Luận án nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn escherichia coli (nhóm vtec) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại hà nội

1 MỞ ẦU Tính cấp thiết củ đề tài Trên phạm vi giới, ước tính hàng năm có khoảng tỷ người bị ngộ độc thực phẩm (Đậu Ngọc Hào, 2011) [2] Ở Việt Nam, theo ước tính thống kê Tổ chức y tế giới (WHO) có khoảng triệu người bị ngộ độc thực phẩm năm, phần lớn xảy bếp ăn tập thể, khu công nghiệp, bếp ăn học sinh Năm 2010, nước xảy 175 vụ ngộ độc thực phẩm, làm 5.000 người mắc 42 trường hợp tử vong Thiệt hại kinh tế cho chi phí điều trị bệnh nghỉ làm việc khoảng triệu USD/năm (Phương Thuận, 2011) [101] Các số cho thấy thực trạng đáng lo ngại vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP) VSATTP có vai trị quan trọng sống người, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe, tuổi thọ, chất lượng môi trường, chất lượng sống, phát triển kinh tế uy tín thương hiệu sản phẩm, uy tín quốc gia Trong số nhiều nguyên nhân vi sinh vật gây vụ ngộ độc thực phẩm người (Salmonella, E coli, Vibrio cholera, Listeria, Clostridium botulinum ), năm gần đây, vi khuẩn E coli thuộc nhóm Verotoxigenic (VTEC) ngày biết đến tác nhân quan trọng Verotoxigenic E coli khái niệm dùng để nhóm vi khuẩn E coli có khả sản sinh độc tố Verotoxin Shiga-like toxin Các chủng VTEC nguyên nhân gây ca bệnh lẻ tẻ ổ dịch lớn bệnh viêm ruột xuất huyết (HC) hội chứng urê huyết (HUS), ban xuất huyết giảm tiểu cầu (TTP), viêm đường niệu (Urinary tract infections), viêm màng não (meningitis) (XU cs 1999) [92]; (Lake Cressey, 2002) [49] Mặc dù E coli O157: H7 biết đến serotyp phân lập từ vụ dịch hầu hết quốc gia, chủng VTEC thuộc serotyp khác chứng minh có mối liên quan chặt chẽ với vụ dịch tương tự serotyp O111 Canada, Italia, Đức Australia, O103 Pháp, Italia O104 Mỹ Ở nhiều quốc gia, VTEC tác nhân gây bệnh tiêu chảy hay gặp (Wachsmuth, 1994) [95] Ví dụ, Đức, VTEC phân lập từ trẻ em bị tiêu chảy nguyên nhân vi khuẩn thường gặp đứng thứ 2, sau Salmonella Áo, VTEC nguyên nhân thường gặp thứ 3, sau Salmonella Campylobacter (Allerberger cs 1996) [12] Gần nhất, tháng năm 2011, đợt dịch E coli bùng phát Đức nhanh chóng lan quốc gia châu Âu khác WHO cho biết, phạm vi tồn giới có 1.270 ca nhiễm 552 ca tiến triển thành HUS; số tử vong lên tới 18 người bao gồm 17 trường hợp Đức trường hợp Thụy Điển Nguyên nhân đợt dịch xác định rau bị nhiễm E coli O104 Vụ dịch gây tổn thất nặng nề tới kinh tế thuộc liên minh châu Âu (EU), ước tính tuần người nông dân thất thu 200 triệu euro (tương đương 290 triệu USD) Ở động vật, VTEC nguyên nhân gây chứng viêm ruột xuất huyết tiêu chảy bò, gây phù đầu lợn Động vật nhai lại, đặc biệt bê bò nguồn tàng trữ mầm bệnh tiềm tàng việc tiêu thụ loại thực phẩm (thịt bê, bò, sản phẩm sữa) chưa qua xử lý kỹ nguyên nhân gây trường hợp bị bệnh người VTEC Các nghiên cứu số quốc gia tạp nhiễm phân trang trại chăn ni bị sữa, dao động lớn tỷ lệ nhiễm chủng VTEC thuộc nhóm O157 (từ 0,2 đến 48,8%) khơng thuộc nhóm O157 (từ 0,4 đến 74,0%) Trong thập kỷ gần đây, nhiễm vi khuẩn E coli thuộc nhóm VTEC sản sinh độc tố Verotoxin (VT) thực phẩm trở thành đề tài nghiên cứu nhiều tác giả tính nghiêm trọng bệnh vi khuẩn gây người (Bergamini, 2007) [16] Việc xác định xác loại vi khuẩn thuộc nhóm cần thiết, mối nguy hại vi khuẩn liên quan đến nạn dịch tiêu chảy trầm trọng người khả truyền lây bệnh chúng thơng qua thức ăn có nguồn gốc động vật Hiểu biết đặc tính vi khuẩn VTEC thịt lồi động vật ni (bị, lợn…) làm thực phẩm cho người có ý nghĩa quan trọng việc đưa