C¸ch thøc tr×nh bµy mét bµi b¸o c¸o tr×nh bµy Hội nghị Khoa học và Công nghệ Hạt nhân toàn quốc lần thứ XIII, Hạ Long, 8/2019 1 PHÂN TÍCH ĐỒNG VỊ BỀN (δ 13 C) TRONG MẬT ONG Ở VIỆT NAM Vũ Hoài, N T H T[.]
Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Hạt nhân tồn quốc lần thứ XIII, Hạ Long, 8/2019 PHÂN TÍCH ĐỒNG VỊ BỀN (δ 13C) TRONG MẬT ONG Ở VIỆT NAM Vũ Hoài, N.T.H Thịnh, H.L.Anh, V.T.Anh, T.V.Châu, M.Đ.Kiên Viện Khoa học Kỹ thuật hạt nhân 179 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Email: vuhoai1211@gmail.com Tóm tắt: Ứng dụng kỹ thuật đồng vị bền xác thực chất lượng thực phẩm xu hướng phổ biến giới Mục đích nghiên cứu nhằm ứng dụng kỹ thuật đồng vị bền để đánh giá độ tinh khiết mật ong thơng qua hàm lượng đường C4 có Để phát việc bổ sung đường vào mật ong, giá trị ⸹13C mật ong chiết suất protein từ mật ong phân tích hệ phổ kế tỉ số đồng vị (IRMS) Sự khác biệt giá trị không vượt 1o/oo theo tiêu chuẩn quốc tế Các kết nghiên cứu bước đầu bổ sung liệu đồng vị bền mẫu mật ong Việt Nam vào sở liệu đồng vị giới Hơn nữa, thông qua nghiên cứu cung cấp thêm cho quan chức công cụ để xác thực chất lượng mật ong lưu thơng thị trường Từ khóa : Đồng vị bền; Carbon; IRMS; Mật ong; Xác thực chất lượng I GIỚI THIỆU Trong tự nhiên, cacbon có đồng vị bền là: đồng vị bền 12C chiếm 98,89 % đồng vị bền 13C chiếm 1,11% Tuy nhiên, q trình hóa lý làm thay đổi tỷ lệ 13C/12C thành phần môi trường Sự thay đổi dù nhỏ tỷ lệ đồng vị nặng so với đồng vị nhẹ truy ngun q trình hóa học, vật lý sinh học Thành phần đồng vị 13C/12C mẫu môi trường thường xác định khối phổ kế tỷ số đồng vị so sánh với tỷ lệ 13C/12C mẫu chuẩn Pee Dee Belemnite, thể khác dạng phần nghìn (‰) thông qua giá trị delta C-13 (13C) Cây trồng cố định CO2 từ khơng khí vào mơ thực vật thơng qua q trình quang hợp theo ba chu trình: chu trình Calvin Benson loại thực vật C3, chu trình Hatch Slack loại thực vật C4 chu trình Crassulacean Acid Metabolism loại thực vật CAM Các loại thực vật khác có giá trị 13C khác Các loại thực vật C3 (nhãn, vải, cao su, hạt điều…) có giá trị 13C từ -33 đến -24‰ Các loại thực vật C4 (mía, ngơ…) có giá trị 13C từ -16 đến -10‰ loại thực vật CAM (dứa, xương rồng,…) có giá trị δ13C từ -11 đến -13,5 ‰ [1,2] Chính vậy, ong hút mật loại thực vật khác (từ chu trình C3, C4, CAM) loại mật ong thu có tỷ lệ đồng vị 13C/12C khác Việc bổ sung đường vào mật ong tinh khiết chủ yếu sản xuất từ loại C4 (đường, mía…) Nó làm thay đổi thành phần đồng vị bền Cacbon mật ong lại làm thay đổi thành phần đồng vị bền cacbon protein mật ong Nhờ có khác biệt giá trị 13C loại thực vật C3, C4, CAM, việc xác định hàm lượng đường C4 có mật ong đời Năm 1989, kỹ thuật đồng vị White & Winter nghiên cứu xây dựng để phát hàm lượng đường C4 mật ong Phương pháp hiệp hội hóa học phân tích Mỹ (AOAC) phê duyệt phương pháp thức xác định hàm lượng đường C4 mật ong Sự khác biệt giá trị 13C mật ong protein không vượt -1‰ tương ứng với lượng đường bỏ vào không 7% theo quy định quốc tế Hiện nay, có nhiều tác giả áp dụng phương pháp đồng vị C-13 để kiểm tra độ tinh khiết mật ong Trong số có tác giả Padovan cộng (2007)[3] nghiên cứu lượng đường C4 30 mẫu mật ong thương phẩm Braxin Kết cho thấy có 8/30 mẫu mật ong không tinh khiết với lượng đường C4 thêm vào từ 7,3 đến 18,6% Tại nghiên cứu khác nhóm tác giả Simsek [4] nhiều người khác sử dụng hệ khối phổ EA-IRMS để phân tích giá trị 13C 31 mẫu mật ong Thổ Nhĩ Kỳ 43 mẫu mật ong thương mại Các phân tích giá trị 13C mật ong thành phần protein mật ong Thổ Nhĩ Kỳ có giá trị từ -23,30 đến -27,58 ‰ từ -24,13 đến -26,76 ‰ Những giá trị 13C mẫu mật ong thương mại xác định nằm khoảng từ -11,28 đến -25,54 ‰ Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Hạt nhân tồn quốc lần thứ XIII, Hạ Long, 8/2019 19,35 đến -25,61‰ Có 10 mẫu mật ong thương mại tương đương với 23% số mẫu bị phát có lượng đường C4 Mục đích báo ứng dụng quy trình phân tích đồng vị bền ⸹13C mật ong để kiểm tra số mẫu mật ong Việt Nam Qua khẳng định tính thực tiễn phương pháp thực trạng an toàn thực phẩm Việt Nam II THỰC NGHIỆM Lấy mẫu chuẩn bị mẫu Mẫu mật ong thu thập từ người nuôi ong nước theo mùa hoa năm 2018 đầu năm 2019 như: hoa nhãn Hưng Yên, Sơn La, Nam Định; hoa cà phê Đắk Lắk; bạc hà Hà Giang, hoa cao su điều, keo Bình Phước Các mẫu mật ong lấy vụ hoa để đảm bảo mật ong không bị lẫn đường người nông dân cho ăn dưỡng đàn đầu vụ hoa lẫn hoa vụ Mẫu mật ong sau thu thập vào lọ thủy tinh có nắp kín, ghi rõ thời gian, địa điểm, ký hiệu mẫu Mẫu chuyển phịng thí nghiệm để bảo quản nhiệt độ phịng Trước phân tích khối phổ kế tỉ số đồng vị(EA-IRMS), mẫu lọc bỏ phấn hoa sáp ong lẫn màng lọc có kích thước 0.1 mm Một phần nhỏ (1g) dùng để phân tích trực tiếp hệ EA-IRMS, phần khác khoảng 30 g đem kết tủa tách protein Kết tủa protein mẫu mật ong cho phân tích δ13C Quy trình tách Protein tron mẫu mật ong áp dụng theo quy trình AOAC 998.12 Hiệp hội Hóa học Phân tích Mỹ [5] Quy trình thực theo bước sau: B1 Cân 10 g mật ong vào ống ly tâm dung tích 50 ml, thêm ml nước khử ion lắc hỗn hợp đồng B2 Thêm ml dung dịch Na2WO4 10% ml dung dịch H2SO4 0,335M vào ống thủy tinh 4ml lắc hỗn hợp B3 Hỗn hợp lắc sau cho thêm vào ống ly tâm dung dịch mật ong trước B4 Lắc trộn hỗn hợp mẫu gia nhiệt 80oC bể điều nhiệt xuất kết tủa đáy ống phần dung dịch ống trở nên suốt Nếu không xuất kết tủa huyền phù xuất bề mặt ống dung dịch không suốt thêm vào dung dịch 5ml axit H2SO4 0,335M gia nhiệt lại Lặp lại bước xuất kết tủa dung dịch trở nên suốt B5 Thêm nước khử ion vào ống ly tâm đến 50ml, lắc ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút phút B6 Dùng Pipet hút bỏ phần dung dịch suốt B7 Lặp lại lần B5 B6 B8 Gạn kiệt nước chuyển kết tủa vào lọ thủy tinh, sấy nhiệt độ 75oC 6h B9 Chuyển mẫu vào lọ đựng mẫu chuyên dụng, bảo quản bình hút ẩm chờ phân tích khối phổ kế tỷ số đồng vị (EA-IRMS) Hội nghị Khoa học Công nghệ Hạt nhân toàn quốc lần thứ XIII, Hạ Long, 8/2019 Phân tích 13C khối phổ tỷ số đồng vị Phương pháp phân tích thực hệ phổ kế tỉ số đồng vị (EA-IRMS) hãng IsoPrime cung cấp đặt phịng thí nghiệm Thủy văn đồng vị Viện KHKTHN: Hình