Untitled TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 20, SOÁ T4 2017 Trang 123 Cảm biến sinh học galactose trên nền vật liệu nano ZnO • La Phan Phương Hạ • Nguyễn Thị Thu Hiền • Trần Quang Trung Trường Đại học[.]
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T4- 2017 Cảm biến sinh học galactose vật liệu nano ZnO • • • La Phan Phương Hạ Nguyễn Thị Thu Hiền Trần Quang Trung Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM TÓM TẮT (Bài nhận ngày 22 tháng 12 năm 2016, nhận đăng ngày 30 tháng 10 năm 2017) Vật liệu nano ZnO tồn nhiều dạng hình thái học khác như: nano, ống nano, sợi nano với tính chất quang điện đặc trưng nên ứng dụng chế tạo diod phát quang, dẫn sóng quang học, laser, cảm biến Bên cạnh đó, ZnO cịn có tính tương thích sinh học cao, khơng độc hại, độ ổn định hóa học cao, điểm đẳng điện cao nên nghiên cứu rộng rãi lĩnh vực cảm biến sinh học Trong báo cáo này, chế tạo điện cực hoạt động ứng dụng cảm biến sinh học galactose dựa nano ZnO cố định enzyme galactose oxidase Kết CV (Cyclic Voltammetry) thu cho thấy hệ điện cực hoạt động tốt dung dịch galactose oxidase nồng độ thay đổi từ 40 mM đến 230 mM với thời gian cố định enzyme 30 phút Từ khóa: nano ZnO, cảm biến sinh học, galactose oxidase, CV (Cyclic Voltammetry) MỞ ĐẦU Vật liệu ZnO đa dạng mặt hình thái học, từ cấu trúc chiều (dạng màng), chiều (dạng sợi) đến cấu trúc chiều (hạt nano), cấu trúc nano chiều ZnO đa dạng từ dạng wire (sợi) đến rod (thanh), pencil (chóp nhọn), tetra-pod (tứ cạnh)…với tính chất quang, điện đặc trưng nhà khoa học tập trung nghiên cứu nhằm ứng dụng chế tạo cảm biến hay thiết bị quang điện…Bên cạnh đó, ZnO cịn có số tính chất khơng độc hại, an tồn sinh học, tính tương thích sinh học cao, có khả kết hợp với số enzymes, có điểm đẳng điện cao, có liên kết ion cao nên phân hủy chậm môi trường pH sinh học bình thường nên ZnO cịn vật liệu ưu tiên lựa chọn lĩnh vực cảm biến sinh học (CBSH) [1, 2] Với hệ CBSH sử dụng vật liệu ZnO, ZnO đóng vai trị chất mang phủ trực tiếp lên điện cực (đóng vai trị điện cực hoạt động cho hệ CBSH, bên cạnh điện cực chuẩn Ag/AgCl), sau đó, loại enzyme khác cố định lên bề mặt điện cực có phủ lớp nano ZnO (tùy vào loại cảm biến sinh học dùng để xác định chất khác mà lựa chọn loại enzyme cho phù hợp – cụ thể CBSH galactose điện cực có phủ ZnO cố định enzyme galactose oxidase đặc trưng) Enzyme sau cố định lên ZnO cho số ưu điểm vượt trội so với enzyme ban đầu khơng bị hịa tan mà giữ hoạt độ xúc tác, bền với yếu tố hóa, lý… Các nhà khoa học sử dụng số kỹ thuật để cố định enzyme lên ZnO như: cố định hấp thụ vật lý hay cố định chất tạo liên kết ngang (cross-linking immobilization); việc cố định chất tạo liên kết ngang glutaraldehyde phương pháp sử dụng phổ biến [3] Với phương pháp này, glutaraldehyde enzyme hịa tan dung dịch đệm phosphate (PBS); sau điện cực ZnO ngâm vào dung Trang 123 Science & Technology Development, Vol 20, No.T4-2017 dịch để cố định enzyme lên ZnO Điện cực sau cố định enzyme, chưa sử dụng, bảo quản oC để đảm bảo giữ hoạt tính enzyme VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Tạo nano ZnO Trong báo cáo này, nano ZnO tổng hợp đế Fluorine-doped tin oxide (FTO) phương pháp dung dịch phương pháp tổng hợp với số lượng lớn Bên cạnh đó, nano tổng hợp từ phương pháp dung dịch có ưu điểm thiết bị thực nghiệm đơn giản, thực mơi trường khơng khí nhiệt độ thấp (từ 50–150 oC) Một số hóa chất sử dụng trình