hệ thống cảnh báo sớm tiến hành biện pháp phòng chống bệnh thích hợp Nhiều cơng trình nghiên cứu thực công bố hầu khắp quốc gia giới Tuy nhiên, Việt Nam vấn đề chưa ý Để có hiểu biết vi khuẩn nhóm VTEC thực trạng giết mổ chế biến thực phẩm Việt Nam, đặt vấn đề thực đề tài: "Nghiên cứu số đặc tính vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bị, lợn giết mổ Hà Nội ” Mục tiêu củ đề tài - Xác định đặc tính vi khuẩn E coli nhóm VTEC phân lập từ bị, lợn điểm giết mổ - Xây dựng quy trình chẩn đoán, xác định vi khuẩn VTEC sản phẩm thịt tươi Ý n hĩ h học thực tiễn củ đề tài - Đề tài luận án công trình nghiên cứu có hệ thống vi khuẩn E coli nhóm VTEC phân lập từ bị, lợn giết mổ Hà Nội - Kết nghiên cứu đề tài giúp xác định hiểu số đặc tính vi khuẩn nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn - Một số kỹ thuật phương pháp phân tích kết có hệ thống đề tài luận án ứng dụng nghiên cứu số vi khuẩn khác mức độ phân tử tài liệu giảng dạy vi khuẩn nhóm VTEC - Hiểu biết vi khuẩn nhóm VTEC lồi động vật ni làm thực phẩm cho người có ý nghĩa quan trọng việc đưa hệ thống cảnh báo sớm tiến hành biện pháp phòng chống bệnh thích hợp hữn đón óp m i củ luận án - Đề tài luận án cơng trình Việt Nam nghiên cứu đặc tính vi khuẩn nhóm VTEC phân lập từ bị, lợn sở giết mổ số sản phẩm thịt bò, lợn bày bán số chợ địa bàn Hà Nội - Thiết lập thành công phương pháp Multiplex PCR để xác định vi khuẩn nhóm VTEC thịt điều kiện Việt Nam - Sử dụng phương pháp PCR, PFGE để xác định yếu tố độc lực vi khuẩn E coli xác định đa dạng di truyền chủng VTEC có nguồn gốc khác h ơn Ổ 1.1 QUA L U Vi huẩn E coli Hơn 100 năm trước, năm 1885, bác sỹ nhi khoa người Đức Theodore Escherich lần mơ tả lồi vi khuẩn phân lập từ phân bệnh nhân nhi Ông đặt tên vi khuẩn Bacterium coli commune, sau nhiều lần đổi tên, vào năm 1919, vi khuẩn gọi với tên thống Escherichia coli, viết tắt E coli Từ đến nay, E coli xác định loài vi khuẩn thường gặp hệ vi sinh vật đường ruột người động vật (Vu Khac Hung, 2004) [91] E coli loài chủ yếu giống Escherichia, họ Enterobacteriaceae Chúng vi khuẩn bắt màu Gram âm, hình gậy ngắn Quan sát kính hiển vi thường thấy vi khuẩn đứng riêng thành đôi Phản ứng Catalase dương tính, Oxidase âm tính, hiếu khí tùy tiện, di động nhờ lơng (flagella) khơng di động Hầu hết chủng vi khuẩn lên men đường Lactose, số lên men chậm số khơng sinh Thơng thường, E coli có phản ứng Citrate âm tính, Methyl Red (MR) dương tính, Voges - Proskauer (VP) âm tính Indol dương tính E coli vi khuẩn thường thấy đường tiêu hóa người động vật; từ E coli thải vào nước, đất đồng cỏ, không nhiễm lan đàn mà nhiễm vào số sản phẩm nông nghiệp rau, củ, Từ đầu năm 1940, số ý kiến cho vi khuẩn E coli tác nhân gây số bệnh trẻ em Doyle Padhye (trích dẫn từ Bray Beavan, 1989) [28] gọi vi khuẩn Bacillus coli typ neopolitanum, mà sau gọi nhóm O111, thuộc lớp EPEC Từ đó, nhóm E coli khác thừa nhận nguyên nhân gây tiêu chảy Các vi khuẩn E coli gây bệnh có độc lực khác có khả gây số bệnh nghiêm trọng Một số chủng sản sinh độc tố gây phá hủy tế bào Vero Hela, tương tự độc tố Shigella dysenteriae typ sản sinh Những độc tố gọi với tên khác Verotoxin, Verocytotoxin Shiga-like toxin Trong nghiên cứu này, sử dụng tên gọi thống Verotoxin (VT) vi khuẩn có khả sản sinh độc tố gọi Verotoxigenic Escherichia coli, viết tắt VTEC Trong năm gần đây, chủng E coli gây tiêu chảy chia thành nhóm Đó E coli gây độc ruột (ETEC - Enterotoxigenic E coli) - sản sinh độc tố ruột không xâm nhập, E coli xâm nhập ruột (EIEC - Entero invasive E coli) có khả xâm nhập