BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ DOI: 10.15625/vap.2022.0063 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH PREBIOTICS CỦA POLYSACCHARIDE TÁCH CHIẾT TỪ SỢI NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum) Nguyễn Thị Bích Hằng1,*, Đặng Minh Nhật2, Chu Thị Kiều Oanh1, Nguyễn Thùy Linh1, Đoạn Chí Cường1, Bùi Đức Thắng1, Bùi Thái Hằng3 Tóm tắt Polysaccharide (PS) thành phần có hoạt tính sinh học cao nấm Linh chi Nghiên cứu đánh giá hoạt tính prebiotics sinh khối hệ sợi nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) môi trường nuôi cấy dịch thể Kết nghiên cứu rằng, PS chiết xuất từ hệ sợi nấm Linh chi có khả thúc đẩy sinh trưởng chủng vi sinh vật đường ruột Lactobacillus plantarum Dịch chiết từ môi trường nuôi cấy L plantarum có khả ức chế sinh trưởng Escherichia coli Staphylococcus aureus với vùng ức chế 25,667±0,577 mm, 25,667±1,443 mm Quá trình lên men L plantarum có bổ sung hệ sợi nấm Linh chi làm giảm pH môi trường sản xuất acid béo mạch ngắn (SCFAs) với hàm lượng acid butyric thu cao với 8096,06 mg/L, acid axetic acid propionic 1374,45 mg/L 760,69 mg/L Kết cho thấy tiềm sử dụng sợi nấm Linh chi làm nguồn nguyên liệu sản xuất prebiotics bên cạnh nguồn prebiotics thương mại khác thị trường Từ khóa: Acid béo mạch ngắn, Lactobacillus plantarum, nấm Linh chi, polysaccharide, prebiotics ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) loại dược liệu quý y học cổ truyền Với thành phần hóa học có chứa PS (giàu β-glucan), triterpenoid, steroid, saponin, nấm Linh chi ghi nhận có tác dụng phịng chống ung thư, tăng cường hệ miễn dịch, giải độc gan, hỗ trợ điều trị tiểu đường, giảm cholesterol máu (Wachtel cs., 2011) Ngày nay, việc hồn thiện quy trình tách chiết chế tác dụng hợp chất có hoạt tính sinh học nấm Linh chi thể người diễn mạnh mẽ Các phân đoạn PS tách chiết từ sợi nấm, thể G lucidum có cấu trúc đa dạng có liên quan đến chế chống oxi hóa, hạ đường huyết, chống khối u giảm lipid, natri máu (Liu cs., 2010) Các PS không tiêu hóa có nguồn gốc từ nấm nguồn prebiotics tiềm chúng ngăn ngừa nhiễm virus vi khuẩn cách tăng cường phát triển vi khuẩn probiotic ruột già (Russo cs., 2012) Khi có lên men hệ vi sinh đường ruột, polysaccharide tạo thành acid mạch ngắn (SC s có tác động t ch cực sức kh e đường ruột, ao gồm tác dụng làm tăng sinh tế iểu mô làm Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng Trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng Trường Cao đẳng Lương thực - Thực phẩm * Email: ntbhang@ued.udn.vn BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 580 giảm p đại tràng Những chuyển hóa SC s tác động tích cực đến sức kh e yếu tố thiết yếu việc trì tính tồn vẹn đường ruột, giảm độ pH, ức chế khả gây bệnh vi khuẩn, bảo vệ tính tồn vẹn tế bào biểu mô ruột kh i tác động học tổn thương hóa chất vi sinh vật Bên cạnh SC s cịn giúp tăng cường việc hấp thụ khống chất, kích thích hệ thống miễn dịch vật chủ, có khả chống viêm có vai trò quan trọng chống ung thư (Buse Usta-Gorgun cs., 2020) Cùng với việc nghiên cứu phát triển công nghệ nuôi trồng nấm ăn nấm dược liệu việc lên men dịch thể thu sinh khối sợi nấm mở triển vọng phát triển với ưu điểm rút ngắn chu kỳ ni trồng, dễ dàng kiểm sốt điều