảm chi phí thời gian kiểm nghiệm so với việc phải mua chất chuẩn từ nước Về tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích, Dược điển Trung Quốc, Bộ tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kông Dược điển Việt Nam có chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Trong đó, chun luận Ba kích Dược điển Việt Nam V có số tiêu mơ tả hình thái, vi phẫu, soi bột, chưa có tiêu định lượng thành phần hóa học [3] Dược điển Trung Quốc Bộ tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kơng có tiêu định lượng “marker” - nystose [37], [47] Về “marker” dược liệu rễ Ba kích: Trên giới có nhiều nghiên cứu số hợp chất rễ Ba kích có tác dụng sinh học như: Monotropein có tác dụng chống viêm [12], [38], oligosaccharid (nystose) có tác dụng chống trầm cảm, chống tổn thương tế bào thần kinh corticosteron [59], hay nhóm anthraquinon polysaccharid có tác dụng ngăn ngừa điều trị bệnh liên quan đến tiêu xương [89] Một số công trình khoa học cơng bố hàm lượng chất monotropein nystose dược liệu rễ Ba kích mức tương đối cao (monotropein: 0,046 % [91], nystose:  3,0% [11]) Do vậy, monotropein nystose đủ điều kiện “marker” dược liệu rễ Ba kích, cần kiểm soát hàm lượng thiết lập chất chuẩn để phục vụ cho công tác kiểm tra chất lượng dược liệu rễ Ba kích Xuất phát từ vấn đề cấp thiết trên, luận án: “Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) Việt Nam” thực với mục tiêu chính: Chiết xuất, phân lập, tinh chế thiết lập chất chuẩn monotropein, nystose từ dược liệu rễ Ba kích Định danh dược liệu rễ Ba kích Việt Nam dựa số thị ADN Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam số tiêu định tính định lượng CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) 1.1.1 Vị trí phân loại Ba kích Theo “Cẩm nang tra cứu nhận biết họ thực vật hạt kín (Magnoliophyta, Angiospermae) Việt Nam” [1] tài liệu phân loại thực vật khác: Hệ thống Takhtajan năm 2009 [79] hệ thống APG II [55], vị trí phân loại chi Morinda giới thực vật trình bày Bảng 1.1 Bảng 1.1 Vị trí phân loại chi Morinda Phân giới Ngành Lớp Phân lớp Bộ Họ Chi Cormobionta (Thực vật bậc cao) Magnoliophyta (Ngành Ngọc lan) Magnoliopsida (Lớp Ngọc lan) Lamiidae (Phân lớp Bạc hà) Gentianales (Bộ Long đởm) Rubiaceae (Họ Cà phê) Morinda Tên khoa học: Morinda officinalis How, họ Cà phê Rubiaceae Tên gọi khác: Ba kích thiên, Ruột gà, Chẩu phóng xì (Hải Ninh), Thao tày cáy (Tày), Ba kích nhục, Liên châu Ba kích [10] 1.1.2 Đặc điểm hình thái Cây dây leo thân cuốn, dài từ - 5m Rễ phình to thành củ, hình trụ, mập, vặn vẹo Củ thường thắt lại tạo thành đốt có chiều dài từ - cm, trơng giống ruột gà Vỏ ngồi màu hồng nhạt, thịt màu hồng, tím hay trắng, mặt vỏ có nhiều vân dọc, vỏ nạc, có lõi cứng có tỷ lệ so với đường kính củ khác [4] Thân hình trịn, chia nhiều cành nhỏ mọc chằng chịt với Thân non nhẵn, phủ lông ngắn-cứng hay lông dài, có cạnh, màu xanh, tím đậm tím nhạt, sau nhẵn, chuyển từ màu xanh sang nâu [1], [2], [5] Lá đơn, mọc đối Phiến hình mác bầu dục thn nhọn Gốc lệch, nhọn, trịn hình tim; mép phẳng hay lượn sóng, uốn mặt sau; tròn hay nhọn; mặt nhẵn hay phủ lông dài; mặt nhẵn hay phủ lơng Lá non màu tím sau chuyển sang xanh, có khơng hốc Domatia hốc gân phụ có phủ lơng Gân hình lơng chim, gồm - cặp gân bên, mặt dưới, lõm mặt Gân có lơng nhẵn mặt Lá kèm 2, dính nhau, ơm lấy thân, mỏng, có thùy nhọn hàn liền dưới, chia làm thùy, dài – mm, màu trắng, nâu hay tím nhạt, ôm sát vào thân, dài mm [4] Cụm hoa dạng tán, gồm 1-8 tán nách hay đầu cành, tán mang 1-14 hoa Hoa nhỏ, nở màu trắng, sau vàng hay tím đen Đài 3-4, dính dưới, hay khơng Tràng 3-4, có phần móng dính tạo thành ống hình chum hình trụ, nhẵn hay phủ lơng mặt ngồi; phần phiến rời, hình tam giác, mặt ngồi nhẵn hay phủ lơng, mặt có vịng lơng dày đặc, thẳng, màu trắng Quả hình cầu, từ 1-8 quả/1 tán, rời dính với thành kép mức độ khác Bề mặt nhẵn phủ lông, xanh non chuyển màu cam chín, mang đài cịn lại đỉnh quả, có hình dạng kích thước khơng [8] 1.1.3 Phân bố, thu hái, chế biến - Cây mọc hoang ven rừng, phân bố phổ biến vùng đồi núi thấp miền núi trung du tỉnh phía Bắc: Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang; số tỉnh miền Trung Tây Nguyên (Quảng Nam, Gia Lai, Kon Tum) [18] - Thời gian thu hoạch thường vào tháng 10-11, vào mùa xuân để tận dụng lấy giống trồng [4], [5], [10] - Bộ phận dùng: Rễ (Radix Morindae) [5], [10] - Chế biến: Rễ rửa đất cát, loại bỏ rễ con, phơi khô tới khơng dính tay, đập nhẹ cho bẹp, phơi đến khô sấy nhẹ đến khô [10], [16], [19] 1.1.4 Thành phần hố học Một số nhóm chất rễ Ba kích gồm: - Iridoid: Monotropein (0,042%), acid desacetyl asperulosidic (0,0038%), asperulosid (0,0003%), morindolid (0,0002%) , morofficinalosid (0,0001%), acid asperulosidic (0,0001%) [91] - Oligosaccharid: Nystose ( 3,0%) [21], l-borneol-6-o-β-D-apiosyl-β-Dglucosid (0,0001%) [91], 1F-fructofuranosylnystose, inulin-type hexasaccharid, heptasaccharid [19], [59], [94] - Ngoài cịn có hợp chất Anthraquinon [58], [89], [91], [93]; hợp chất sterol; hợp chất saponintriterpen (acid rotugenic 0,0007%) [91], hợp chất lacton [91], [94], số acid amin [16], [19] ... Ba kích Định danh dược liệu rễ Ba kích Việt Nam dựa số thị ADN Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích Dược điển Việt Nam số tiêu định tính định lượng CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Dược liệu rễ Ba kích. .. chuẩn từ nước Về tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích, Dược điển Trung Quốc, Bộ tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kơng Dược điển Việt Nam có chun luận dược liệu rễ Ba kích Trong đó, chun luận Ba. .. TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM VĂN KIỀN NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH (RADIX MORINDAE OFFICINALIS) CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM