PHÂN TÍCH PHIÊN MÃ ĐỘ DÀI ĐẦY ĐỦ CỦA CÙNG BỘ GEN ĐẬU TƯƠNG VỚI CÁC PHẢN ỨNG TƯƠNG THÍCH VÀ KHÔNG TƯƠNG THÍCH VỚI HETERODERA GLYCINES

PHÂN TÍCH PHIÊN MÃ ĐỘ DÀI ĐẦY ĐỦ CỦA CÙNG BỘ GEN ĐẬU TƯƠNG VỚI CÁC PHẢN ỨNG TƯƠNG THÍCH VÀ KHƠNG TƯƠNG THÍCH VỚI HETERODERA GLYCINES CHO THẤY LÂY NHIỄM TUYẾN TRÙNG KÍCH HOẠT PHẢN ỨNG BẢO VỆ CỦA THỰC VẬT Minghui Huang1, Ye Jiang1,2, Ruifeng Qin1,2, Dan Jiang1,2, Doudou Chang1,2, Zhongyan Tian2, Chunjie Li1 Congli Wang1 Võ Như Cầm biên dịch Phịng thí nghiệm Key chọn giống thiết kế phân tử đậu tương, Viện Địa lý Nông học Đông Bắc, Học viện Khoa học Trung Quốc, Cáp Nhĩ Tân, Trung Quốc Học viện Khoa học Nông nghiệp Hắc Long Giang, Đại Khánh, Trung Quốc TĨM TẮT Giải trình tự phiên mã có độ dài đầy đủ với đọc dài cơng cụ mạnh mẽ để phân tích kiện phiên mã sau phiên mã; nhiên, không áp dụng đậu tương (Glycine max) Ở đây, phân tích phiên mã tương đối có chiều dài đầy đủ thực kiểu gen đậu tương 09-138 bị nhiễm tuyến trùng nang đậu tương (SCN, Heterodera glycines) chủng (SCN4, phản ứng khơng tương thích) chủng (SCN5, phản ứng tương thích) cách sử dụng Công nghệ Oxford Nanopore Mỗi mẫu số mẫu có chiều dài đầy đủ thu thập ngày sau cấy có/khơng có tuyến trùng tạo trung bình 6,1Gb liệu tổng số 65.038 trình tự phiên mã Sau loại bỏ thừa, 1.117 gen 41.096 xác định Bằng cách phân tích cấu trúc trình tự lạ, có tổng cộng 28.759 trình tự khung đọc mở (ORF) hồn chỉnh, 5.337 yếu tố phiên mã, 288 RNA dài không mã hóa 40.090 phiên mã với thích chức dự đoán Gene Ontology (GO) Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) phân tích làm giàu gen biểu khác biệt (DEG) cho thấy hormone tăng trưởng, đường tín hiệu kích hoạt auxin tăng trưởng tế bào đa chiều, đường sinh tổng hợp phenylpropanoid làm giàu cách nhiễm hai chủng tuyến trùng Nhiều DEG liên quan đến yếu tố phản ứng với căng thẳng, đường dẫn truyền tín hiệu hormone-thực vật đường tương tác thực vật - mầm bệnh với nhiều điều chỉnh phát phản ứng khơng tương thích với lây nhiễm SCN4 phát nhiều DEG có điều chỉnh liên quan đến trình biến đổi thành tế bào xử lý sinh học carbohydrate phản ứng tương thích với lây nhiễm SCN5 so sánh với Trong số đó, DEG chồng chéo với khác biệt số lượng kích hoạt Sự kết hợp tương tác protein-protein với DEGs lần nhiễm tuyến trùng kích hoạt tương tác yếu tố phiên mã WRKY VQ (valine-glutamine motif) để góp phần bảo vệ đậu tương Kiến thức chế tương tác SCN-đậu tương làm mơ hình giúp hiểu rõ tương tác khác thực vật tuyến trùng Từ khóa: giải trình tự phiên mã chiều dài đầy đủ, glycine max, Heterodera glycines, phản ứng tương thích khơng tương thích, tương tác VQ – WRKY GIỚI THIỆU Tuyến trùng nang đậu tương (SCN, Heterodera glycines Ichinohe) bệnh kinh tế quan trọng đậu tương (Glycine max L Merrill) tồn giới Phân tích thống kê ước tính thiệt hại kinh tế lũy kế dịch bệnh 28 bang Hoa Kỳ từ năm 1996 đến năm 2016 SCN chiếm 23,2% tổng thiệt hại (73.535 USD/ha), xếp hạng cao nhất, lớn nhiều so với bệnh thứ hai thối nhũn (10%) (Bandara cs, 2020) Tại Trung Quốc, thiệt hại kinh tế hàng năm đậu tương lên tới 120 triệu đô la Mỹ (Li Y cs, 2011) SCN tuyến trùng sống vận động đất ký sinh rễ đậu tương Trong giai đoạn di chuyển tự SCN, non giai đoạn hai (J2) nở từ trứng (con non giai đoạn đầu bên trứng) để tìm kiếm rễ vật chủ thơng qua tín hiệu phát từ rễ cây, di chuyển đến rễ xâm nhập rễ cách sử dụng mũi nhọn J2 di chuyển bên rễ, thiết lập vị trí cho ăn lập trình lại tế bào rễ vật chủ cách hướng chất tiết tuyến tiết vào thực vật làm tan thành tế bào dung hợp nguyên sinh chất tế bào lân cận, cuối hình thành cấu trúc nuôi dưỡng độc đáo gọi hợp bào làm nguồn dinh dưỡng cho phát triển tuyến trùng, ngăn cản phát triển ảnh hưởng đến suất (Niblack cs, 2006; Mitchum Baum, 2008) Sự kháng thuốc ký chủ kết hợp với luân canh trồng cách hiệu để kiểm sốt SCN Hơn 300 locus tính trạng số lượng (QTLs) liên quan đến tính kháng SCN lập đồ tới 20 nhiễm sắc thể (chr) (soybase.org), có hai gen kháng chính, rhg1 nhiễm sắc thể (chr) 18 Rhg4 chr 8, nhân đặc trưng (Cook cs, 2012, 2014; Liu cs, 2012, 2017) Sự diện nhiều QTL nhỏ góp phần vào tính kháng đậu tương kháng mẫn cảm làm cho việc nhân giống kháng khó khăn dự kiến (Huang cs, 2021) Hơn nữa, thay đổi độc lực làm giảm khả đề kháng việc trồng lâu dài nguồn giống kháng đơn lẻ, ví dụ, 90% nguồn kháng thuốc có nguồn gốc từ PI88788 Hoa Kỳ chủ yếu nguồn kháng thuốc Bắc Kinh Trung Quốc (Mitchum cs, 2007; Niblack cs, 2008; Acharya cs, 2016; Hua cs, 2018; Huang cs, 2022) Hơn nữa, Peking PI88788 hiển thị khả chống số chủng SCN loại HG Việc thiếu nguồn kháng thuốc rộng rãi diện nhiều chủng SCN loại HG đồng ruộng dẫn đến việc SCN lây lan rộng rãi nhanh chóng Do đó, hiểu chế phân tử lây nhiễm SCN tính kháng trồng có thêm hiểu biết để phát triển chiến lược kiểm soát mới, bao gồm việc thiết kế gen ứng viên quan trọng để tăng sức đề kháng Thực vật tiến hóa để phát triển hai lớp hệ thống miễn dịch phòng thủ mầm bệnh: lớp mơ hình phân tử liên quan đến mầm bệnh vi khuẩn (PAMP/MAMP) kích hoạt miễn dịch (PTI); lớp thứ hai miễn dịch kích hoạt tác dụng (ETI), phù hợp với khả kháng bệnh cụ thể theo loài (Dangl Jones, 2001; Eitas Dangl, 2010; Monaghan Zipfel, 2012) Bề mặt thành tế bào thực vật có chứa thụ thể nhận dạng mẫu (PRR) phát mầm bệnh cấu trúc vi khuẩn để kích hoạt PTI phytohormone phân tử tín hiệu liên quan đến phịng thủ, chẳng hạn axit salicylic (SA), axit jasmonate (JA), ethylene (ET) , khiến thực vật sản sinh