kiện nuôi cấy quy mô công nghiệp thu lượng lớn sinh khối hữu đáp ứng nhu cầu thực phẩm dược phẩm ngày tăng, đặc biệt tận dụng sinh khối sợi nấm giàu PS để sản xuất prebiotics vấn đề cần quan tâm nhằm đa dạng nguồn chất sản xuất prebiotics Vì vậy, nghiên cứu chúng tơi tiến hành đánh giá hoạt tính prebiotics sinh khối hệ sợi nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) phương pháp nuôi cấy dịch thể PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Giống nấm Linh chi (Ganoderma lucidum cung cấp Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng Chủng vi sinh vật Lactobacillus plantarum cung cấp công ty Cổ phần Công nghệ Biotech Việt Nam Chủng Escherichia coli cung cấp Phịng thí nghiệm Vi sinh Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng Chủng Staphylococcus aureus cung cấp Bệnh viện C Đà Nẵng 2.2 Phương pháp nghiên cứu Nuôi sinh khối hệ sợi nấm Nấm Linh chi nhân giống cấp ống nghiệm thuỷ tinh ( 1,8 cm, 180 mm) với thành phần môi trường gồm khoai tây (200 g/L), glucose (20 g/L) agar (15 g/L), ủ 25 oC 10 ngày Sau đó, từ ống nghiệm tiến hành ni cấy hệ sợi nấm Cho 150 mL môi trường PD+ (gồm khoai tây: 200 g; glucose: 20 g; cao nấm men: g; peptone: g; H2O: L) vào bình tam giác 500 mL Hấp khử trùng nước nóng 121 ℃ 30 phút Để nguội, cấy lượng tơ nấm vào bình từ ống giống cấp Đặt bình ni cấy vào máy lắc có tốc độ 150 vịng/phút nhiệt độ từ 18 ℃ đến 22 ℃ Sau ngày tiến hành thu hệ sợi nấm Thu sinh khối hệ sợi nấm: lấy giấy lọc (11 m, 150 mm) tiến hành sấy nhiệt độ 50 °C đến khối lượng không đổi Cân giấy lọc để biết khối lượng an đầu chúng, sau đặt giấy lọc vào phễu thủy tinh Tiến hành đổ dung dịch ni cấy bình tam giác qua phễu lọc, sau tất dung dịch nuôi cấy chảy qua giấy lọc đem sấy sinh khối giấy lọc Sấy nhiệt độ 50 °C đến khối lượng không đổi, để nguội tiến hành cân khối lượng (Choong cs., 2018) Tách chiết xác định hàm lượng PS nội bào Sợi nấm sấy nhiệt độ 50 oC để tách chiết Polysaccharid thô từ sợi nấm linh chi phân lập cách chiết xuất nước nóng kết tủa etanol theo PHẦN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 581 phương pháp Sun (2005) có số cải biến Tơ nấm sấy khô đem nghiền ngâm với nước 70 oC với tỉ lệ 1:20 Sau đó, lọc hỗn hợp thu dịch lọc tủa với cồn 96 % theo tỉ lệ 1:5 12 oC Tiến hành lọc hỗn hợp thu tủa rửa tủa lần với cồn 96 %, sấy 60 oC thu PS thô Loại protein phương pháp Sevag àm lượng đường PS xác định phương pháp Phenol-sulfuric acid (Dubois cs., 1956) Dựa vào phản ứng thủy phân PS thành monosaccharide, chúng tạo màu với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại ước sóng λ = 490nm Xây dựng đường chuẩn D–glucose sau đo mẫu thực tính tốn lượng PS Đánh giá khả kháng oxy hóa Khả loại b gốc tự ABTS∙+ định lượng thơng qua độ giảm hấp thụ ước sóng đặc trưng hợp chất (Nenadis cs., 2004) Dung dịch ABTS⁺ chuẩn bị cách cho mL dung dịch ABTS mM mL dung dịch K₂S₂O₈ 2.45 mM Để dung dịch bóng tối 16 giờ, sau pha lỗng 50 lần ethanol Tiến hành khảo sát hoạt động trung hòa gốc tự ABTS+ cách cho 990 μL dung dịch ABTS+ vào 10 μL cao chiết PS từ nấm Linh chi, nghiên cứu sử dụng PS với nồng độ mg/ml để đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa Hỗn hợp phản ứng ủ thời gian phút Sau đó, đo độ hấp thụ quang phổ ước sóng 734 nm Chất đối chứng dương sử dụng vitamin C với nồng độ mg/mL Khả gốc tự ABTS+ (I %) tính theo cơng thức (1) ( ) (1) Trong đó: : giá trị mật độ quang mẫu đối chứng âm, quang mẫu thử : giá trị mật độ Đánh giá kích thích sinh trưởng Lactobacillus plantarum Chủng vi sinh vật L plantarum nhân giống môi trường MRS (glucose: 20 g, pepton: 10 g, cao nấm men: g, K2HPO4: g, CH3COONa: g, MgSO4.7H2O: 0,58 g, H2O: L), pH = 37 ºC 24 ni cấy điều kiện kị khí (mẫu đối chứng) với mơi trường MRS có bổ sung 10 mg/mL nồng độ dịch chiết xuất hệ sợi nấm Linh chi Mật độ quang học mật độ tế bào vi khuẩn xác định ước sóng 620 nm (OD 620) máy quang phổ UV-VIS trình lên men (Siragusa cs., 2009) Sử dụng mơi trường MRS có bổ sung 10 mg/mL FOS (Fructo-oligosaccaride) inulin làm đối chứng dương Sau xác định mật độ quang tiến hành cấy trải đĩa đếm khuẩn lạc để xác định mật độ tế bào Mật độ tế bào tính theo cơng thức (2) ( ) Trong đó: số khuẩn lạc trung ình/đĩa; huyền phù tế bào cho vào đĩa (mL) (2) độ pha lỗng; V dung tích BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 582 Các cơng thức thí nghiệm: CT1: Mơi trường MRS; CT2: Môi trường MRS bổ sung 10 mg/mL FOS; CT3: Môi trường MRS bổ sung 10 mg/mL inulin; CT4: Môi trường MRS bổ sung 10 mg/mL chiết xuất PS từ nấm Linh chi Đánh giá ức chế sinh trưởng E coli S aureus Chủng vi sinh vật L plantarum nuôi 37 ºC 48 công thức CT1, CT2, CT3, CT4 thí nghiệm ly tâm điều kiện 5000 vòng/phút ºC 20 phút Sau ly tâm, tiến hành thu dịch để xác định ức chế sinh trưởng hai chủng E coli S aureus Sau đó, lấy 50 μl cấy vào đĩa môi trường NA (gồm dịch chiết nấm men: g/L, peptone: g/L, agar: 15 g/L) kỹ thuật cấy trang Tiến hành đục lỗ thạch có đường kính mm đĩa vi khuẩn gây bệnh Tiếp theo, phần dịch thu từ trình ly tâm cơng thức cho vào lỗ thạch ủ 37 ºC 24 Khả ức chế xác định cách đo so sánh đường kính vịng vơ khuẩn đĩa có bổ sung PS đối chứng (Rousseau cs., 2005) Định lượng SCFAs Sau 36 nuôi cấy L plantarum CT1, CT2, CT3, CT4 mẫu ly tâm 5000 vòng/phút ºC 10 phút lọc màng lọc 0,44 μm Các acid lactic, acetic, propionic utyric định lượng phương pháp sắc ký l ng hiệu cao (HPLC) Môi trường lên men ly tâm phần dịch ph a thu hoạch để phân tích acid hữu ằng HPLC sau lọc sử dụng màng acetate cellulose 0,20 µm Hệ thống HPLC dịng Agilent 1200 với máy dò RI ( gilent, Đức) cột Aminex HPX87H (BioRad, Hercules, CA, Mỹ sử dụng để thực phân tích SCFAs với pha động mM H2SO4 0,6 mL.min–1, 50 °C (Gullón cs., 2016) Tất thí nghiệm lặp lại lần Các phân tích thống kê thực với phần mềm thống kê Minitab phần mềm Microsoft Excel KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hàm lượng PS tổng số sinh khối sợi nấm Linh chi Kết nghiên cứu cho thấy, nuôi mơi trường dịch thể nấm Linh chi có hàm lượng PS đạt 0,88 ± 0,02 g/L Điều chứng t nuôi môi trường tối ưu dinh dưỡng, nấm Linh chi sinh trưởng tốt, t ch lũy hoạt chất có hoạt tính sinh học cao Tuy nhiên, kết nghiên cứu thấp so với nghiên cứu Supramani sản xuất IPS (intracellular polysaccharide) tối đa thu 1,57 ± 0,3 g/L điều kiện tối ưu hóa p an đầu 4, nồng độ glucose 40,45 g/L tốc độ lắc 103 vòng/phút (Supramani cs., 2019) Trong nghiên cứu Wang, PS tách chiết từ hệ sợi nấm Vân chi đạt 0,0390 ± 0,022 g/L (Wang cs., 