tổng hợp nano ZnO: Zn(CH3COO)2.H2O, Zn(NO3)2.6H2O, monoethanolamine (MEA), ethanol, hexamethylenetetramine (HMTA) (Merck) Qui trình thực nghiệm tạo nano ZnO tóm tắt thơng qua sơ đồ Hình Cố định enzyme galactose oxidase lên nano ZnO ngang glutaraldehyde (GA) Vì enzyme cần mơi trường pH trung tính (mơi trường pH sinh học) để khơng bị hoạt tính, cần sử dụng đệm phosphate để giúp ổn định pH cho dung dịch enzyme Dung dịch sử dụng thực nghiệm cố định enzyme có độ pH khoảng 7,4 Một số hóa chất sử dụng q trình cố định enzyme gồm: nước cất lần, enzyme galactose oxidase (Sigma, US) ≥3,000 units/g solid, galactose (Merck), đệm phosphate 1X (Ấn Độ), glutaraldehyde solution (Merck) Galactose oxidase cố định lên nano ZnO phương pháp trộn Đầu tiên, GA hòa tan dung dịch PBS 0,1 mM tạo thành dung dịch GA/PBS enzyme galactose oxidase hòa tan dung dịch PBS 0,1 mM tạo dung dịch enzyme/PBS Sau đó, dung dịch GA/PBS dung dịch enzyme/PBS trộn theo tỷ lệ 2:1 thể tích để tạo dung dịch enzyme/GA/PBS Cuối mẫu ZnO ngâm vào dung dịch enzyme/GA/PBS nhiệt độ phịng Tồn q trình cố định enzyme tóm tắt sơ đồ Hình Enzyme galactose oxidase cố định lên nano ZnO thông qua chất tạo liên kết (A) (B) Hình Sơ đồ thực nghiệm tạo nano ZnO: (A) tạo mầm ZnO đế FTO, (B) : tạo nano ZnO đế FTO phủ mầm ZnO Trang 124 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T4- 2017 ZnO/FTO Hình Sơ đồ qui trình cố định enzyme galactose oxidase lên ZnO Phương pháp quét vịng tuần hồn (CV) khảo sát khả hoạt động ZnO dung dịch galactose Mẫu ZnO sau cố định enzym galactose oxidase dùng để làm điện cực hoạt động hệ điện hóa gồm điện cực chuẩn Ag/AgCl, điện cực đối Pt điện cực hoạt động nano ZnO đế FTO cố định enzyme galactose oxidase (ký hiệu: GOx|ZnO|FTO) Dung dịch khảo sát dung dịch galactose, tốc độ quét 100 mV/s, khoảng quét từ -1,2 V đến V Hệ đo CV sử dụng hệ MPG-2 với phần mềm EC-Lab (Hình 3) Hình Hệ điện hóa MPG-2 giao diện phần mềm EC-Lab KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khảo sát cấu trúc nano ZnO Thanh nano ZnO chế tạo phương pháp dung dịch điều kiện 80 oC Hình thái bề mặt định hướng tinh thể nano ZnO phân tích thơng qua ảnh SEM phổ nhiễu xạ tia X Kết SEM cho thấy nano ZnO tạo có đường kính trung bình khoảng 40 nm, nano có xu hướng phát triển theo hướng trực giao với đế nền, bề mặt cắt ngang có hình lục giác tương đối đồng (Hình 4A), phổ XRD quan sát định hướng tinh thể ZnO phát triển ưu tiên mặt (002) (Hình 4B) Trang 125 Science & Technology Development, Vol 20, No.T4-2017 (A) (B) Hình Ảnh SEM (A) phổ XRD nano ZnO (B) Kết hợp giản đồ XRD ảnh SEM, nhóm tác giả nhận thấy nano ZnO tạo có số tính chất phù hợp cho ứng dụng CBSH như: diện tích bề mặt tiếp xúc lớn, có định hướng tinh thể tốt cho trình truyền dẫn điện tử Kết hợp với số tính chất vật liệu ZnO như: độ tương thích sinh học cao, khơng độc hại, liên kết ion cao nên bền với môi trường sinh học nên chúng tơi hồn tồn sử dụng nano ZnO tạo để cố định enzyme galactose oxidase, làm tiền đề cho nghiên cứu CBSH dựa vật liệu ZnO cấu trúc nano Khảo sát khả hoạt động GOx| ZnO | FTO dung dịch galactose Khả hoạt động GOx| ZnO | FTO dung dịch galactose khảo sát phương pháp quét vòng tuần hoàn (CV) tốc độ quét 100 mV/s, khoảng quét từ -1,2 V đến V với điện cực làm việc GOx| ZnO | FTO (thời gian cố định enzyme GOx 3,5 giờ) dung dịch điện giải galactose 200 mM Hình thể khả hoạt động nano ZnO có cố định enzyme khơng có cố định enzyme dung dịch