protein liên quan đến sinh bệnh học (PR), ví dụ, β-1,3-glucanase, peroxidase, chất ức chế giống oxidase, thionin, proteinase, v.v (Sels cs, 2008) ETI bắt đầu protein lặp lại vùng protein liên kết nucleotide nội bào (NLRs) để tạo phản ứng nhạy cảm (HR) với chết tế bào cục (Eitas Dangl, 2010) PTI ETI kích hoạt hai lớp thụ thể khác tín hiệu sớm, chứng gần cho thấy PTI ETI xun âm phản ứng xi dịng, cách chúng góp phần vào khả miễn dịch với đầu định lượng và/hoặc định tính chưa xác định (Naveed cs , 2020; Yuan cs, 2021) Phân tích phiên mã hệ thống bệnh khác biểu thị tương tác tương thích khơng tương thích gây thay đổi chồng chéo biểu gen có khác biệt số lượng (Mine cs, 2018; Yuan cs, 2021) Các nghiên cứu thực tương tác tương thích khơng tương thích SCN rễ đậu tương dựa phân tích microarray hệ phiên mã RNA-seq (Ithal cs, 2007; Klink cs, 2007; Puthoff cs, 2007; Klink Matthews, 2009 ; Kandoth cs, 2011; Li X cs, 2011; Li cs, 2012, 2018; Mazarei cs, 2011; Wan cs, 2015; Zhang cs, 2017; Kang cs, 2018; Neupane cs, 2019; Song cs, 2019; Jiang cs, 2020; Miraeiz cs, 2020) Tất thích trình tự cho thấy lây nhiễm SCN gây ngăn chặn biểu gen giống trồng mẫn cảm kháng thuốc loạt gen bảo vệ (PPRs NLRs), dịng tín hiệu MAPK (mitogen-hoạt hóa protein kinase), yếu tố phiên mã WRKY MYB (TFs), gen protein sốc nhiệt (HSP), gen PR, gen chuyển hóa phenylpropanoid xác định với phương sai tùy thuộc vào chủng SCN/loại HG loại thực vật Giải trình tự RNA (RNA-seq) dựa giải trình tự hệ (NGS) thơng lượng cao (ví dụ: Illumina) sử dụng rộng rãi để đo lường biểu gen khác biệt cơng nghệ tiên tiến hiệu chi phí (Finotello Di Camillo, 2015) Tuy nhiên, RNA-seq yêu cầu phân mảnh RNA cDNA để tạo lần đọc ngắn chuẩn bị mẫu, điều làm giảm thơng tin từ có độ dài đầy đủ ban đầu; đó, khó có kiện xử lý sau phiên mã/đồng phiên mã chịu trách nhiệm tạo phân tử RNA trưởng thành rời khỏi nhân để hoạt động tế bào cách thay đổi cấu trúc hóa học phiên mã sơ cấp RNA (Kiss, 2001) Giải trình tự nâng cao chệ phiên mã có độ dài đầy đủ với lần đọc dài tránh thách thức Hiện tại, PacBio Oxford Nanopore (ONT) cơng nghệ giải trình tự có độ dài đầy đủ hệ thứ phổ biến cung cấp phiên mã phức tạp tiết lộ cấu trúc thực trình tự trình phiên mã, chẳng hạn nối thay (AS), polyadenyl hóa thay (APA) RNA dài khơng mã hóa (lncRNA) dung hợp gen, làm tăng độ phức tạp transcriptome proteome So với giải trình tự PacBio, ONT sử dụng phương pháp phong tỏa dịng ion để trình tự trực tiếp phân tử DNA địa dài phân tử RNA có chiều dài đầy đủ (Cui cs, 2020; Xie cs, 2021) AS, bước quan trọng trình sửa đổi sau phiên mã, nhận biết loại bỏ vùng bên RNA thông tin tiền thân (pre-mRNA) để tạo nhiều mRNA nhằm điều chỉnh biểu gen, thúc đẩy đa dạng proteome