2017 t khoảng 22 lần so với kết nghiên cứu 3.2 Khả kháng oxy hóa PS chiết xuất từ hệ sợi nấm Linh chi Hoạt động chống oxy hóa sản phẩm phụ thuộc vào nhiều yếu tố hàm lượng lipid, nồng độ chất chống oxy hóa, nhiệt độ, oxy, có mặt chất PHẦN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 583 Khả gốc tự (%) chống oxy hóa thành phần khác thực phẩm nước protein Kết kháng oxy hóa PS trình bày Hình 91.91 100 74.65 80 60 40 20 0 ĐC (- ĐC(+ PS sợi nấm Mẫu th nghiệm Hình Hoạt tính kháng oxi hóa PS chiết xuất từ hệ sợi nấm Linh chi Kết cho thấy, hoạt động chống oxi hóa PS tương đối cao 77,66 %, nhiên khả gốc tự PS sợi nấm Linh chi thấp so với vitamin C nồng độ (91,91 %), kết cao so với nghiên cứu Kalyoncu (2010) với hiệu suất bắt gốc tự sợi nấm Linh chi đạt 70,71 % Khả chống oxy hóa PS liên quan trực tiếp đến mối liên kết phân tử PS với ion có gốc oxi hóa tạo nên gốc ổn định, mà ngăn chặn chuỗi tác nhân phản ứng Thêm vào đó, có mặt lượng lớn nhóm hydroxyl phân tử PS tạo phản ứng mà kết hợp chúng với để tạo thành sản phẩm vô hại (Wang cs., 2014) 3.3 Ảnh hưởng PS đến phát triển vi sinh vật có lợi L plantarum vi sinh vật có lợi hệ đường ruột Chủng L plantarum ni cấy mơi trường MRS có khơng có bổ sung PS chiết xuất từ sợi nấm Linh chi, chúng so sánh với môi trường MRS bổ sung FOS inulin Kết thể hình bảng (A) (B) (C) (D) Ghi chú: A: L plantarum nuôi cấy CT1, B: L plantarum nuôi cấy CT2, C: L plantarum nuôi cấy CT3, D: L plantarum ni cấy CT4 Hình Số lượng khuẩn lạc L plantarum môi trường BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 584 Bảng Sự tăng trưởng L plantarum nuôi nghiệm thức nghiên cứu, 37 ºC 24 Công thức th nghiệm CT1 (n=3) CT2 (n=3) CT3 (n=3) CT4 (n=3) OD (nm) Mật độ tế (C U/mL a 2,8782 ± 0,0163 2,8891 ± 0,0066a 2,8894 ± 0,0152a 2,9354 ± 0,0029b 6,3 × 1011 18,2 × 1011 17,3 × 1011 19,5 × 1011 Ghi chú: Các chữ a, b thể khác có ý nghĩa (P < 0,05) Kết cho thấy môi trường dinh dưỡng MRS bổ sung PS sợi nấm (CT1) có khả k ch th ch sinh trưởng L plantarum tốt so với cơng thức cịn lại (CT2, CT3, CT4 Điều chứng t PS sợi nấm nguồn chất phù hợp cho lợi khuẩn đường ruột Kết phù hợp với nghiên cứu Sawangwan (2018), kết khảo sát hoạt t nh k ch th ch sinh trưởng vi sinh vật có lợi từ dịch chiết loại nấm, tất môi trường bổ sung chiết xuất nấm cho giá trị OD cao so với mẫu không bổ sung chiết xuất nấm (Sawangwan cs., 2018) Sau xác định mật độ quang L plantarum tiến hành cấy trải đĩa để xác định mật độ tế bào nhằm xác định số lượng khuẩn lạc mẫu sau 24 nuôi cấy Kết cho thấy, số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc mơi trường có bổ sung chiết xuất PS 19,5×1011 (CFU/mL , tương ứng OD = 2,9354 ± 0,0029 cao nhất, lớn công thức lại Cho thấy PS chiết xuất từ nấm khơng kích thích sinh trưởng lợi khuẩn mà làm tăng thời gian sinh trưởng chúng Như vậy, PS sợi nấm kích thích mạnh mẽ sinh trưởng vi khuẩn L plantarum, tốt nguồn prebiotics thương mại thị trường 3.4 Khả ức chế vi khuẩn gây bệnh Vi khuẩn E coli S aureus chủng vi sinh vật gây bệnh đường ruột, chúng thường gây ngộ độc, đau ụng, nôn mửa, tiêu chảy Sự phát triển L plantarum tạo chất ức chế vi sinh vật gây bệnh Dịch nuôi cấy mơi trường MRS theo nghiệm thức thí nghiệm sau 48 ly tâm lấy phần dịch bổ sung vào