(Luận văn thạc sĩ) đánh giá khả năng sinh tổng hợp chất kháng ung thư của một số chủng vi nấm được phân lập từ hải miên ở vùng biển khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Hồ Công Dung ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG UNG THƯ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI NẤM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ HẢI MIÊN Ở VÙNG BIỂN KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Nha Trang – 2021 Luan van BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Hồ Công Dung ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG UNG THƯ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI NẤM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ HẢI MIÊN Ở VÙNG BIỂN KHÁNH HÒA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trần Thị Thanh Vân Nha Trang - 2021 Luan van LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS.TS Trần Thị Thanh Vân Các số liệu kết trình bày luận văn kết làm việc tơi suốt q trình thực nghiệm Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang Khánh Hòa, ngày 30 tháng 11 năm 2021 Tác giả luận văn Nguyễn Hồ Công Dung Luan van LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc trân trọng đến PGS.TS Trần Thị Thanh Vân, Viện Nghiên cứu Ứng dụng cơng nghệ Nha Trang, tận tình giúp đỡ, hướng dẫn khoa học định hướng nghiên cứu suốt q trình tơi thực hồn thiện luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Phan Thị Hoài Trinh, Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang, quan tâm tạo động lực cho tơi suốt q trình thực luận văn Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn đến anh, chị phịng Cơng nghệ sinh học biển Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang, giúp đỡ tơi hồn thành tốt phần thực nghiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý Thầy, Cô giảng dạy cung cấp kiến thức để tơi hồn thành học phần chương trình đào tạo Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Học viện Khoa học Công nghệ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang Quý Thầy, Cô Phịng Đào tạo Học viện Khoa học Cơng nghệ; Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành nội dung chương trình đào tạo thủ tục cần thiết q trình học tập Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè ln quan tâm, hỗ trợ động viên thời gian qua để tơi hồn thành tốt nhiệm vụ học tập cơng tác chun mơn Khánh Hịa, ngày 30 tháng 11 năm 2021 Tác giả luận văn Nguyễn Hồ Công Dung Luan van DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng anh Tiếng việt Tế bào ung thư biểu mô thận ACHN Renal carcinoma cells A-594 Adenocarcinomic human alveolar Tế bào ung thư phổi basal epithelial cells A2780 Human ovarian cancer Ung thư buồng trứng người BGC-823 Gastric adenocarcinoma cell line Tế bào ung thư dày BEL-7402 Human liver cancer Human liver cancer CN Human nasopharyngeal cancer Ung thư vòm họng DNA Acid Deoxyribonucleic Acid Deoxyribonucleic DU145 Prostatic carcinoma cell line Tế bào ung thư tuyến tiền liệt HCT-15 Human colon cancer cell line Tế bào ung thư đại tràng HCT-116 Human colon cancer cell line Tế bào ung thư đại tràng HeLa HeLa cell line Tế bào ung thư cổ tử cung HL-60 Human leukemic cell line Tế bào ung thư bạch cầu Luan van HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng cao áp HepG-2 Human liver cancer Ung thư gan người HL-29 Colorectal adenocarcinoma cell line Tế bào ung thư đại trực tràng K-562 Human leukemic cell line Tế bào ung thư bạch cầu ITS Internal transcribed spacer Vùng phiên mã nội MDA-MB231 Human breast cancer cells Tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MGC803 human gastric cancer cells Tế bào ung thư dày MCF-7 Human breast carcinoma cell line Tế bào ung thư vú MS Mass spectroscopy Phổ khối MTT - [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5 diphenyl tetrazolium bromide MOLT-4 Human leukemia Ung thư bạch cầu người NCI-H23 Human lung cancer cell line Tế bào ung thư biểu mô phổi NCI-H460 Human lung cancer cell line Tế bào ung thư phổi NUGC-3 Gastric adenocarcinoma