Untitled TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 18, SOÁ T3 2015 Trang 5 Khả năng diệt sâu khoang Spodoptera litura của vi khuẩn Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN và hợp chất thứ cấp prodigios[.]
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SỐ T3- 2015 Khả diệt sâu khoang Spodoptera litura vi khuẩn Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN hợp chất thứ cấp prodigiosin vi khuẩn Nguyễn Hoài Hương Nguyễn Hoàng Anh Kha Trường Đại học Công nghệ TP.HCM ( Bài nhận ngày 12 tháng 12 năm 2014, nhận đăng ngày 22 tháng 09 năm 2015) TÓM TẮT Vi khuẩn SH1 phân lập từ tuyến trùng diệt sâu (EPN) Heterorhabditis indica CP16 giải phóng từ xác sâu (Spodoptera litura) định danh Serratia marcescens Kit API 20E giải trình tự 16S rDNA SH1 có khả diệt sâu khoang Spodoptera litura, tiêm 23 cfu/sâu làm sâu chết 65 % sau 10 giờ; cho ăn theo phương pháp nhỏ giọt bề mặt mật độ 170 cfu/cm2 gây chết 50 % sâu sau 72 Sắc tố màu đỏ vi khuẩn khẳng định hợp chất thứ cấp prodigiosin qua màu sắc, phổ hấp thụ UV/VIS ESI-MS Khi tiêm sắc tố vào xoang máu 422 ng/sâu gây chết 65 % sâu sau 10 giờ, cho ăn nồng độ 27,66 ng/cm2 gây chết 90 % sâu sau 120 Từ khóa: Độc lực sâu, phương pháp nhỏ giọt bề mặt lá, prodigiosin, Serratia marcescens, tiêm xoang máu, tuyến trùng EPN MỞ ĐẦU Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (entomopathogenic nematode – EPN) gần lôi nhiều quan tâm nhà bảo vệ thực vật khả diệt sâu hoạt lực cao thời gian ngắn từ 24 – 48 [1] Hai chi ứng dụng rộng rãi để sản xuất chế phẩm bảo vệ thực vật Steinernema spp Heterorhabditis spp Khả gây bệnh côn trùng khám phá tồn vi khuẩn cộng sinh [2] Mỗi loài tuyến trùng có vi khuẩn cộng sinh tương ứng: Xenorhabdus spp cộng sinh với Steinernema spp Photorhabdus luminescens cộng sinh với Heterorhabditis spp [3] Gần người ta phát diện Serratia marcescens tuyến trùng EPN [4, 5] Một số nghiên cứu chứng minh S marcescens S nematodiphila đóng vai trị vi khuẩn cộng sinh tuyến trùng EPN [6, 7] Theo Grimont & Grimont, 2006 [8], Serratia spp vi khuẩn gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae Đại diện chi Serratia Serratia marcescens Có thể phân lập Serratia spp từ môi trường đất nước, thực vật, côn trùng động vật có xương sống Serratia spp có khả tổng hợp enzymes DNase, lipase, protease chitinase Đặc biệt, Serratia marcenscens có khả tổng hợp sắc tố đỏ prodigiosin, pyrrole alkaloid (2-methyl-3amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N3O = 323,44) Serratia marcescens Bizio từ lâu Trang Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 biết có khả diệt sâu [9], Serratia entomophila sử dụng tác nhân diệt sâu sinh học New Zealand để tiêu diệt Costelytra zealandica [10] Prodigiosin thuộc nhóm prodiginine biết đến hợp chất thứ cấp vi sinh vật có tác dụng diệt khuẩn, diệt tảo, ức chế miễn dịch tế bào ung thư [11] Trong trình phân lập vi khuẩn cộng sinh từ số chủng tuyến trùng EPN nguồn gốc Việt Nam, cụ thể chủng Heterorhabditis indica CP 16 tác giả Nguyễn Ngọc Châu, 2009 [12], thu vi khuẩn khác với vi khuẩn cộng sinh truyền thống Bài báo trình bày kết phân lập khảo sát khả diệt sâu chủng phân lập nhằm xác định vai trò chúng hoạt lực diệt sâu tuyến trùng EPN Ngồi ra, nghiên cứu cịn khẳng định sắc tố chủng phân lập sinh prodigiosin thể độc lực sâu, tác nhân gây độc vi khuẩn tổng hợp VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguồn phân lập vi khuẩn, sâu thí nghiệm Tuyến trùng Heterorhabditis indica CP 16 (H.CP 16) TS Nguyễn Ngọc