tế bào biểu mơ ruột, E coli gây bệnh tích ruột (EPEC - Enteropathogenic E coli) có khả bám dính vào tế bào biểu mơ gây bệnh tích bám dính xâm nhập (Attaching and Effacing - A/E), E coli gây ngưng kết (EaggEC - Enteroaggregative E coli) có khả bám dính vào tế bào biểu mô nhờ quan giống lông nhung khuếch tán vào biểu mô ruột Nhóm cuối VTEC gây bệnh viêm ruột xuất huyết, huyết niệu ban xuất huyết giảm tiểu cầu người Trước đây, VTEC phân nhóm EPEC chúng có khả gây bệnh tích A/E biểu mô ruột động vật cảm thụ Nhưng phát số chủng VTEC có khả sản sinh độc tố VT để trợ giúp cho yếu tố bám dính này, chúng tách thành nhóm riêng VTEC E coli O157: H7 chủng VTEC báo cáo nhiều gây vụ dịch lớn nhiều nước gồm Mỹ (MacDonald Osterholm, 1993) [55], Canada (Waters cs 1994) [96], Anh (Thomas cs 1996) [88] Nhật Bản (Bettelheim, 1997) [17] Vi khuẩn xác định tác nhân gây ngộ độc nguy hiểm bệnh phát sinh ngộ độc thực phẩm gây nên hội chứng huyết niệu (Phạm Thị Tâm cs 2009, trích dẫn theo Griffin, 1995) [6] Vụ dịch báo cáo vào năm 1982, E coli O157: H7 xác định nguyên nhân gây viêm ruột xuất huyết Mỹ Trong thập kỷ sau đó, vi khuẩn trở thành vấn đề lớn liên quan đến sức khỏe cộng đồng, phủ nhiều nước quan tâm Vụ dịch lớn báo cáo xảy Nhật Bản tháng - 8/1996, với 9.578 ca bệnh ghi nhận 11 người chết, 90 bệnh nhân xác định bị HUS Vụ dịch lớn thứ hai xảy Mỹ, với 732 ca bệnh người chết, 55 người bị HUS TTP Mặc dù, serotyp O157: H7 typ vi khuẩn bật nhóm VTEC, số serotyp khác nhóm liên quan tới số bệnh người Hơn nữa, tồn serotyp khác vùng địa lý khác Có 100 serotyp VTEC xác định dựa kháng nguyên O có khả gây số bệnh nghiêm trọng người HC, HUS, TTP Ở nhiều nước, VTEC tác nhân gây tiêu chảy thông thường (Wachsmuth, 1994) [95] VTEC gây nên triệu chứng khác nhau, từ gần khơng có triệu chứng gì, có khơng có triệu chứng đau bụng nhẹ, đến triệu chứng nặng HC, HUS TTP Đối tượng thường bị nhiễm VTEC trẻ em tuổi người già Ở người trưởng thành trung niên, triệu chứng nhẹ bị tiêu chảy không xuất huyết Điều xảy bị nhiễm liều thấp, 100 vi khuẩn Ở động vật, VTEC gây viêm ruột xuất huyết tiêu chảy trâu bò, chúng gây bệnh phù đầu lợn (Đỗ Ngọc Thúy, 2004) [8] Hầu hết vụ dịch VTEC, thường serotyp O157: H7, có liên quan tới sử dụng thịt bị chưa chín kỹ, số thực phẩm tương tự sữa tươi Truyền qua thực phẩm phương thức lây truyền chủ yếu VTEC Vật nuôi, đặc biệt trâu bò, nguồn tàng trữ VTEC (Beutin cs 1993) [18] Trong q trình giết mổ, động vật mang trùng truyền vi khuẩn sang thịt qua phân, nhiễm chéo sang thân thịt gia súc khác qua tay người giết mổ dụng cụ lò mổ Hiện nay, người ta chưa khẳng định liệu tất chủng VTEC phân lập từ động vật có gây bệnh cho người hay khơng Tiêu chuẩn vệ sinh an tồn thực phẩm Việt Nam quy định : vi khuẩn khơng phép có mặt 1g loại thực phẩm thịt hộp, rau muối, nước uống, sữa sản phẩm từ sữa Ở Việt Nam, có thơng tin VTEC động vật mang trùng, thân thịt sau giết mổ thực phẩm Hiện thị trường giới có kít phát VTEC ngồi nhóm O157 (kit PCR DNA vịm, VTECLAMP) Do đó, phương pháp phát nhanh VTEC Việt Nam cần phải phát triển để xác định vai trò vi khuẩn động vật mang trùng sản phẩm từ động vật 1.1.1 Phân loại E coli E coli chia thành nhóm dựa bệnh lý mà chúng gây ra, vị trí kháng nguyên, định typ phage, thông tin plasmid khả sản sinh yếu tố dung huyết Tuy nhiên, phản ứng huyết học thường sử dụng hiệu phân loại E coli (Hanna Evelina SidjabatTambunan, 1997) [38] Năm 1944, Kauffman người đưa phương pháp phân loại vi khuẩn E coli dựa đặc điểm huyết học, với số cải tiến, phương pháp áp dụng ngày Theo đó, vi khuẩn