AS đóng vai trị quan trọng khơng q trình sinh trưởng phát triển thực vật mà cịn để đáp ứng với kích thích thích nghi sinh học phi sinh học (Matsukura cs, 2010; Seving cs, 2012; Syed cs, 2012; Mandadi Scholthof, 2015; Wang cs, 2018; Bedre cs, 2019; Martín cs, 2021) APA tạo nhiều đồng dạng polyadenyl hóa mRNA thơng qua phân cắt endonucleolytic trước mRNA bổ sung đuôi poly (A) đầu vị trí phân cắt 3' để thay đổi độ dài vùng chưa dịch (UTR) vùng mã hóa ảnh hưởng đến ổn định mRNA, hiệu dịch mã, địa hóa tế bào, tăng giảm chức gen Do đó, tất thay đổi dẫn đến trình sinh lý sinh hóa thực vật khác (Yeh Yong, 2016; Sadek cs, 2019; Zhang cs, 2020; Tu cs, 2021); ví dụ, APA tham gia vào trình sửa đổi thành tế bào, phát triển lông rễ, sửa chữa DNA điều chỉnh gen để phản ứng với căng thẳng phi sinh học sinh học (Cao cs, 2019; Ye cs, 2019; Yan cs, 2021) Các LncRNA dài 200 nucleotide chất điều hòa biểu sinh điều chỉnh biểu gen cách tương tác với mRNA, DNA, protein miRNA để tham gia vào trình sinh học tăng trưởng phát triển thực vật phản ứng căng thẳng sinh học phi sinh học (Budak cs, 2020; Yu et cs, 2020; Tu cs, 2021; Urquiaga cs, 2021) Việc áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen phiên mã có chiều dài đầy đủ thực vật bị hạn chế so với giải trình tự hệ thứ hai chi phí cao Hiện tại, giải trình tự gen phiên mã có chiều dài đầy đủ để suy cải thiện mơ hình gen xác định gen báo cáo lúa, lúa mì, ngơ, bơng, hồ đào, dương loại khác đậu tương (Clavijo cs, 2017; Wang cs, 2018; Zhang cs, 2019; Zhao cs, 2019; Li C cs, 2020; Yang cs, 2021) Nghiên cứu trước chứng minh dòng đậu tương 09-138, phát triển đông bắc Trung Quốc, mang locus rhg1-a Rhg4-b có khả kháng chủng SCN4 (SCN4, HG type 1.2.3.5.6.7) có tính nhạy cảm đến chủng SCN5 (SCN5, loại HG 2.5.7), khác với kháng cự Bắc Kinh (rhg1-a + Rhg4-a) PI88788 (rhg1-b + Rhg4-b) (Hua cs, 2018; Huang cs, 2022) Chúng công nhận khác biệt phản ứng hai chủng SCN nên liên quan đến phản ứng phiên mã riêng biệt giai đoạn đầu nhiễm trùng tuyến trùng mô tả Để kiểm tra điều này, dòng 09-138 cấy vào hai chủng SCN, phát triển tuyến trùng quan sát bên rễ Phân tích hệ phiên mã chiều dài đầy đủ tương đối dòng đậu tương 09-138 bị nhiễm SCN4 (phản ứng kháng) SCN5 (phản ứng mẫn cảm) thực công nghệ ONT Chúng điều tra kiện AS APA xác định lncRNA yếu tố phiên mã phát Sau đó, gen biểu khác biệt (DEG) (DET) phân tích, DEG liên quan đến yếu tố phản ứng với căng thẳng khám phá Các thuật ngữ DEGGO (Bản thể học) phong phú lộ trình DEG-KEGG (Bách khoa toàn thư gen hệ gen Kyoto) so sánh phản ứng kháng nhạy cảm Các tương tác protein protein dự đoán chế độ bảo vệ thiết lập Cuối cùng, biểu DEG xác nhận RT-PCR định lượng So sánh phản ứng tương thích khơng