Châu, Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật VN cung cấp Ấu trùng sâu khoang Spodoptera litura nuôi thức ăn nhân tạo TS Nguyễn Thị Hai, Đại học Công nghệ TP HCM cung cấp Phân lập vi khuẩn từ tuyến trùng Heterohabditis indica CP 16 (H CP 16) Phân lập vi khuẩn tiến hành dựa vào phương pháp Akhurst (1980) [13] Park & Yu (1999) [14] Tuyến trùng giai đoạn cảm nhiễm (IJs) trữ lạnh 10 oC lấy để nhiệt độ phòng 30 phút để tuyến trùng hoạt động trở lại Rửa – lần formalin 0,1 %, sau rửa lại nước cất vô trùng lần Ly tâm 500 vòng/phút phút để lắng tự nhiên, thu Trang tuyến trùng Ngâm tuyến trùng dung dịch NaClO 0,5 % 10 phút, lặp lại lần, rửa lại nước cất vô trùng lần Ly tâm tuyến trùng 4000 vòng/phút 30 phút để giải phóng vi khuẩn Cho vi khuẩn tăng sinh môi trường nutrien broth (NB) 48 nhiệt độ phòng, tối, lắc 210 vòng/phút Cấy trang vi khuẩn sau pha lỗng mơi trường MacConkey NBTA (20 g agar, 25 mg bromothymol blue 40 mg triphenyl tetrazolium (Sigma) L nước cất) ủ nhiệt độ phịng bóng tối 48 Sau thời gian ủ, chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy lại môi trường MacConkey NBTA để khảo sát hình thái khuẩn lạc Định danh vi khuẩn phân lập Các chủng phân lập nhuộm Gram, thử nghiệm khả di động, thử nghiệm TSI, lên men lactose, sử dụng Kit API 20E (Biomerieux) với 20 thử nghiệm bản, kèm thêm thử nghiệm oxidase, khử nitrate thử nghiệm OF thực bổ sung Định danh thực nhờ hỗ trợ APIWEB từ kết số hóa gồm chữ số thử nghiệm sinh hóa nhà sản xuất hướng dẫn Định danh phương pháp giải trình tự 16S rDNA (do công ty Nam Khoa Biotek tiến hành) DNA trích ly từ vi khuẩn phân lập khiết gene mã hóa rRNA 16S khuếch đại phương pháp PCR sử dụng cặp mồi 16S-F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 16S-R: ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT với chu kỳ luân nhiệt: chu kỳ 95 oC/5 phút 40 chu kỳ gồm 94 oC/30 giây, 56 oC/30 giây; 72 oC/1 phút; cuối chu kỳ 72 oC/10 phút Điện di kiểm tra kích thước band 550 bp Tinh DNA: sử dụng enzyme exonuclease (EXO) alkaline phosphatase (ALK) Phản ứng PCR DNA tinh với chu kỳ luân nhiệt: chu kỳ 96 oC/1 phút ; 25 chu kỳ gồm 96 oC/10 giây; 50 oC/5 giây; 60 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SỐ T3- 2015 o C/4 phút Giải trình tự máy 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) Tra cứu ngân hàng gene (Genbank) sử dụng BLAST search National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi nlm.nih.gov/) Xây dựng phát sinh lồi dựa so sánh trình tự 16S rDNA số chủng Serratia spp., Xenorhabdus spp., Photorhabdus luminescens ngân hàng gene Lên men thu vi khuẩn sắc tố prodigiosin Vi khuẩn SH1 tăng sinh mơi trường NB, lắc 150 vịng/phút nhiệt độ phòng tối 24 Vi khuẩn tăng sinh nêu trên, cấy giống % vào môi trường bột hạt đậu phộng [15] bình tam giác đặt máy lắc 150 vòng/phút nhiệt độ phòng (28-30 oC) tối 48 Sinh khối tách khỏi canh trường ly tâm 4000 vòng/phút 15 phút sau chuyển vào hỗn hợp ethanol: HCl M (95:5 v/v) lắc mạnh, sau ly tâm lần hai thu dịch loại bỏ sinh khối màu Dịch thu từ hai lần ly tâm chứa sắc tố hịa chung với thể tích tương đương ether dầu hỏa Trích ly màu phễu chiết, thu màu tan ether dầu hỏa rửa nhiều lần nước muối bão hịa quay đuổi hết dung mơi Sắc tố thu hịa tan hỗn hợp ethanol: HCl M (95:5 v/v) quét phổ UV/VIS từ 400 đến 700 nm để tìm bước sóng hấp thụ cực đại max Độ hấp thụ max sử dụng để xây đựng đường chuẩn sắc tố Xác định độ tinh qua sắc ký mỏng (TLC) ethyl acetate 100 % ether dầu hỏa: acetone 7:3 (v/v) Khối lượng phân tử xác định phương pháp khối