môi trường nuôi vi sinh vật gây bệnh theo phương pháp đục lỗ thạch để đánh giá khả ức chế vi sinh vật gây bệnh Tất dịch nuôi cấy L plantarum từ mơi trường ni cấy có khả ức chế mầm bệnh (E coli, S aureus) tốt Dịch nuôi cấy L plantarum môi trường bổ sung chiết xuất PS từ nấm Linh chi (CT4) tạo vùng ức chế E coli, S aureus 25,667 mm, cao so với CT1 1,84 mm 2,84 mm Đặc biệt hiệu vòng ức chế S aureus CT4 cao so với CT đối chứng CT1 không bổ sung nấm Linh chi Điều cho việc bổ sung PS nấm Linh chi vào môi trường nuôi cấy L plantarum tạo nhiều nhiều hợp chất có khả ức chế S aureus so với môi trường không bổ sung CT1 Vùng ức chế E coli từ dịch chiết môi trường nuôi cấy L plantarum CT4 (25,667 ± 0,577) gần tương đương với CT3 (25,167 ± 0,763) lớn so với CT2 (21,667 ± 0,288) CT1 (20,83 ± 0,558) PHẦN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 30 25 mm 20 ,20.83 ,19.83 ,24.67 ,21.67 ,25.17 ,25.00 ,25.67 ,25.67 15 10 CT1 CT2 S.aureus CT3 E.coli CT4 585 Hình Đường kính vùng ức chế vi sinh vật gây bệnh S aureus, E coli từ dịch nuôi cấy L plantarum nghiệm thức Ghi chú: CT1: môi trường MRS, CT2: môi trường MRS bổ sung FOS, CT3: môi trường MRS bổ sung inulin, CT4: môi trường MRS bổ sung chiết xuất PS Linh chi Hình Vịng vơ khuẩn S aureus (A) E coli (B) từ dịch nuôi cấy L plantarum nghiệm thức Ghi chú: 1: CT1, 2: CT2, 3: CT3, 4: CT4 FOS inulin bổ sung vào môi trường ni cấy cho hiệu vịng ức chế E coli khác Điều chứng t loại prebiotics có cấu trúc khác vi sinh vật có lợi chuyển hóa tiết mơi trường chất ức chế chủng vi sinh vật gây bệnh khác Điều phù hợp với nghiên cứu Sawangwan, nghiên cứu chiết xuất từ nấm cho hiệu suất vùng ức chế cao (Sawangwan cs., 2018) Vì vậy, việc bổ sung PS nấm vào mơi trường nuôi cấy L plantarum giúp tăng sản xuất chất giúp ức chế sinh trưởng vi sinh vật có hại 3.5 Khả sản xuất SCFAs trình lên men Lactobacillus plantarum Phân tích sắc ký l ng hiệu cao PS từ nấm Linh chi thúc đẩy sản xuất acetate, propionate utyrate Do đó, PS từ nấm Linh chi sử dụng để thay đổi cộng đồng vi sinh vật chức trao đổi chất đóng vai trị prebiotics để mang lại lợi ích sức kh e cho người Q trình ni cấy L plantarum tất nghiệm thức có khả sản xuất SC s Trong đó, hàm lượng acid acetic cao thu CT1 có mơi trường MRS với hàm lượng 686,84 ± 3,8875 mg/L Mặt khác, CT4 môi trường MRS bổ sung PS cho hàm lượng acid propionic cao đạt 706,12 ± 4,1515 mg/L với mơi trường có MRS (CT1 cho hàm lượng acid propionic 317,14 ± 4,643 mg/L thấp nhiều so với mơi trường có bổ sung FOS, inulin PS sợi nấm Linh chi Đặc biệt, q trình ni cấy L plantarum cơng thức sản xuất hàm lượng acid utyric cao ... thức th nghiệm CT1 (n=3) CT2 (n=3) CT3 (n=3) CT4 (n=3) OD (nm) Mật độ tế (C U/mL a 2,8782 ± 0,0 163 2,8891 ± 0,0066a 2,8894 ± 0,0152a 2,9354 ± 0,0029b 6,3 × 1011 18,2 × 1011 17,3 × 1011 19,5 ×... dịch chiết môi trường nuôi cấy L plantarum CT4 (25,667 ± 0,577) gần tương đương với CT3 (25 ,167 ± 0, 763) lớn so với CT2 (21,667 ± 0,288) CT1 (20,83 ± 0,558) PHẦN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC... ABTS⁺ chuẩn bị cách cho mL dung dịch ABTS mM mL dung dịch K₂S₂O₈ 2.45 mM Để dung dịch bóng tối 16 giờ, sau pha lỗng 50 lần ethanol Tiến hành khảo sát hoạt động trung hòa gốc tự ABTS+ cách cho