E coli phân loại dựa theo kháng nguyên bề mặt, gồm có kháng ngun thân O (Somatic), kháng ngun lơng H (Flagellar) kháng nguyên giáp mô K (Capsular) (Lior, 1996) [53] Mặc dù, E coli phân loại dựa loại kháng nguyên kháng nguyên O H thường sử dụng nhiều Do đó, thuật ngữ serotyp sử dụng hai kháng nguyên xác định Khi có kháng nguyên O xác định, vi khuẩn E coli xếp thành nhóm kháng nguyên O (serogroup O) Hiện nay, nhóm E coli dựa kháng nguyên O xác định đánh số từ O1 đến O173 (trừ nhóm bị loại : O31, O47, O67, O72, O93, O94, O122) 1.1.2 Đặc tính vi khuẩn E coli 1.1.2.1 Đặc tính hình thái E coli trực khuẩn ngắn, hai đầu trịn, có kích thước - x 0,6 µm Trên tiêu nhuộm Gram, vi khuẩn bắt màu Gram âm, đứng riêng rẽ, xếp - vi khuẩn thành chuỗi dài Vi khuẩn không sinh nha bào không bắt màu với thuốc nhuộm axit Vi khuẩn có lơng có khả di động (Nguyễn Như Thanh cs 2001) [7] Khi quan sát kính hiển vi điện tử, số chủng vi khuẩn định có mang cấu trúc fimbriae hay cịn gọi yếu tố bám dính (Nguyễn Thị Liên Hương, 2010) [4] 1.1.2.2 Đặc tính ni cấy E coli trực khuẩn hiếu khí tùy tiện Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng phát triển vi khuẩn 370C, pH thích hợp 7,4; vi khuẩn phát triển mơi trường có pH từ 5,5 - 8,0 (Nguyễn Như Thanh cs 2001) [7] Vi khuẩn E coli phát triển dễ dàng mơi trường ni cấy thơng thường, số chủng phát triển môi trường tổng hợp đơn giản - Mơi trường thạch thường: hình thành khuẩn lạc dạng S trịn, ướt, bóng láng khơng suốt, màu tro trắng nhạt, lồi, đường kính từ 3mm Ni lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt mọc rộng ra, quan sát thấy khuẩn lạc dạng R M - Môi trường nước thịt: phát triển nhanh, tốt, môi trường đục có lắng cặn màu tro nhạt đáy, đơi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân thối 10 - Mơi trường MacConkey: khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, trịn nhỏ, lồi, rìa gọn, khơng làm chuyển màu môi trường - Môi trường thạch máu: khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt, số chủng có khả gây dung huyết - Mơi trường CT-SMAC: khuẩn lạc trịn nhỏ, lồi, rìa gọn, màu hồng cánh sen (lên men đường Sorbitol) màu trắng đục (không lên men đường Sorbitol) - Môi trường Simmon citrate: khuẩn lạc không màu xanh lục - Môi trường Endo: khuẩn lạc màu đỏ - Mơi trường EMB: khuẩn lạc màu tím đen - Mơi trường SS: khuẩn lạc có màu đỏ 1.1.2.3 Đặc tính sinh hóa - Đặc tính lên men sinh loại đường: vi khuẩn E coli có khả lên men sinh số loại đường như: Glucose, Fructose, Galactose, Lactose, Manitol, Levulose, Xylose; lên men không chắn với loại đường như: Dulcitol, Saccarose, Salixin Vi khuẩn E coli lên men sinh nhanh đường Lactose, cịn vi khuẩn Salmonella spp khơng có đặc tính Đây đặc điểm quan trọng để phân biệt với E coli Salmonella - Đặc tính khác: + Vi khuẩn làm đơng vón sữa sau 24 - 72 nuôi cấy 370C + Vi khuẩn không làm tan chảy gelatin + Các phản ứng: Indol, Catalase, MR dương tính; Citrat, Oxidase, VP, Urease, H2S âm tính Vi khuẩn E coli có khả khử nitrat thành nitrit, khử cacboxyl môi trường lysine decacboxylase 1.1.2.4 Sức đề kháng Vi khuẩn E coli có sức đề kháng yếu, bị diệt nhiệt độ 550C 118 58 Matar G M., Abdo D., Khneisser I., Youssef M., Zouheiry H., Abdelnour G and Harakeh H S (2002), “The multiplex PCR based detection and genotyping of diarrhoeagenic Escherichia coli in diarrhoeal stools”, Ann Trop Med Parasitol, 96 (3), p 317 - 324 59 McMaster C., Roch E.A., Willshaw G.A., Doherty A., Kinnear W and Cheasty (2001), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli serotyp O26:H11 outbreak