galactose 200 mM (a) (b) Hình Đường cong CV khảo sát khả hoạt động ZnO|FTO (đường a) GOx|rod ZnO|FTO (đường b) dung dịch galactose 200 mM Trang 126 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T4- 2017 Trên Hình 5, đường cong a đường cong CV nano không cố định enzyme galactose oxidase dung dịch galactose 200 mM, khoảng từ -0,1 V đến V tín hiệu dòng thu thấp Đường cong b đường CV nano có cố định enzyme galactose oxidase dung dịch galactose 200 mM, tín hiệu dịng điện cực đại thu 0,106759 µA/mm², cao gấp nhiều lần so với tín hiệu dịng thu mẫu không cố định enzyme Kết cho thấy mẫu ZnO cố định enzyme đặt dung dịch galactose (200 mM) có tương tác với dung dịch galactose, mẫu ZnO không cố định enzyme khơng tương tác Kết giải thích có mặt enzyme galactose oxidase, tác dụng enzyme dung dịch galactose xảy phản ứng tạo galactohexodialdose H2O2, giải phóng electron, đóng góp cho tín hiệu dịng thu [4] Galactose oxidase Galactose + O2 H 2O Galacto-hexodialdose + H2O2 O2 + 2e- + 2H+ Khảo sát khả hoạt động GOx| ZnO | FTO theo thời gian cố định enzyme Trên sở xác định khác tín hiệu dịng điện thu mẫu ZnO có cố định khơng cố định enzyme, nhóm tác giả tiến hành khảo sát khả hoạt động điện cực GOx| ZnO | FTO theo thời gian cố định enzyme để xác định thời gian cố định enzyme tối ưu Thời gian cố định enzyme thay đổi 30 phút, 30 phút, giờ, 22 giờ, 66 Tiến hành đo CV dung dịch galactose 200 mM với mẫu điện cực có thời gian cố định enzyme khác nhau, thu giá trị tín hiệu dịng Bảng Đồ thị thể ảnh hưởng thời gian cố định GOx đến khả hoạt động GOx| ZnO | FTO thể Hình cho thấy thay đổi thời gian cố định enzyme ảnh hưởng đến tín hiệu dịng điện Tín hiệu đạt cao ứng với mẫu có thời gian cố định 30 phút (11,01.10 -2 μA/mm2 ) giảm dần tăng thời gian cố định lên Điều chứng tỏ thời gian cố định enzyme thay đổi có ảnh hưởng đến khả hoạt động enzyme Hiện tại, với trình thực nghiệm nhóm, kết tín hiệu ổn định tốt ứng với khoảng thời gian cố định enzyme từ đến Theo tài liệu tham khảo kết thực nghiệm nhóm nghiên cứu, thời gian cố định kéo dài hoạt tính enzyme bị giảm biến đổi cấu trúc enzyme q trình cố định [5] Do đó, nhóm tác giả chọn thời gian cố định enzyme 30 phút cho khảo sát Bảng Tín hiệu dòng điện theo thời gian ngâm Thời gian cố định enzyme (giờ) 2h30ph 3h30ph 5h 22h 66h Mật độ dịng trung bình (J) (10-2 μA/mm2) 6,84 11,01 10,02 5,57 5,01 Hình Đồ thị thể ảnh hưởng thời gian cố định GOx đến khả hoạt động GOx| ZnO | FTO dung dịch galactose 200 mM Trang 127 Science & Technology Development, Vol 20, No.T4-2017 Khảo sát khả hoạt động GOx| ZnO | FTO theo nồng độ galactose Tiến hành khảo sát khả hoạt động GOx| ZnO | FTO theo nồng độ galactose thay đổi từ 40 đến 230 mM phương pháp CV, kết tín hiệu dịng thể Bảng hệ điện cực GOx| ZnO | FTO có khả hoạt động tốt dung dịch galactose với khoảng nồng độ định Bảng Tín hiệu dịng điện theo nồng độ galactose Nồng độ (mM) 40 60 80 110 140 170 200 230 Mật độ dịng trung bình (J) (10-2 μA/mm2) 4,83 5,32 6,12 7,45 8,30 9,46 10,45 11,68 Sai số (10-2 μA/mm2) 0,41 0,52 0,38 0,58 0,83 0,44 0,70 0,60 Từ kết thu Bảng 2, vẽ đồ thị thể mối tương quan tín hiệu dịng điện thu nồng độ dung dịch galactose Đồ thị biểu diễn Hình cho thấy nồng độ dung dịch galactose tăng từ 40 đến 230 mM tín hiệu dịng điện thu tăng tuyến tính theo phương trình y = 0,03629x + 3,28223 với hệ số tương quan cao (R2 = 0,99791) Điều chứng tỏ nồng độ dung dịch galactose thay đổi lượng