BÀI GIẢNG: CÔNG NGHỆ HOÁ SINH docx

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC KHOA KHOA HỌC SỰ SỐNG BÀI GIẢNG: CÔNG NGHỆ HOÁ SINH Người soạn: ThS. Trịnh Đình Khá THÁI NGUYÊN - 2010 CHƯƠNG 1 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH VÀ KHÁNG SINH BÁN TỔNG HỢP 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH 2. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁN SINH PENICILLIN 3. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT β-LACTAM BÁN TỔNG HỢP 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CHẤT KHÁNG SINH 1.1. LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU Thuật ngữ “chất kháng sinh” lần đầu tiên được Pasteur và Joubert (1877) sử dụng để mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên động vật nhiễm bệnh. Babes (1885) đã nêu ra định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn của một chủng là đặc tính tổng hợp được các hợp chất hoá học có hoạt tính kìm hãm các chủng đối kháng. Nicolle (1907) là người đầu tiên phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus subtilis có liên quan đến quá trình hình thành loài bào tử. Gratia và đồng nghiệp (1925) đã tách từ nấm mốc một chế phẩm có thể sử dụng điều trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm trên da do cầu khuẩn và ông là người đầu tiên xây dựng hoàn thiện phương pháp tìm kiếm và phát hiện vi sinh vật sinh tổng hợp chất kháng sinh trong tự nhiên. Năm 1929 thuật ngữ “chất kháng sinh” mới được Alexander Fleming mô tả một cách đầy đủ và chính thức trong báo cáo chi tiết về penicillin Năm 1931, các nhà khoa học Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men bề mặt. Năm 1938 ở Oxford, Ernst Boris Chain và Howara Walter Florey đã tiếp tục triển khai nghiên cứu này. các ông đã tinh chế được một lượng lớn penicillin (1939) đủ để thử nghiệm trên các loạt động vật thí nghiệm. Ngày 25/05/1940 penicillin đã được thử nghiệm rất thành công trên chuột và chính thức được dùng điều trị thành công trên người (1941) trong nỗ lực cuối cùng nhằm cứu sống các thương binh bị nhiễm khuẩn nặng trong chiến tranh thế giới thứ hai. Trong thập kỷ 40 và 50 của thế kỷ XX đã ghi nhận những bước tiến vượt bậc của ngành công nghệ sản xuất chất kháng sinh non trẻ như: * Khám phá ra hàng loạt chất kháng sinh như: griseofulvin (1939), gramicidin S (1942), streptomycin (1943), bacitracin (1945), chloramphenicol và polymycin (1947), clotetracyclin và cephalosporin (1948), neomycin (1949), oxytetracyclin và nystatin (1950), erythromycin (1952), cycloserin (1954), vancomycin (1956), kanamycin và rifamycin (1957), * Áp dụng phối hợp các kỹ thuật tuyển chọn và tạo giống tiên tiến đã tạo ra những biến chủng công nghiệp có năng lực “siêu tổng hợp” các chất kháng sinh cao gấp hàng vạn lần các chủng ban đầu. * Triển khai thành công công nghệ lên men chìm quy mô sản xuất công nghiệp để sản xuất penicillin G (1942) và hoàn thiện công nghệ lên men này trên những sản phẩm khác trong những năm tiếp theo. * Năm 1959, phát hiện và tinh chế sử dụng thành công 6-aminopenicillinic acid (6APA) làm nguyên liệu để sản xuất các chất kháng sinh penicillin bán tổng hợp 1.2. KHÁI NIỆM CHẤT KHÁNG SINH • Theo các nhà sinh học, kháng sinh là những hợp chất hoá học do vi sinh vật tiết ra có tác dụng ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn lọc một nhóm vi sinh vật xác định hay cả tế bào ung thư ở nồng độ thấp. • Còn các nhà hoá học thì muốn định nghĩa kháng sinh sinh phải bao hàm cả các chất tổng hợp bằng hoá học có tác dụng diệt khuẩn như các chất thuộc quinolon. “Chất kháng sinh (antibiotic) là các chất hoá học xác định, không có bản chất enzyme, có nguồn gốc sinh học với đặc tính ngay ở nồng độ thấp có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt được các vi sinh vật gây bệnh mà vẫn đảm bảo được an toàn cho người hay động vật được điều trị”. Tên kháng sinh Vi sinh vật sản xuất kháng sinh Hoạt phổ Penicillin Penicillium chrysogenum Kháng khuẩn Steptomycin Str. griseus Kháng khuẩn Tetracyclin Str. aureofaciens Kháng khuẩn Chloramphenicol