in an Irish Creche”, Eur J Clin Microbiol Infect Dis., 20(6), p 430 - 432 60 McPaeke S J W., Smyth J A and Ball H J (2005), “Characterisation of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) associated with colisepticaemia compared to faecal isolates from healthy birds”, Veterinary Microbiology, 110, p 245 – 253 61 Mechie S C., Chapman P A and Siddons C A (1997), “A fifteen month study of Escherichia coli O157:H7 in dairy herd”, Epidemiology and Infection, 118, p 17 – 25 62 Meng J., Zhao S., Doyle M P., Mitchell S E and Kresovich S (1996), “Polymerase chain reaction for detecting Escherichia coli O157:H7”, International Journal of Food Microbiology, 32, p 103 – 113 63 Meng J., Zhao S., Doyle M P., Mitchell S E and Kresovich S (1997), “A multiplex PCR for identifying Shiga-like toxin-producing Escherichia coli O157:H7”, Letters in Applied Microbiology, 24, p 172 – 176 64 Mohammad A Islam, Abdus S Mondol, Enne de Boer, Rijkelt R Beumer, Marcel H Zwietering, Kaisar A Talukder and Annet E Heuvelink (2008), “Prevalence and Genetic Characterization of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Isolates from Slaughtered 119 Animals in Bangladesh”, Applied and environmental microbiology, Vol 74, No 17, p 5414–5421 65 Montenegro M A., Bulte M., Trumpf T., Aleksic S., Reuter G., Bulling E and Helmuth R (1990), “Detection and characterization of fecal verotoxin-producing Escherichia coli from healthy cattle”, Journal of Clinical Microbiology, 28 (6), p 1417 – 1421 66 O’Brien A D and Samuel J E., Tesh V L., Burris J A., Owens J W., Gordon V M., Wadolkowski E A., (1993), “Comparison of the relative toxicities of Shiga-like toxins typ I and typ II for mice”, Infection and Immunity, 61, p 3392 – 3402 67 Orskov F., and Orskov I (1992), “Escherichia coli serotyping and disease in man and animal”, Can.J Micro., 38, pp.699-704 68 Osek J (2000), “Clonal analysis of Escherichia coli strains isolated from pigs with post-weaning diarrhea by pulsed-field gel electrophoresis”, FEMS Microbiol Lett., 186, pp.327-331 69 Paton A W., J C Paton, P N Goldwater, P A Manning (1993), “Direct detection of Escherichia coli Shiga-like toxin genes in primary fecal cultures using the polymerase chain reaction”, J Clin Microbiol, 31, p 3063 – 3067 70 Paton A W., Ratcliff R M., Doyle R M., Seymour-Murray J., Davos D., Lanser J A and Paton J C (1996), “Molecular microbiological investigation of an outbreak of hemolytic-uremic syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxinproducing Escherichia coli”, Journal of Clinical Microbiology, 34 (7), p 1622 – 1627 71 Paton J C and A W Paton (1998), “Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections”, Clin Microbiol Rev., 11, p 450 – 479 120 72 Paton J C and A W Paton (2002), “Direct detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by multiplex PCR for stx1, stx2, eae, ehxA and saa”, Journal of clinical microbiology, Vol 40, No 1, p 271 – 274 73 P Alexa, L Konstantinova, Z Sramkova-Zajacova (2011), “Faecal shedding of verotoxigenic Escherichia coli in cattle in the Czech Republic”, Veterinarni Medicina, 56 (4), p 149 – 155 74 Peiris J.S.M., P.H.M Leung, W.C Yam and W.W.S Ng (2001), “The prevalence and characterization of verotoxin-producing Escherichia coli isolated from cattle and pigs in an abattoir in Hong Kong”, Epidemiol Infect., 126, p 173 – 179 75 Pourbakhsh S., Dho-Moulin M., Bree A., Desautels C., Martineau-Doize B and Fairbrother J M (1997), “Localization of the in vivo expression of P and F1 fimbriae in chickens