Khối phổ kế tỉ số đồng vị phịng thí nghiệm Thủy văn đồng vị Viện Khoa học Kỹ thuật Hạt nhân Mẫu chuyển vào cột phản ứng có nhồi chất xúc tác oxit Crom oxit Coban Oxi tinh khiết bơm vào cột để đốt cháy mẫu hoàn toàn nhiệt độ 1030 oC chuyển mẫu thành khí COx COx khí mang He dẫn qua cột khử chứa đồng tinh khiết nhiệt độ 650oC bị chuyển hóa thành CO2 Khí tách nước làm qua cột bẫy nước, cột sắc ký dẫn vào khối phổ kế IRMS Dịng khí mang He cấp liên tục cho EA-IRMS kéo theo khí CO2 vào buồng ion hóa, khí chuyển thành ion môi trường chân không 10-5 đến 10-8 mBar Ion sau tạo thành gia tốc điện trường khối phổ kế Dòng ion gia tốc bị uốn cong từ trường ngồi theo định luật Lorenz với bán kính quỹ đạo phụ thuộc vào số khối ion điện tích chúng 1+ Các ion sau thu vào cốc Faraday để đếm số điện tích kênh có số khối 44 45 Thông tin tạo phân tích theo phần mềm chuyên dụng lưu trữ máy tính Thành phần đồng vị 13C/12C thể thơng qua giá trị 13C tính phần nghìn (‰) so sánh với chuẩn gốc Giá trị 13C tính theo cơng thức: 13C (‰) = ( Rsample Rstandard )*1000 [1.1] Trong đó: Rsample tỷ lệ mole đồng vị 13C/12C mẫu cần đo Rstandard tỷ lệ mole đồng vị 13C/12C mẫu chuẩn Mẫu chuẩn sử dụng phép phân tích 13C Belemnite) có tỷ lệ mole 13C/12C 0,0112372 mẫu VPDB (Vienna Pee Dee Các mẫu chuẩn quốc tế sử dụng cho chương trình kiểm sốt chất lượng phân tích tỷ số 13C/12C mật ong là: IAEA CO-8 (13CVPDB:-5,75‰), IAEA CO-9: (13CVPDB: 47,1‰) IAEA-CH-3 (13CVPDB: -22,72‰) Các mẫu chuẩn kẹp mẫu phân tích trước, sau phân tích mẻ 10 mẫu mật ong mẫu protein để đảm bảo độ xác kết phân tích Sử dụng cân phân tích có độ chia nhỏ 1g, với sai số ± 2g để cân 100 đến 200 g mẫu mật ong protein nó, gói mẫu vào nhộng thiếc đem phân tích tỷ số đồng vị 13C hệ khối phổ kế EA-IRMS phòng thí nghiệm Thủy văn đồng vị Các cơng việc kiểm sốt đảm bảo chất lượng phân tích (QA/QC) nhóm nghiên cứu tham khảo tài liệu [6, 7, 8] Hội nghị Khoa học Công nghệ Hạt nhân toàn quốc lần thứ XIII, Hạ Long, 8/2019 Hàm lượng đường C4 (đường mía, đường ngơ) mẫu mật ong tính theo cơng thức [9] sau: Đường C4 (%) = [(13CP - 13CH)/(13CP – 13Cs)] x 100 [1.2] Trong đó: - 13CP tỷ số đồng vị bon mẫu protein (‰) - 13CH tỷ số đồng vị bon mẫu mật ong (‰) - 13CS giá trị 13C trung bình chất tạo (đường ngơ, mía) (‰) Tổ chức AOAC khuyến cáo sử dụng trị 13C trung bình đường sản xuất từ C4 -9,7 ‰ để tính hàm lượng đường C4 công thức (1.2) Các sản phẩm mật ong coi khơng tinh khiết chứa hàm lượng đường C4 (ngơ, mía) lớn 7% [3, 5] III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kiểm tra độ xác phương pháp Trước phân tích hệ phổ kế tỉ số đồng vị, thông số độ ổn định (stability) độ tuyến tính (linearity) hệ phải kiểm tra khí chuẩn CO Độ lệch chuẩn giá trị ⸹13C 10 lần phân tích mẫu khí chuẩn < 0,03 ‰ 0,04 ‰ độ ổn định độ tuyến tính Khi đạt đủ điều kiện ổn định tuyến tính, tiến hành xây dựng đường chuẩn phương pháp dựa mối tương quan giá trị δ 13C mẫu chuẩn : IAEA CO-8 (δ13CVPDB: -5,75‰;), IAEA CO-9: (δ 13CVPDB: -47,1‰), IAEA-CH-3 (δ 13CVPDB: 22,72‰) khí chuẩn CO2 tinh khiết (δ13CCO2 ref) Kết đường chuẩn theo phương trình bậc trình bày hình 2: 25 -47.1, 17.99 20 15 10 δ13CCO2 ref -50 -40 -30 -22.72, -6.24 -20 -10 -5 -10 y = -0.994x - 28.825 R² = -15 -5.75, -23.11 -20 -25 δ13CVPDB -30 Hình Đường chuẩn tương quan giá trị δ13CCO2 ref giá trị chứng nhận δ 13CV-PDB có giá trị tương quan R =1 Để kiểm chứng độ xác đường chuẩn, nhóm nghiên cứu sử dụng mẫu chuẩn NBS 19 (δ 13CVPDB: 1,95‰) để phân tích mẫu thường, kết bảng cho thấy sai số nhỏ 0,02 (‰), qua chứng minh đường chuẩn đáng tin cậy Bảng1 Kết đo mẫu chuẩn NBS 19 dựa đường chuẩn tương quan Tên mẫu ⸹13C(‰) Sai số (‰) NBS 19 -1 1,93 0,02 NBS 19 -2 1,94 0,01 NBS 19 -3 1,94 0,01 Hội nghị Khoa học Công nghệ Hạt nhân toàn quốc lần thứ XIII, Hạ Long, 8/2019 Kết Có tất 11 mẫu mật ong bao gồm mẫu mật ong thu từ nhà nuôi ong mẫu mật ong thương phẩm thị trường: Mật ong Coffee Đắk Lắk mật ong hoa nhãn Hưng Yên nhóm nghiên cứu thu thập phân tích Mỗi mẫu mật ong mẫu protein phân tích lặp lần EA-IRMS lấy kết trung bình Kết chi tiết mẫu trình bày chi tiết bảng Bảng 2: Kết phân tích tổng hợp mẫu mật ong (A: mật ong pha đường C4, P: mật ong nguyên chất) Tên mật ong MẬT ONG HOA NHÃN NAM ĐỊNH MẬT ONG HOA NHÃN KHOÁI CHÂU MẬT ONG COFFEE ĐẮKLĂK MẬT ONG BẠC HÀ ĐỒNG VĂN 13C Mật ong (‰) 13C Protein (‰) Đường Chất C4 lượng (%) mật ong -32,44 ± 0,18 -32,49 ± 0,17 0,21 P -27,56 ± 0,28 -27,32 ± 0,26 P -19,32 ± 0,18 -20,12 ± 0,14 7,65 A -25,71 ± 0,07 -25,48 ± 0,10 P MẬT ONG NHÃN V1 -32,54 ± 0,01 -32,52 ± 0,03 P MẬT ONG NHÃN V2 MẬT ONG KEO BÌNH PHƯỚC MẬT ONG CAO SU ĐIỀU MẬT ONG HOA NHÃN HƯNG YÊN -32,08 ± 0,11 -32,04 ± 0,10 P -33,42 ± 0,05 -33,56 ± 0,07 0,58 P -30,45 ± 0,06 -30,55 ± 0,12 0,48 P -31,88 ± 0,04 -31,92 ± 0,14 0,20 P MẬT ONG TÁO -31,14 ± 0,15 -31,21 ± 0,21 0,34 P MẬT ONG HOA TẠP -31,65 ± 0,06 -31,26 ± 0,09 P Số liệu cho thấy độ lệch chuẩn giá trị 13C lần đo nhỏ 0,3 ‰ chứng tỏ ổn định hệ phân tích tỷ số đồng vị Bảng số liệu cho thấy giá trị đường C4 mẫu mật ong thu thập trực tiếp hộ ni ong có giá trị thấp 7% Trong mẫu mua ngồi thị trường mẫu mật ong Coffee Đắk Lắk lại có giá trị cao 7%, điều chứng tỏ mật ong pha thêm đường vào mật KẾT LUẬN Phương pháp phân tích đồng vị bền ⸹13C mẫu mật ong khối phổ kế tỉ số đồng vị nhằm xác định hàm lượng đường C4 có mẫu mật ong phương pháp tin cậy nhằm xác thực chất lượng mẫu mật ong thị trường Tuy nhiên, phương pháp kể chưa thể phân biệt mật ong pha với đường thủy phân từ tinh bột C3 Chính vậy, nhóm nghiên cứu nghiên cứu sâu nhằm cải thiện khắc phục hạn chế phương pháp nhằm giúp quan chức có cơng cụ xác thực xác để giảm thiểu cạnh tranh không lành mạnh kinh doanh bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng TÀI LIỆU THAM KHẢO Korth W & Ralston J 2002 Techniques for the detection of adulterated honey [monograph on the Internet] Australia: Rural Industries Research and Development Corporation, RIRDC Publication No 02/047 Hội nghị Khoa học Công nghệ Hạt nhân toàn quốc lần thứ XIII, Hạ Long, 8/2019 Padovan G.J., De Jong D., Rodrigues L.P & Marchini J.S 2003 Detection of adulteration