phổ ion hóa tia điện (ESI-MS), phịng thí nghiệm Viện khoa học kỹ thuật nơng nghiệp miền Nam, thuộc Viện Thú y Nam bộ, 12 Nguyễn Chí Thanh, Q 10, TP HCM thực Xác định độc lực vi khuẩn sắc tố sâu Trứng sâu khoang Spodoptera litura ấp nở Sau đó, sâu nuôi thầu dầu tuổi thí nghiệm Sau sâu ni thức ăn nhân tạo hộp nhựa Vi khuẩn SH1 tăng sinh Mật độ tế bào xác định phương pháp đo mật độ quang sử dụng đường chuẩn tế bào Sắc tố sau quay hồ tan vào mL DMSO 15 mL PBS, pha loãng PBS để nồng độ 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 10-6 Xác định nồng độ hợp chất màu tương ứng nồng độ pha lỗng phương pháp quang phổ bước sóng max xác định Thử nghiệm độc lực phương pháp tiêm Mỗi hộp thí nghiệm chứa 10 sâu khoang tuổi (khối lượng 0,52 – 0,63 g) sâu khoang tiêm sống lưng vào xoang máu kim 26 G với µL dung dịch vi khuẩn nồng độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 10-6 huyền phù tế bào sau tăng sinh sắc tố nồng độ pha loãng 101 , 10-2, 10-3 10-4 Mẫu đối chứng thay huyền phù tế bào µL dung dịch pha lỗng PBS Sâu sau tiêm nuôi thức ăn nhân tạo theo dõi sâu chết theo thời gian Xác sâu chết sử dụng làm nguồn phân lập để khẳng định vi khuẩn cách cấy ria huyết tương thạch MacConkey Thử nghiệm độc lực phương pháp cho ăn Mỗi hộp thí nghiệm chứa 30 sâu khoang tuổi thầu dầu (kích thước 100 x 60 mm2) quét lên bề mặt 200 μL huyền phù vi khuẩn nồng độ 10-1, 10-2, 103, 10-4, 10-5 10-6 Trang Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 sắc tố nồng độ pha loãng 100, 10-1, 10-2, 103 , 10-4 10-5 Mẫu đối chứng thay huyền phù tế bào hợp chất thứ cấp màu 600 μL dung dịch pha lỗng PBS Mỗi thí nghiệm lặp lại lần theo dõi sâu chết theo thời gian đến hộp đối chứng chuyển sang nhộng Xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Statgraphics Centurion XV để phân tích ANOVA KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập định danh vi khuẩn từ tuyến trùng Heterorhabditis indica CP 16 (H CP 16) Với mục đích phân lập vi khuẩn cộng sinh tuyến trùng EPN, phương pháp Arkhurst, 1980 Park, 1999 mô tả thử nghiệm Kết thu chủng vi khuẩn SH1 từ H CP 16 ba môi trường MacConkey, NA NBTA Chủng vi khuẩn lầm lẫn với vi khuẩn cộng sinh truyền thống tuyến trùng Xenorhabdus spp Photorhabdus luminescens vi khuẩn Gram âm, di động, có khả hấp thu màu xanh từ môi trường NBTA cho khuẩn lạc nhớt Tuy nhiên điểm khác biệt khuẩn lạc có màu đỏ thắm, catalase dương tính khử nitrate cho thấy chúng khác biệt rõ rệt với Xenorhabdus spp Photorhabdus luminescens [13] Định danh Kit API 20E cho thấy chủng phân lập SH1 Serratia marcescens với tỉ lệ tương đồng 97,4 % Định danh giải trình 16S rDNA so sánh ngân hàng gene NCBI cho thấy tỉ lệ tương đồng SH1 với chủng thuộc loài Serratia marcescens 99,7-100 %, đặc biệt tương đồng với chủng S marcescens Bizio đến 100 % S nematodiphila lồi có quan hệ họ hàng gần với chủng phân lập SH1 với tỉ lệ tương đồng 99,6 % phân lập từ tuyến trùng diệt sâu EPN Các loài Serratia khác có tỉ lệ tương đồng khoảng 95 % với chủng SH1 So sánh với vi khuẩn cộng sinh truyền thống EPN Xenorhabdus spp Photorhabdus luminescens, chủng phân lập có khác biệt đáng kể (gần 10 %) trình tự 16S rDNA (Bảng 1) Bảng So sánh trình tự 16S rDNA vi khuẩn SH1 số chủng khác STT Trang Chủng Tỉ lệ Nguồn phân lập Mã số truy cập TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SỐ T3- 2015 tương đồng, % S marcescens subsp marcescens Bizio 1823 (DSM 30121) 100 Nước hồ NR04198 S marcescens subsp sakuensis BM0527 99,8 Ruột muỗi Anopheles gambiae JQ680891 S marcescens