experimentally inoculated with pathogenic Escherichia coli”, Microbiol Pathog., 22, p 331 – 341 76 Pryor W., Hodson E., McIntyre P and Bettelheim K A (1990), “Toxigenic Escherichia coli in haemolytic ureamic syndrome” , The Medical Journal of Australia, 152, p 221 – 222 77 Rasmussen M A., Cray W C Jr., Casey T A and Whipp S C (1993), “Rumen contents as a reservoir of enterohemorrhagic Escherichia coli”, FEMS Microbiology Letters, 114, p 79 – 84 78 Saiki R K., Gelfand D H., Stoffel S., Scharf S J., Higuchi R., Horn G T., Mullis K B and Erlich H A (1987), “Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase”, Science, 239, p 487 – 491 79 Samadpour M., Onerth J E., Liston J., Tran N Nguyen D., Whittam T S., Wilson R A and Tarr P I (1994), “Occurrence of Shiga-like 121 toxin producing Escherichia coli in retail fresh seafood, beef, lamb, pork and poultry from grocery stores in Seattle, Washington”, Applied and Environmental Microbiology, 60 (3), p 1038 – 1040 80 Sambrook J., and Russell D.W (editor) (2001), “Chapter 5: Gel electrophoresis of DNA and Pulsed –field agarose gel electrophoresis”, In: Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 5.55-5.90 81 Sandhu K S., Clarke R C., McFadden K., Brouwer A., Louie M., Wilson J., Lior H and Gyles C L (1996), “Prevalence of the eaeA gene in verotoxigenic Escherichia coli strains from dairy cattle in Southwest Ontario”, Epidemiology and Infection, 116, p -7 82 Schmidt H., Rusmann H., Schwarzkoft A., Aleksic S., Heesemann J and Karch H (1994), “Prevalence of attaching and effacing Escherichia coli in stool samples from patients and controls”, Zentrablatt fur Bakteriologie, 281 (2), p 201 – 213 83 Schmidt H., Beutin L and Karch H (1995), “Molecular analysis of the plasmid-encoded hemolysin of Escherichia coli O157:H7 strain EDL 933”, Infection and Immunity, 63 (3), p 1055 – 1061 84 Stein P E, Boodhoo A., Tyrrell G J., Brunton J L and Read R J (1992), “cvCrystal structure of the cell-binding B oligomer of verotoxin-1 from E coli”, Nature (London), 355, p 748 – 750 85 Xiaodong Xia, Jianghong Meng, Patrick F McDermott, Sherry Ayers, Karen Blickenstaff, Thu-Thuy Tran, Jason Abbott, Jie Zheng, and Shaohua Zhao (2010) Presence and Characterization of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli and Other Potentially Diarrheagenic E coli Strains in Retail Meats Applied and environmental microbiology, 76, p 1709-1717 122 86 Takeda Y (1995), “Shiga and Shiga-like (Vero) toxins”, Bacterial toxins and virulence factors in disease (Edited by: Moss J., Iglewski B., Vaughan M and Tu A T ), Marcel Dekker Inc., p 313 – 326 87 Tenover F.C., Arbeit R.D., Goering R.V., Mickelsen P.A., Murray B.E., Persing D.H., and Swaminathan B (1995), “Intrepreting chromosomal DNA restriction paterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing”, J.Clin Microbiol., 33, pp.2233-2239 88 Thomas A., Cheasty T., Frost J A., Chart H., Smith H R and Rowe B (1996), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli, particularly serogroup O157, associated with human infections in England and Wales: 1992 – 4”, Epidemiology and Infection, 117, p – 10 89 Thi Thu Thao Van, George Moutafis, Peter J Coloe (2007), “Antibiotic resistance in food-borne bacterial contaminants in Vietnam” Applied Environmental Microbiology, 73:7906-11 90 Tozzi A E., Niccolini A., Caprioli A., Luzzi I., Montini G., Zacchello G., Gianviti A., Principato F and Rizzoni G (1994), “A community outbreak of haemolytic-uraemic syndrome in children occurring in a large area