Str. venezuela Kháng khuẩn Oxytetracyclin Str. rimosus Kháng khuẩn Cephalosporin Cephalosporium acremonium Kháng khuẩn Actinomycin D Str. antibioticus Kháng ung thư Bleomycin Str. verticillum Kháng ung thư Daunorubicin Str. peuceticus Kháng ung thư Mitomycin C Streptomyces sp. Kháng ung thư Kanamycin Str. kanamyceticus Kháng khuẩn Nystatin Str. noursei Kháng nấm Fumagillin A. fumigatus Kháng protozoa Griseofulvin P. griseofulvum Kháng nấm Nistin Streptococcus sp. Bảo quản thực phẩm Natamycin Streptococcus sp. Bảo quản thực phẩm Rifamycin Nocardia sp. Kháng lao Polymycin B Bacillus polymyxa Kháng khuẩn Gentamycin Micromonospora sp. Kháng khuẩn 1.3. CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CHẤT KHÁNG SINH • Làm rối loạn cấu trúc thành tế bào • Rối loạn chức năng điều tiết quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào chất • Làm rối loạn hay kiềm toả quá trình sinh tổng hợp protein • Rối loạn quá trình tổng hợp DNA • Hoặc tương tác đặc hiệu với những giai đoạn nhất định trong các chuyển hoá trao đổi chất. Đánh giá hiệu quả ứng dụng của chất kháng sinh: • hoạt tính kháng sinh đặc hiệu, phổ kháng sinh • đáp ứng phản hồi của mầm bệnh đối với kháng sinh đó • phản ứng phụ của thuốc, đường cấp thuốc • sự chuyển hoá thuốc trong cơ thể bệnh nhân, đường hướng đào thải thuốc • tương tác qua lại giữa các loại thuốc khi sử dụng phối hợp. 1.4. CHỨC NĂNG SINH HỌC CỦA CHẤT KHÁNG SINH • Việc tổng hợp các chất kháng sinh nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm được sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục bộ đó. • Việc tổng hợp chất kháng sinh là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho khả năng sống sót cao cho chủng vi sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên, nhất là đối với các loài có bào tử. 1.5. ĐIỀU CHỈNH SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH • Tuyển chọn và tạo ra các chủng công nghiệp siêu tổng hợp chất kháng sinh • Tối ưu hoá thành phần môi trường, thiết bị lên men và điều kiện vận hành quá trình lên men. 1.5.1. Tuyển chọn và tạo ra các chủng công nghiệp siêu tổng hợp chất kháng sinh Trải qua 6 giai đoạn cơ bản: • Phân lập từ tự nhiên • Nghiên cứu xử lý tạo các biến chủng siêu tổng hợp có hoạt lực cao • Tuyển chọn sơ bộ • Tuyển chọn lại thu các chủng có hoạt tính cao quy mô phòng thí nghiệm • Thử nghiệm và tuyển chọn lại trên quy mô sản xuất thử nghiệm pilot • Thử nghiệm và chọn lọc lại các chủng phù hợp với điều kiện lên men sản xuất lớn công nghiệp. 1.5.2. Tối ưu hoá thành phần môi trường, thiết bị lên men và điều kiện vận hành quá trình lên men • nguồn cacbon thường được lựa chọn là: các loại bột và hạt ngũ cốc, cám mỳ, cám gạo, vỏ khoai tây, rỉ đường, các loại đường, dextrin, glyxerin, axit axetic, dịch thuỷ phân gỗ, • Nguồn nitơ có thể là: bột đậu tương, nước chiết ngô, cao nấm men, nước chiết nấm men, pepton, các loại muối vô cơ chứa nitơ, • Các nguyên tố khoáng đa lượng như: P, S, Mg, Fe, Ca, K, Na. Các nguyên tố vi lượng như: Cu, Zn, Co, Mo, và các chất kích thích sinh trưởng. • Khai thác hiệu quả tác động của các yếu tố khác trong môi trường như: nhiệt độ lên men tối ưu, pH, nồng độ oxy, thế oxy hoá - khử, cường độ sục khí, cường độ khuấy trộn dịch lên men, [...]... KHÁNG SINH DÙNG TRONG Y HỌC Bước 1: Phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh dưới dạng thuần khiết Chọn lọc chủng có hoạt phổ kháng sinh mong muốn Định tên chủng vi sinh vật tuyển chọn được Bước 2: Nuôi cấy vi sinh vật sinh kháng sinh trong thiết bị lên men dung tích từ 5 – 100 lít Chiết xuất, tinh chế để thu kháng sinh tinh khiết, xác định cấu trúc hoá học, thử sơ bộ về độc tính và một vài hằng số lý hoá. .. và một vài hằng số lý hoá của kháng sinh tìm được Bước 3: Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi sinh vật sinh kháng sinh, tìm môi trường tối ưu để nuôi cấy Đột biến cải tạo giống bằng kỹ thuật di truyền cổ điển và kỹ thuật gen để thu được chủng giống có năng suất cao, ổn định Bước 4: Nghiên cứu dược lý của kháng sinh tìm được, tác dụng điều trị của kháng sinh