of commercial honey samples by the 13C/12C isotopic ratio Food Chemistry 82, 633–636 Padovan, G.J., Rodrigues, L.P., Leme, I.A., Jong David, D., Marchini, J.S., 2007 Presence of C4 sugars in honey samples detected by the carbon isotope ratio measured by IRMS Eurasian Journal of Analytical Chemistry, 2:134-141 Tübtak Ume A Simsek, M Bilsel, A C Goren, 2012 13C/ 12C pattern of honey from Turkey and determination of adulteration in commercially available honey samples using EA-IRMS Food Chemistry, Volume 130, Issue 4, Pages 1115–1121 Association of Analytical Communities (AOAC) official methods of analysis method 998.12: C-4 plant sugars in honey, internal standard stable carbon isotope ratio method AOAC Int Gaithersburg MD (USA) 1999, Chap 44, 27–30 Rogers et al 2013 Modification of AOAC Official Method 998.12 to Add Filtration and/or Centrifugation: Interlaboratory Comparison Exercise Journal of the Association of Official Analytical Chemists, vol 96, no 3, 607 Rogers, K.M., Somerton, K., Rogers, P., & Cox, J (2010) Rapid Commun Mass Spectrom 24, 2370–2374 http://dx.doi org/10.1002/rcm.4642 Tosun, M., 2013 Detection of adulteration in honey samples added various sugar syrups with 13C/12C isotope ratio analysis method Food Chemistry, 138:1629- 1632 White, J.W., 1992 Internal standard stable carbon isotope ratio method for determination of C4 plant sugars in honey: collobrative study and evaluation of improved protein preparation procedure Journal of the Association of Official Analytical Chemists, 75:543-548 STABLE CARBON ISOTOPE RATIO ANALYSIS (⸹13C) OF HONEY IN VIETNAM Vu Hoai, N.T.H.Thinh, H.L.Anh,V.T.Anh, T.V.Chau, M.D.Kien Institute for Nuclear Science and Technology 179 Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Ha Noi Email: vuhoai1211@gmail.com Abstract: Application of stable isotope techniques in food quality authentication is a widespread in the world nowadays The objectives of this research were to develop a stable isotope technique to distinguish natural honey and honey added sugar through the amount of C4 sugar To detect the addition of sugar to honey, the value of ⸹13C in honey and protein extracted from honey was analyzed on the isotope ratio system (IRMS) The difference between this must not exceed 1o/oo according to international standards The research results initially added stable isotope data in Vietnam's honey samples to the world isotopic database Moreover, it provides the authorities with a tool to authenticate the quality of honey circulating in the market Key words: Stable isotope; Carbon; IRMS; Honey; Quality authentication ... OF HONEY IN VIETNAM Vu Hoai, N.T.H.Thinh, H.L.Anh,V.T.Anh, T.V.Chau, M.D.Kien Institute for Nuclear Science and Technology 179 Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Ha Noi Email: vuhoai1211@gmail.com Abstract:... BÌNH PHƯỚC MẬT ONG CAO SU ĐIỀU MẬT ONG HOA NHÃN HƯNG YÊN -32,08 ± 0,11 -32,04 ± 0,10 P -33,42 ± 0 ,05 -33,56 ± 0,07 0,58 P -30,45 ± 0,06 -30,55 ± 0,12 0,48 P -31,88 ± 0,04 -31,92 ± 0,14 0,20 P MẬT