of Northern Italy over a period of several months”, Epidemiology and Infection, 113, p 209 – 219 91 Vu Khac Hung (2004), “Escherichia coli – prevalence and comparison of virulence factors in strains isolated from pigs with diarrhea in Slovak Republic”, The degree of Doctor, Slovak Republic 92 Xu Jian-Guo, Cheng Bo-Kun and Jing Hual-Qi (1999), “Escherichia coli O157:H7 and Shiga like-toxin-producing Escherichia coli in China”, World Journal of Gastroenterology, ISSN 1007-9327 93 Yu J and Kapper J B (1992), “Cloning and characterization of the eae gene of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7”, Molecular biology, (3), p 411 – 417 123 94 Zhao T., Doyle M P., Shere J and Garber L (1995), “Prevalence of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in a survey of a dairy herds”, Applied and Environmental Microbiology, 61 (4), p 1290 – 1293 95 Wachsmuth (1994), “Summary: public health, epidemiology, food safety, laboratory diagnosis”, Recent advances in Verocytotoxinproducing Escherichia coli infection, Karmali M A and Goglio A G (eds.), Elsevier, Amsterdam, p -6 96 Waters J R., Sharp J C M and Dev V J (1994), “Infection caused by Escherichia coli O157:H7 in Alberta, Canada and in Scotland: a five year review, 1987 – 1991”, Clinical Infectious Disease, 19, p 834 – 843 97 Wieler L H., Vieler E., Erpenstein C., Schlapp T., Steinruck H., Bauerfeind R., Byomi A and Baljer G (1996), “Shiga toxinproducing Escherichia coli strains from bovines association of adhesion with carriage of eae and other genes”, Journal of Clinical Microbiology, 34 (12), p 2980 – 2984 98 Willshaw G A., Smith H R., Roberts D., Thirlwell J., Cheasty T and Rowe B (1993), “Examination of raw beef products for the presence of verocytotoxin producing Escherichia coli, particularly those of serogroup O157”, Journal of Applied Bacteriology, 75, p 420 – 426 99 Willshaw G.A., Cheasty T., Smith H.R., O'Brien S.J and Adak G.K (2001), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) O157 and other VTEC from human infections in England and Wales: 1995-1998”, J Med Microbiol, 50 (2), p 135 – 142 100 Winkle S M., Refai M and Rhode R (1972), “On the antigenic relationship of Vibrio cholera to Enterobacteriaceae”, Annales de L’institut Pastuer, 123, p 775 – 781 124 TRANG WEB 101 Phương Thuận (2011), “Hơn 6000 người bị ngộ độc thực phẩm năm”, ttp://giadinh.net.vn/2011032509425334p1044c1045/hon-6000 nguoi-bi-ngo-doc-thuc-pham-moi-nam.htm 125 Ụ LỤ Phụ lục Mơi tr n , hó chất phân lập, iám định vi huẩn E coli (nhóm V E ) thực phản ứn Môi tr hác n , hó chất phân lập, iám định vi huẩn E coli  Môi tr n M c n ey (Oxoid - England): Hịa tan 52g mơi trường lít nước cất vô trùng, hấp 1210C 15 phút, sau để nguội 500C đổ đĩa Petri  Mơi tr n thạch máu (Blood agar base) hãng Sanofi - France: Hịa tan 40g lít nước cất, hấp tiệt trùng 1210C 15 phút, để nguội đến 45-500C Bổ sung thêm 5% máu thỏ máu cừu tách sợi huyết lắc đều, pH =7,4±0,2  Môi tr n utrient br th (Merck – Germany): Hòa tan 8g lít nước cất, hấp vơ trùng 1210C 15 phút, pH =7,4±0,2, 250C  Môi tr n m SB (Merck – Germany): Hòa tan 33g lít nước cất, hấp vơ trùng 1210C 15 phút, pH =7,3±0,2, đổ ống farcol lấy mẫu  Mơi tr n B W (Oxoid - England): ): Hịa tan 20g lít nước cất, hấp vơ trùng 1210C 15 phút, pH =7,3±0,2  Môi tr n EMB A r (Merck – Germany): Hòa tan 36g lít nước cất, hấp vơ trùng 1210C 15 phút, pH =7,4±0,2  Môi tr n S M (Eiken – Japan): Hịa tan 39g lít nước cất, chia ống nút vặn khoảng 3-5ml/ống, hấp vô trùng 1210C 15 phút, pH =7,4±0,2  Môi tr n -SMAC (Cefixime Tellurite Selective Supplement) hãng Oxoid – England: lọ cho 2ml nước cất vô trùng vào lắc đến tan hết, bổ sung vào 500ml môi trường SMAC (Sorbitol MacConkey Agar) vô trùng, lắc đều, đổ đĩa petri 126  Môi tr n đ n l ại: Pha dung dịch đường loại 20%, hấp cách quãng 1000C vòng 30 phút/ ngày, hấp ngày ó chất ùn tr n phản ứn , Multiplex-PCR  Mồi l ại: hãng Fermentas cung cấp Mồi hoàn nguyên đệm TE (Invitrogen, USA)  AMP x bufer, dNTP stock, 50 x TAE, Taq-DNA polymerase, Gel loading bufer hãng Fermentas cung cấp  Ethidium bromide 10mg/ml: Invitrogen, USA cung cấp  Dun ịch điện di TBE 10X (Tris – Borate – EDTA): Hòa tan 108g Tris- Base (Merck), 55g axit Boric (Sigma) 5,84g EDTA (Fluka) lít nước cất, lắc cho tan hết Khi sử dụng, pha loãng 10 lần với nước cất  hạch r se 0,8-2% : Cân xác lượng agarose (US-Bio) cần sử dụng cho vào bình tam giác, bổ sung đệm TBE vừa đủ để đạt nồng độ theo yêu cầu Làm tan chảy tồn thạch lị vi sóng Khi thạch nguội đến 500C, bổ sung ethidium bromide (0,5µl ethidium bromide /10ml thạch agarose), lắc đổ khuôn chuẩn bị trước, gắn lược Để thạch đông tự nhiên khoảng 15 - 30 phút Gỡ bỏ lược, đặt thạch vào bể điện di, bổ sung đệm TBE ngập mặt thạch tiến hành bơm mẫu để điện di sản phẩm PCR ó chất ùn tr n phản ứn  Dun F E ịch rử (Wash buffer): Hòa 40ml NaCl 5M, 10ml Tris-HCl 1M (pH 7,2), 200ml EDTA 0,5M (pH 8,0) 750 ml nước cất Lắc hấp 1210C 15 phút  Dun ịch phá vỡ tế bà vi huẩn (bacterial cell lysis solution) Hòa tan 0,5ml Tris-HCl 1M (pH 7,5), 0,5ml NaCl 5M, 10ml EDTA 0,5M (pH 8,0), 100mg sodium deoxycholate, 250 mg N-lauroylsarcosine/sodium salt với 39ml nước cất Lắc cho tan hết vô trùng cách lọc qua giấy lọc 127 0,22µm Sau đó, bổ sung 50mg lysozyme, lắc cho tan đều, bảo quản 40C  Dun ịch pr tein se K (Bacterial cell protenase K solution) Hòa tan 0,5g N-lauroylsarcosine/sodium salt 50ml EDTA 0,5M (pH 8,0) Lắc nhẹ làm ấm dung dịch tan hết, vô trùng dung dịch cách lọc qua giấy lọc 0,22µm Sau đó, bổ sung 1,25 ml proteinase K (nồng độ 20mg/ml), lắc cho tan đều, bảo quản 40C  Dun ịch đệm E (Tris –EDTA buffer) Hòa tan 5ml Tris-HCl 1M ml EDTA 0,5M (pH 8,0) 495 ml nước cất  Dun ịch MSF 1mM Hòa tan 17,4 mg PMSF 100ml nước cất Lắc hấp 121 0C 15 phút  Dun ịch BSA/spermi ine restricti n enzyme Trộn 100µl Restriction enzyme buffer 10X (promega), 10µl acetylated BSA (10mg/ml), 20µl spermidine trihydrochloride (100mM) với 0,87 ml nước cất Dung dịch chuẩn bị trước tiến hành phản ứng 128 Phụ lục Một số hình ảnh lấy m u sở iết mổ Minh iền, run Văn 129 Phụ lục Một số hình ảnh thực trạn h ạt độn iết mổ số sở iết mổ nhỏ lẻ lôn bẩn h lọc thân thịt bẩn ách lòn thân thịt bẩn ách lòn thân thịt bẩn Làm lịn cạnh thân thịt Khơn có hu làm lịn riên biệt 130 ình thức vận chuyển phổ biến Vận chuyển thân thịt bằn xe máy hôn che đậy Phụ lục Một số hình ảnh mu bán thịt chợ ằn s u quầy bán thịt chợ hạch Bàn 131 Phụ lục 5: Một số hình ảnh tr n phịn thí n hiệm 132 ... cứu số đặc tính vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bị, lợn giết mổ Hà Nội ” Mục tiêu củ đề tài - Xác định đặc tính vi khuẩn E coli nhóm VTEC phân lập từ bị, lợn điểm giết mổ -... i củ luận án - Đề tài luận án cơng trình Vi? ??t Nam nghiên cứu đặc tính vi khuẩn nhóm VTEC phân lập từ bị, lợn sở giết mổ số sản phẩm thịt bò, lợn bày bán số chợ địa bàn Hà Nội - Thiết lập thành... Kết nghiên cứu đề tài giúp xác định hiểu số đặc tính vi khuẩn nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn - Một số kỹ thuật phương pháp phân tích kết có hệ thống đề tài luận án ứng dụng nghiên cứu số vi khuẩn