bằng cách gây bệnh thực nghiệm trên... assay systems”), để triển khai sản xuất công nghiệp các chất kháng sinh • Tiếp tục tìm kiếm phát hiện các chất kháng sinh mới, bao gồm cả mở rộng tìm kiếm phát hiện khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh sang các nhóm sinh vật khác • Sản xuất các chế phẩm điều trị với sự phối hợp nhiều loại thuốc, mở rộng khả năng ứng dụng và điều trị của các chất kháng sinh đã biết; đồng thời góp phần làm giảm... thuốc và hạn chế bớt các hiệu ứng không mong muốn của mỗi chất kháng sinh • Mở rộng thêm khả năng ứng dụng các chất kháng sinh vào các lĩnh vực kinh tế và khoa học khác như: ứng dụng trong chăn nuôi, bảo quản thực phẩm, nông nghiệp, bảo vệ môi trường, nghiên cứu khoa học, 2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH PENICILLIN 2.1 GIỚI THIỆU KHÁNG SINH PENICILLIN β-lactam Penam Hình 1.1 Cấu trúc vòng β-lactam và... thực nghiệm trên động vật thí nghiệm Bước 5: Nghiên cứu sản xuất kháng sinh trên qui mô công nghiệp bao gồm: môi trường lên men, các thông số kỹ thuật của quá trình lên men, phương pháp chiết xuất và tinh chế để đạt tiêu chuẩn dùng làm thuốc, Bước 6: Nghiên cứu kinh tế và thị trường 1.7 PHƯƠNG HƯỚNG PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH • Nghiên cứu sản xuất thêm các chế phẩm bán tổng hợp, mở rộng... TRONG CÔNG NGHIỆP 2.3.1 Đặc điểm chung Theo công nghệ lên men của hãng Gist-Brocades (Hà Lan) thì toàn bộ dây chuyền sản xuất penicillin có thể phân chia làm 4 công đoạn chính như sau: • Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V hoặc G) • Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên • Sản xuất các penicillin bán tổng hợp • Pha chế các loại thuốc kháng sinh penicillin... đặc tính ưu việt hơn Nghiên cứu các hoạt tính mới của kháng sinh như: kháng nấm, kháng virus, kháng sinh có khả năng kìm hãm sự phát triển của các khối u, • Hoàn thiện các phương pháp phân lập, tuyển chọn, tạo các biến chủng siêu tổng hợp, điều chỉnh đường hướng các quá trình trao đổi chất và đường hướng quá trình lên men, áp dụng các công nghệ tách chiết và tinh chế mới, hoàn thiện và áp dụng các... Sơ đồ tổng hợp 6-APA bằng con đường hoá học Con đường 2.2 Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp 6-APA bằng enzyme penicillin-acylase 3.2.2 Sản xuất penicillin bán tổng hợp Bảng 1.5 Một số kháng sinh penicillin bán tổng hợp • Từ 6-APA có thể dễ dàng tạo ra được nhiều chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác nhau bằng cả hai con đường: acyl hoá trực tiếp từ 6-APA theo phương pháp hoá học hay sử dụng enzyme penicillin-acylase... tạo kháng sinh mới • nguyên tắc có thể hoàn thiện theo hướng lên men trực tiếp với các tiền chất tạo nhánh khác nhau để thu kháng sinh mong muốn hoặc không sử dụng tiền chất thu 6-APA làm nguyên liệu để tổng hợp các penicillin khác nhau • Con đường kinh tế hơn cả và được triển khai trong sản xuất lớn là chỉ lên men trực tiếp thu penicillin G hoặc V làm nguyên liệu từ đó tổng hợp các kháng sinh khác... SẢN XUẤT PENICILLIN BÁN TỔNG HỢP 3.2.1 Sản xuất 6-APA Hình 1.7 Công thức cấu tạo của 6-APA Có hai con đường khác nhau để tổng hợp 6-APA • Con đường thứ nhất tiến hành lên men nhưng không bổ sung tiền chất tạo kháng sinh như sơ đồ hình 1.3 • Con đường hiệu quả hơn cả hiện nay là lên men sản xuất penicillin G hoặc V; sau đó áp dụng phương pháp hoá học hay sử dụng enzyme penicillin-acylase để phân cắt mạch . SỐNG BÀI GIẢNG: CÔNG NGHỆ HOÁ SINH Người soạn: ThS. Trịnh Đình Khá THÁI NGUYÊN - 2010 CHƯƠNG 1 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH VÀ KHÁNG SINH BÁN TỔNG HỢP 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH 2. CÔNG NGHỆ. xác định cấu trúc hoá học, thử sơ bộ về độc tính và một vài hằng số lý hoá của kháng sinh tìm được. Bước 3: Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi sinh vật sinh kháng sinh, tìm môi trường. liệu để sản xuất các chất kháng sinh penicillin bán tổng hợp 1.2. KHÁI NIỆM CHẤT KHÁNG SINH • Theo các nhà sinh học, kháng sinh là những hợp chất hoá học do vi sinh vật tiết ra có tác dụng ức