tương thích cung cấp nhìn sâu sắc chế kháng thuốc xác định gen đề kháng bảo vệ ứng cử viên cho nghiên cứu sâu VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu thực vật nuôi cấy tuyến trùng Dòng đậu tương 09-138 phát triển Học viện Khoa học Nông nghiệp Hắc Long Giang (Hua cs, 2018) SCN chủng (SCN4, HG loại 1.2.3.5.6.7) SCN chủng (SCN5, HG loại 2.5.7) ban đầu thu thập từ đồng ruộng nuôi cấy từ nang đơn hệ giống đậu tương mẫn cảm Dongsheng1 nhà kính với 16 ánh sáng bóng tối 23–280C, sau xác định thử nghiệm chủng đường thị loại HG (Hua cs, 2018) Hàng năm, loại/chủng tuyến trùng HG xác nhận lại mà không thay đổi độc lực theo thời gian Một chất cấy tuyến trùng chuẩn bị theo phương pháp mô tả Huang cs (2022) Mô rễ đất thu thập 35-40 ngày sau cấy cho vào cốc chữ L Hỗn hợp khuấy mạnh đũa thủy tinh khoảng phút sau kết tủa 10 giây Dịch phần phía rót nhẹ nhàng vào sàng lồng 75/25μm Hỗn hợp nang mảnh vụn rễ đầu sàng dùng nút cao su cọ xát để nhả trứng Trứng sàng 25μm rửa vòi nước áp suất cao phút sau nước vơ trùng trước thu Sau đó, trứng thu thập chuyển lên sáu đến tám lớp giấy lụa đỡ kim loại đĩa nở có chứa 3mM ZnSO4 nước vô trùng để nở 280C J2s sau thu thập để cấy sau 3-4 ngày Cấy tuyến trùng, nhuộm rễ chuẩn bị rễ để tách chiết RNA Hạt giống 09-138 khử trùng cách ngâm 0,5% natri hypoclorit 20 phút rửa lại nước vô trùng ba lần Hai hạt gieo chậu nhựa đen (đường kính cm x sâu 12 cm) chứa đầy đất cát khử trùng theo tỷ lệ 1:1 Sau ngày, hai tỉa thưa thành chậu Cây tám ngày cấy vào hỗn dịch ml chứa 2.000 J2 SCN4 SCN5 Cây cấy với ml nước làm đối chứng Các trì buồng sinh trưởng chế độ 16/8 ngày/đêm, 280C ngày/220C đêm độ ẩm tương đối 50% Rễ thu hái nhuộm 3, 6, 8, 10 12 ngày sau cấy axit fuchsin (Byrd cs, 1983) Sự phát triển tuyến trùng bên rễ quan sát, rễ tuyến trùng chụp ảnh kính hiển vi soi phân tích Olympus SZX16 phần mềm hình ảnh Tiêu chuẩn Cellsens (Olympus Corporation, Nhật Bản) Để thu thập rễ để tách chiết RNA, rễ ngày sau cấy rửa tráng kỹ nước Ba rễ từ lần xử lý quấn với nhôm (một mẫu) Ba lần lặp lại thực cho nghiệm thức Tổng số mẫu có kiểm sốt lây nhiễm SCN4- SCN5 thu thập Ngay lập tức, mẫu chuẩn bị đưa vào nitơ lỏng để làm đông giữ -800C để tách chiết giải trình tự RNA Tách chiết RNA, xây dựng thư viện cDNA giải trình tự nanopore RNA tổng số chiết xuất cách sử dụng RNAeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hoa Kỳ) DNase không chứa RNase (Qiagen) sử dụng để loại bỏ ô nhiễm DNA RNA tổng số Nồng độ, độ tinh khiết tính toàn vẹn RNA chiết xuất đo gel agar 1% (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Hoa Kỳ) Quá trình xây dựng thư viện cDNA bắt đầu với μg RNA sử dụng giải trình tự cDNA-PCR (SQK-PCS109) Oxford Nanopore Technologies (ONT, Inc., Vương quốc Anh) cung cấp theo hướng dẫn nhà sản xuất Các thư viện cDNA cuối thêm vào dịng FLO-MIN109 chạy tảng PromethION Công ty Công nghệ Biomarker (Bắc Kinh, Trung Quốc) để giải trình tự Các quy trình thử nghiệm bao gồm kiểm tra chất lượng mẫu, xây dựng thư viện, kiểm tra chất lượng thư viện giải trình tự thư viện thực theo quy trình tiêu chuẩn ONT cung cấp Xử lý liệu thơ để có phiên mã có độ dài đầy đủ Các lần đọc thơ phải qua lọc với điểm chất lượng đọc trung bình ≤ độ dài đọc ≤ 500 bp, RNA ribosome lập đồ tới sở liệu rRNA bị loại bỏ Các trình tự mồi hai đầu lần đọc rõ tìm kiếm để xác định trình tự có độ dài đầy đủ, số (FLNC) Các FLNC phát sau lập đồ tới gen tham chiếu đậu tương Williams 82.a2.v11 với minimap2 (Li, 2018) để thu cụm FLNC pinfish2 áp dụng để đánh bóng cụm để đạt đồng thuận đồng Tất lần đọc lập đồ tiếp tục thu gọn cách sử dụng gói cDNA_Cupcake với độ nhận dạng nhỏ 90% độ phủ nhỏ 85% Khi phiên mã thừa thu gọn, khác biệt 5′ không xem xét Các bảng phiên mã so sánh với phiên mã biết gen tham chiếu Williams 82.a2.v1 sử dụng gffcompare, phiên mã xác định để tạo thích gen bổ sung Ranh giới gen sửa đổi có mức biểu ≤ lọc Phân tích cấu trúc: Xác định Polyadenyl hóa thay thế, Bản dung hợp, Sự kiện nối thay Marker tế bào vi mô Polyadenyl hóa thay xác định thơng qua phân tích thêm FLNC Đường ống phân tích phiên mã từ Giải trình tự đồng dạng (TAPIS) (Foissac Sammeth, 2007) Tối đa hóa nhiều kỳ vọng để kích thích động lực (MEME) (Bailey cs, 2006) sử dụng để phân tích trình tự 50bp ngược dịng vị trí poly A để phát mơ típ FL Trình tự đồng thuận trước phân tích loại bỏ dư thừa sử dụng để phân tích phiên mã dung hợp Phiên mã dung hợp xác định theo điều kiện sau: chỉnh cho nhiều vị trí; địa điểm bao gồm 5% phiên mã với độ dài chỉnh tối thiểu 1bp; tổng độ dài chiếm 95% tổng độ dài phiên mã với khoảng cách 10k bp hai địa điểm Nối thay trình xử lý tiền mRNA Phiên mã gen tạo tiền mRNA nhiều phương pháp nối Năm loại kiện nối thay (vị trí nối 3', vị trí nối 5', bỏ qua exon, lưu giữ intron exon loại trừ lẫn nhau) kiểm tra cách sử dụng phần mềm Astalavista dựa kết chỉnh mẫu riêng lẻ với gen tham chiếu (Foissac Sammeth, 2007) Phần mềm MIcroSAtellite (MISA, công cụ nhận dạng) sử dụng để phân tích SSR phiên mã 500bp bị loại bỏ Dự đốn trình tự mã hóa, Nhận dạng RNA dài khơng mã hóa phát yếu tố phiên mã từ lạ Trình tự mã hóa (CDS) dự đốn với TransDecoder (v3.0.0; Haas cs, 2013) dựa ORF LncRNA không mã hóa cho protein Do đó, LncRNA dự đốn liệu có tiềm mã hóa hay khơng phân tích miền protein bao gồm bốn phương pháp, Máy tính tiềm mã hóa (CPC) (Kong cs, 2007), Chỉ số mã hóa khơng mã hóa (CNCI) (Sun cs, 2013), Cơng cụ đánh giá tiềm mã hóa (CPAT) (Wang cs, 