enzyme phản ứng hoạt hóa thay đổi, tác động tới lượng điện tử trao đổi dung dịch từ ảnh hưởng tới tín hiệu dịng điện Kết giúp cho chúng tơi có sở ban đầu tin Trang 128 Hình Đồ thị thể thay đổi dịng tuyến tính theo nồng độ galactose KẾT LUẬN Bài báo trình bày trình chế tạo nano ZnO phương pháp dung dịch nhiệt độ phòng ứng dụng nano ZnO hệ điện cực CBSH galactose Kết báo cho thấy nano ZnO tạo có đường kính trung bình 40 nm, định hướng tinh thể (002), phát triển tương đối trực giao với đế FTO Thanh nano ZnO sau cố định enzyme galactose oxidase 30 phút nhiệt độ phòng cho khả hoạt động tốt dung dịch galactose có nồng độ thay đổi từ 40 đến 230 mM Lời cảm ơn: Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn đến PTN Bộ môn Vật lý Chất rắn – Khoa Vật lý-Vật lý Kỹ thuật, PTN Hóa Lý – Khoa Hóa, Khoa Khoa học Vật liệu thuộc Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM hỗ trợ nhóm tác giả cơng tác thực nghiệm TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SOÁ T4- 2017 Galactose biosensor based on ZnO nano material • • • La Phan Phuong Ha Nguyen Thi Thu Hien Tran Quang Trung Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM ABSTRACT ZnO nanomaterial is a n-type semiconductor isoelectric point (IEP: 9.5), ect…; ZnO nanorods material and exits in a variety of one-dimensional were largely used for biosensor In this work, nanostructures such as: nanorods, nanotubes, we developed enzyme electrode biosensor based nanowalls, nanowires, ect… [3] They have on ZnO nanorods to test galactose solution by potential applications in making devices such as: immobilizing galactose oxidase on ZnO nanorods light emiting diodes, optical waveguides, grown on FTO substrate The result showed that nanolaser, gas sensor, biosensor Due to the high the proposed biosensor had the linear detection surface area to volume ratios, nontoxicity, range from 40 to 230 mM galactose solution chemical stability, biocompatibility, the high Key words: nano ZnO, biosensor, galactose oxidase, CV (Cyclic Voltammetry) TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] M Ahmad, et al., A single ZnO nanofiberbased highly sensitive amperometric glucose biosensor The Journal of Physical Chemistry C , 114, 20, 9308–9313 (2010) [2] Willander, et al., ZnO based potentiometric and amperometric nanosensors, Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 14, 9, 6497–6508 (2014) [3] N.Đ Lượng, et al., Công nghệ enzyme NXB Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh, 73 –100 (2004) [4] K Khun, et al., Development of galactose biosensor based on functionalized ZnO nanorods with galactose oxidase Journal of Sensors ID 696247, pages, (2012) [5] W Aehle, Enzymes in industry: products and applications Wiley – VCH Verlag GmbH & Co KGaA, Weinheim, 17, (2004) Trang 129 ... electrode biosensor based nanowalls, nanowires, ect… [3] They have on ZnO nanorods to test galactose solution by potential applications in making devices such as: immobilizing galactose oxidase on ZnO. .. 20, SỐ T4- 2017 Galactose biosensor based on ZnO nano material • • • La Phan Phuong Ha Nguyen Thi Thu Hien Tran Quang Trung Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM ABSTRACT ZnO nanomaterial is... semiconductor isoelectric point (IEP: 9.5), ect…; ZnO nanorods material and exits in a variety of one-dimensional were largely used for biosensor In this work, nanostructures such as: nanorods, nanotubes,