PW180 99,7 Tuyến trùng Bursaphelenchusxylophilus JF494825 S nematodiphila DZ0503SBSH1-2 99,6 EPN Heterorhabditidoides chongmingensis EU914257 S entomophila 96,7 Sâu Heliothis sp S liquefaciens CIP 103238 96,9 - NR042062 S symbiotica 95,7 Rệp đậu đen Aphis fabae GU394001 S rubidaea 15 94,3 Hoa tulip KC953862 Xenorhabdus nematophila ATCC 19061 90,2 EPN Steinernema spp D78009 10 Photorhabdus luminescens ATCC 29304 89,6 EPN Heterorhabditis spp D78004 Kết cho phép kết luận chủng phân lập thuộc loài Serratia marcescens Trình tự 16S rDNA chúng SH1 (> 500 bp) truy cập ngân hàng gene NCBI với mã số truy cập KF534508 Thông thường vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN Heterorhabditis phải Photorhabdus luminescens tương ứng Chủng tuyến trùng H CP 16 cho thấy khả diệt sâu khoang tốt (kết chưa cơng bố) Xác sâu chết có màu hồng đặc trưng sắc tố prodigiosin Serratia marcescens Như sắc tố có vai trị độc lực tuyến trùng EPN đối GU370899 với sâu Lên men thu sắc tố prodigiosin Sắc tố prodigiosin nhiều vi khuẩn Gram âm tổng hợp có Serratia marcescens Để khẳng định sắc tố màu đỏ chủng SH1 sinh prodigiosin, sau trích ly sắc tố ethanol, quét phổ UV/VIS từ 400 nm đến 700 nm thu phổ hấp thụ Hình 1A Màu bước sóng hấp thụ cực đại sắc tố phụ thuộc vào pH, pH acid (1-6), sắc tố có màu hồng max 535 nm; pH trung tính kiềm, sắc tố có màu vàng cam max 469 nm (Hình 1B) Trang Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 Hình Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại phân tử sắc tố trích ly từ tế bào SH1, A) Phổ hấp thụ UV/VIS sắc tố ethanol: HCl (95:5, v/v), B) Bước sóng hấp thụ cực đại sắc tố phụ thuộc vào pH Sử dụng phương pháp sắc ký mỏng sắc tố qua hai hệ dung môi ether dầu hỏa: acetone (7:3, [v/v] ethyl acetate) thu vạch sắc tố hồng với Rf 0,68 0,84 (Hình 2) Hình Phân tích sắc tố SH1 tổng hợp, A) Sắc ký mỏng sử dụng hệ dung môi ether dầu hỏa: acetone (trái) ethyl acetate (phải), B) Khối phổ ESI Phân tích sắc tố phương pháp khối phổ ESI cho kết Hình 2B với peak [M+H]+ 324,8 amu, tương ứng khối lượng phân tử prodigiosin 323,44 Các peak [M+2H+H]+ = 326,8, [M+4H+H]+ = 328,8, [M+6H+H]+ = 330,8 hydro hóa 1, vòng pyrrole tạo thành pyrrolidine Các kết chứng minh sắc tố màu đỏ S marcescens SH1 tổng hợp prodigiosin Độc lực vi khuẩn sâu Trang 10 Hiệu lực diệt sâu thử nghiệm phương pháp tiêm trực tiếp vào xoang máu Chủng SH1 phân lập từ tuyến trùng EPN H CP16, chủng có vai trị hoạt tính diệt sâu tuyến trùng Áp dụng phương pháp tiêm trực tiếp vào xoang máu sâu phương pháp thường áp dụng để xác định hiệu lực vi khuẩn cộng sinh tuyến trùng [9] Kết thí nghiệm thể Hình Hình cho thấy dấu hiệu sâu chết tiêm vi khuẩn SH1 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SỐ T3- 2015 tương tự sâu chết tuyến trùng, màu đỏ đặc trưng xác sâu Đó màu đỏ khuẩn lạc SH1 canh môi trường thạch sắc tố prodigiosin Từ xác sâu chết tiêm vi khuẩn, tái phân lập vi khuẩn màu đỏ thạch NBTA (Hình 3C) Hình Thí nghiệm tiêm trực tiếp tế bào chủng phân lập vào sâu khoang Spodoptera litura A) Sâu khoang chết tuyến trùng (H CP16); B) Sâu khoang chết sau tiêm vi khuần (SH1); C) Vi khuẩn phân lập từ H.CP 16; D) Khả di động SH1 thạch NA Hình 4A cho thấy tỉ lệ sâu chết 65 % sau 10 nồng độ 23 cfu SH1/sâu Sau 30 gần 100 % sâu chết nồng độ Thời gian chết với tỉ lệ chết cao tương ứng với độc lực cao tuyến trùng nguồn phân lập vi khuẩn [12] Theo Khan & Goldsworthy, 2007 [16], tiêm châu chấu với E.coli K-12 HB101 > 106 cfu/con, tỉ lệ chết % sau 72 Theo Bucher (2012) [9], LD50