2013) họ Protein (Pfam) (Finn cs, 2014) Các gen mục tiêu LncRNA dự đoán hai phương pháp: thứ nhất, tùy thuộc vào mối quan hệ vị trí lncRNA biểu khác biệt mRNA liền kề (trong khoảng cách 100k bp) biểu khác biệt; thứ hai, theo bắt cặp sở bổ sung lncRNA mRNA cách sử dụng công cụ lncTAR (Li cs, 2015) TF phát với iTAK (Zheng cs, 2016) Định lượng mức độ phiên mã/biểu gen phân tích biểu khác biệt Các lần đọc chiều dài đầy đủ lập đồ có chất lượng khớp > chọn để định lượng Mức độ biểu gen phiên mã đo số đếm triệu (CPM) (Zhou cs, 2014) tính tốn sau: CPM = (số lần đọc khớp với phiên mã)/(tổng số lần đọc khớp với phiên mã tham chiếu) × 106 Biểu khác biệt nghiệm thức phân tích với DESeq2 (Anders Huber, 2010) tùy thuộc vào mơ hình phân phối nhị phân âm, thu DEG DET Tỷ lệ phát sai (FDR) điều chỉnh kiểm soát phương pháp Benjamini Hochberg (1995), DEG DETs với thay đổi log2fold (FC) ≥ FDR vị trí đa A, vị trí đa A (21,5%) có vị trí đa A (9,6%) (Hình 2A) Số lượng phân bố địa điểm poly A khơng có khác biệt có ý nghĩa (P> 0,05) ba nghiệm thức (Hình 2B) Theo cách mổ xẻ kỹ hơn, thấy nhiễm SCN4 khiến đậu tương tạo số trung bình (840 ± SE 26) lớn đáng kể (840 ± SE 26) số > 10 vị trí đa A so với nhiễm SCN5 (734 ± SE 12) đối chứng (698 ± SE 26), APA có nhiều vị trí poly A tham gia vào phản ứng khơng tương thích Mức độ giàu T A phát phía phía vị trí 50 bp (Hình 2C) Ba mơ típ APA giàu GC (CAGGGG, GGCTGC GGCCGC) xác định trình tự 50 bp ngược dịng vị trí đa A (Hình 2D) Kiểm tra phiên mã dung hợp trước phân tích loại bỏ dư thừa cho thấy 2-12 phiên mã dung hợp cho mẫu Tương tự, nhiễm SCN4 tạo tổng cộng 21 dung hợp, có 14 dung hợp tìm thấy cho SCN5 đối chứng (Bảng bổ sung 3), cho thấy dung hợp tham gia vào phản ứng phịng vệ Hình Phân tích kiện polyadenylation thay (APA) thay (AS) kiểu gen đậu tương 09-138 bị nhiễm tuyến trùng nang đậu tương chủng (SCN4) chủng (SCN5), nước đối chứng (CK) (A) Sự phân bố tổng số vị trí đa A gen (B) So sánh phân bố vị trí đa A nghiệm thức CK, SCN4 SCN5 (C) Phân bố sở (tính bằng%) 50 bp phía phía vị trí poly A tất (D) Các mơ-típ APA xác định (E) Tổng số AS cho CK, SCN4 SCN5 (F) So sánh kiện AS phương pháp điều trị CK, SCN4 SCN5 Phân tích Astalavista phiên mã lạ chứng minh ba nghiệm thức khơng có khác biệt đáng kể số lượng kiện AS trung bình, 1,925 ± SE 54,6, 2,265 ± SE 145,8; 2,287 ± SE 130.1 cho nghiệm thức đối chứng, tương ứng SCN4 SCN5 (Hình 2E), kiện AS khác nghiệm thức Dựa tỷ lệ phần trăm trung bình kiện AS số thư viện, có 40,11% lần truy cập intron, 26,28% vị trí nối 3' thay thế, 18,81% bỏ qua exon, 14,34% vị trí nối 5' thay 0,46% exon loại trừ lẫn (Hình 2F) Số lượng kiện AS vị trí mối nối 3' thay hai nghiệm thức bị nhiễm tuyến trùng thấp đáng kể (P