cell line Tế bào ung thư biểu mô dày Luan van OSMAC One-Strain-Many-Compounds Một chủng – Nhiều hợp chất PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại gen PC-3 Prostatic carcinoma cell line Tế bào ung thư tuyến tiền liệt SK-MEL-2 Human skin cancer Ung thư da người SK-BR-3 Human breast cancer Ung thư vú người SGC-7901 Human gastric cancer Ung thư dày người SW1990 Pancreatic cancer cell line Tế bào ung thư tuyến tụy T47D Human breast cancer Ung thư vú người WiDr Human colon cancer Ung thư ruột kết người Luan van DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Danh sách chủng vi nấm biển phân lập 38 Bảng 3.2 Hoạt tính gây độc tế bào chủng vi nấm biển phân lập 52 Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái chủng vi nấm biển tuyển chọn 63 Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái 05 chủng vi nấm biển tuyển chọn quan sát kính hiển vi 64 Bảng 3.5 Phân loại 05 chủng vi nấm biển dựa phân tích trình tự gen vùng ITS 66 Luan van DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Sự đa dạng vai trị vi nấm hệ sinh thái biển Hình 2.1 Địa điểm thu mẫu hải miên đảo Hịn Tre, vịnh Nha Trang 33 Hình 2.2 Các chủng vi nấm biển lên men tĩnh mơi trường gạo 34 Hình 2.3 Sinh khối môi trường lên men vi nấm ngâm chiết với ethyl acetate 35 Hình 3.1 Thống kê đặc điểm bề mặt khuẩn lạc 65 chủng vi nấm biển 49 Hình 3.2 Thống kế đặc điểm độ dày khuẩn lạc 65 chủng vi nấm biển 50 Hình 3.3 Thống kê màu sắc bề mặt khuẩn lạc 65 chủng vi nấm biển 51 Hình 3.4 Cây phát sinh chủng loại 05 chủng vi nấm biển tuyển chọn xây dựng dựa trình tự gen vùng ITS theo phương pháp Neighbor Joining, boostrap 1000 lần phần mềm MEGA7 69 Luan van MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI NẤM BIỂN 1.2 CÁC NGUỒN PHÂN LẬP VI NẤM BIỂN 1.2.1 Vi nấm từ hải miên 10 1.2.2 Vi nấm từ san hô mềm 12 1.2.3 Vi nấm từ rong biển 12 1.2.4 Vi nấm từ vùng nước trầm tích biển sâu 13 1.2.5 Vi nấm từ rừng ngập mặn 14 1.2.6 Vi nấm biển phân lập từ nguồn khác 15 1.3 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ TỪ VI NẤM BIỂN 16 1.4 CÁC HỢP CHẤT KHÁNG UNG THƯ TỪ VI NẤM BIỂN 18 1.5 TÌNH HÌNH VÀ ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU CÁC HOẠT CHẤT KHÁNG UNG THƯ TỪ VI NẤM BIỂN 24 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 VẬT LIỆU 32 Luan van 96 180 Mohamed I.E., Gross H., Pontius A., Kelter G., Krick A, Kehraus S., König G.M., Fiebig H.-H., Maier A., 2009, Epoxyphomalin A and B, prenylated polyketides with potent cytotoxicity from the marine-derived fungus Phoma sp., Organic Letters, 11(21), pp 5014–5017 181 Jadulco R., Ebel R., Schaumann K., Berg A., Wray V., Proksch P., Steube K., 2004, New communesin derivatives from the fungus Penicillium sp derived from the Mediterranean sponge Axinella verrucosa, Journal of Natural Products, 67(1), pp 78–81 182 Bugni T.S., Bernan V.S., Greenstein M., Maiese W.M., Janso J.E., Ireland C.M., Mayne C.L., 2003, Brocaenols A-C: novel polyketides from a marine derived Penicillium brocae, The Journal of Organic Chemistry, 68(5), pp 2014–2017 183 Zhang H., Zhao Z., Wang H., 2017, Cytotoxic Natural Products from Marine Sponge-Derived Microorganisms, Marine Drugs, 15(3), pp 68 184 Chen H., Aktas N., Konuklugil B., Daletos L., Lin W., Dai H., 2015, new fusarielin analogue from Penicillium sp isolated from the Mediterranean sponge Ircinia oros, Tetrahedron letters, 56(35), pp 5316–5320 185 Liu S., Su M., Song S.J, Jung J.H., 2017, Marine-Derived Penicillium Species as Producers of Cytotoxic Metabolites, Marine Drugs, 15(10), pp 329–373 Luan van PHỤ LỤC Phụ lục 1: Danh sách số mẫu hải miên thu nhận vùng biển Nha Trang Ký hiệu mẫu Hình ảnh mẫu Tên khoa học 1901NT - 1.2 Petrosia sp 1901NT - 1.36 Axinyssa sp 1901NT - 1.39 Petrosia sp 1901NT - 1.49 Haliclona sp 1901NT - 1.50 Cliona sp 1901NT - 1.51 Clathria sp 1901NT - 1.52 Haliclona sp Luan van 1901NT - 1.59 Haliclona sp 1901NT - 1.62 Haliclona sp 1901NT - 2.7 Haliclona sp 1901NT - 2.8 Ircinia sp 1901NT - 2.14 Acanthella sp 1901NT - 2.23 Haliclona sp 1901NT - 2.42 Haliclona sp Luan van 1901NT - 2.43 Cliona sp 1901NT - 3.1.1 Aaptos sp 1901NT - 3.3 Haliclona sp 1901NT - 3.7 Clathria sp 1901NT - 3.8 Haliclona sp 1901NT - 3.9.1 Haliclona sp 1901NT - 3.13 Clathria sp Luan van 1901NT - 3.14 Cinachyrella sp 1901NT - 3.19 Clathria sp 1901NT - 3.21 Aaptos suberitoides 1901NT - 3.29 Haliclona sp 1901NT - 3.31 Aaptos suberitoides 1901NT - 3.35 Haliclona sp 1901NT - 3.48 Clathria sp Luan van 1901NT - 3.51 Haliclona sp 1901NT - 3.52 Dysidea sp Phụ lục 2: Trình tự gen vùng ITS chủng vi nấm tuyển chọn >1901NT-1.2.2 TCACACGGACACGGACACCCCCATCCCATACGGGATTCTCACCCTC TATGACGACCCGTTCCAGGGTACTTAGATGGGGGCCGCAACCGAA GCATCCTCTGCAAATTACAACTCGGACTCCGAAGGAGCCAGATTTC AAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGAGGCAATCCC GGTTGGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGG TATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGTTAAAAAAAGGTTGGTG GTCGGCAGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCC ATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCC CGTCCCCCGGGAAGGGGACGGCGACCCAACACACAAGCCGTGCTT GAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCA GGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCT GCAATTCACATTAATTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCC GGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACGATTAAATAAAT CGACTCAGACTGCAACCTTCAGACAGTGTTCGTGTTGGTGTCTCCG GCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGAATGCCCCCCGGCGGCCACGAATG GCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTACGATAGACACGGGTGGGAG GTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCG Luan van >1901NT-1.40.4 TTGGTGAACAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAA CCCCAATGTGAACGTTACCAATCTGTTGCCTCGGCGGGATTCTCTT GCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGATCCCATGGCGCCCGCCGGAG GACCAACTCCAAACTCTTTTTTCTCTCCGTCGCGGCTCCCGTCGCG GCTCTGTTTTATTTTTGCTCTGAGCCTTTCTCGGCGACCCTAGCGGG CGTCTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTC TGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAAT TGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCC GCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCT CGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCCTCACCGG GCCGCCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCG CAGTAGTTTGCACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGGCCACAGCC GTAAAACACCCCAAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAG GAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGG >1901NT-1.40.2 CACACGGACGCGGACACCCCGTCCCAGACGGGATTCTCACCCTCT ATGACGGCCCGTTCCAGGGCACTTAGACGGGGGCCGCACCCGAAG CATCCTCTGCAAATTACAACTCGGACCCCGAGGGGGCCAGATTTC AAATTTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGAGGCAATCCC GGTTGGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGG TATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGAGAAATAGTTGGTTGCT TTTCAGCGTCGGCCAGCGCCGGCCGGGCCTACAAGAGCGGGTGAC AAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCT TTCGGGCCCGTCCCCGGGGGGACGACGACCCAACACACAAGCCGT GCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATACCCCCCGGAAT ACCAGGGGGTGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAA TTCTGCAATTCACATTAATTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGA TGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCGA TACAATCGAACTCAGACAACAAAACTTCAGACAGTGTTCACGTTG Luan van GTGTCTCCGGCGGGCGCTCGCCTAGGGAGGGGGGTTTGACGCCCC CCCCGGCGGCCGCTTGCGCGGCGGGCCCGCCGAAGCAA >1901NT-2.50.2 GGCCCAGAGAGGTGGGCAACTACCACTCAGGGCCGGAAAGCTCTC CAAACTCGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCC GTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCA AACCCCTGTGAACATACCTTATTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGC GCCCCGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGAACCCAAACTCTATT GTATTTAGTGTATCTTCTGAGTAACACAAACAAATAAATCAAAACT TTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGC AAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCG AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGC CTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAACCCCCGGGTTTGGTGTTG GGGATCGGGTCGCTAGTCGACCCGTCTCCGAAATCTAGTGGCGGT CTCGCTGCAGCCTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGA ACGCGGCGCGGCCATGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAATGTTGA CCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA AGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGA GTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTCGGGCCCG AGTTGTAATTTGTAGAGGATGTTTTTGATGCGGTGCCTTCCGAGTT CCCTGGAACGGGACGCCATAGAGGGTGAGAGCCCC >1901NT-2.53.1 TACGGGATTCTCACCCTCTATGACGGCCCCTTCCAGGGCACTTAGA TGGGGGCCGCTCCCGAAGCATCCTCTGCAAATTACAATGCGGACC CCGAAGGAGCCAGCTTTCAAATTTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGC CGTTACTGAGGCAATCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGAT ATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTG GAAAAAAGATTGATGGTGTCGGCAGGCGCCGGCCGGGCCTACAGA Luan van GCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCG CCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCGGGGGACGAGGGCCCAACACAC AAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCC CCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATT CACTGAATTCTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCT TCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACG ATTTAGCTTTTCGCTCAGACTGCAATCTTCATACAGCGTTCACAGG TGTCTTCGGCGGGCGCGGACCCGGGGACGGAAGCCCCCCGGCGGC CTTGCGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTACGATAAACACGGGT GGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCG CAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCTCTAAA TGACCGAGTTTGACCAACTTTCCGGCTCTGGGGGGTCGTTGCCAAC CCTCCTGAGCCAGTCCGA Luan van DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Phan Thị Hồi Trinh, Ngơ Thị Duy Ngọc, Võ Thị Diệu Trang, Cao Thị Thúy Hằng, Trần Thị Thanh Vân, Phạm Đức Thịnh, Huỳnh Hồng Như Khánh, Lê Đình Hùng, Nguyễn Hồ Cơng Dung, 2021, Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư số chủng vi nấm phân lập từ hải miên vịnh Nha Trang, Tạp chí hóa học, 59(4E1,2), tr 200-204 Luan van TẠP CHÍ HĨA HỌC 59(4E1,2) 200-204 Tháng năm 2021 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư số chủng vi nấm phân lập từ hải miên vịnh Nha Trang Phan Thị Hồi Trinh1*, Ngơ Thị Duy Ngọc1, Võ Thị Diệu Trang1, Cao Thị Thúy Hằng1, Trần Thị Thanh Vân1, Phạm Đức Thịnh1, Huỳnh Hoàng Như Khánh1, Lê Đình Hùng1, Nguyễn Hồ Cơng Dung2 Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, 02 Hùng Vương, Nha Trang, Khánh Hòa 65000, Việt Nam Viện Pasteur Nha Trang, 08 Trần Phú, Nha Trang, Khánh Hòa 65000, Việt Nam Đến Tòa soạn 20-5-2021; Chấp nhận đăng 15-7-2021 Abstract Marine fungi are evaluated as a potential source for new natural compounds with bioactivities of pharmaceutical values In this study, 66 fungal strains, isolated from 37 sponge samples collected in Nha Trang bay, were determined for cytotoxic activity against two human cancer cell lines including cervical cancer (Hela) and breast cancer (MCF-7) cells using MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay The results showed that 46.9% (31/66) strains exhibited cytotoxic activity against both tested cancer cell lines Based on the analysis of internal transcribed spacer (ITS) gene sequences, five isolates with effective anticancer activity were identified including Aspergillus sp 1901NT-1.2.2, Talaromyces sp 1901NT-1.39.3, Aspergillus subramanianii 1901NT-1.40.2, Phoma sp 1901NT-1.45.1, and Penicillium sp 1901NT-2.53.1 These selected fungal strains are being further studied to obtain anticancer compounds Keywords Cytotoxic activity, marine fungi, natural compounds, sponges GIỚI THIỆU Hiện nay, ung thư bệnh nguy hiểm gây tử vong hàng đầu nhiều quốc gia giới gia tăng nhanh liên quan đến chất lượng nguồn thực phẩm môi trường sống.[1] Một hướng hiệu để giải vấn đề tìm kiếm hoạt chất từ tự nhiên tổng hợp theo mẫu hình cấu trúc hợp chất tự nhiên để làm thuốc đặc trị Trong đó, vi nấm biển xác định nguồn tiềm để khám phá các loại thuốc kháng ung thư liên quan đến đa dạng lồi khả tổng hợp nhiều nhóm chất chuyển hóa thứ cấp.[2] Thống kê cho thấy số hợp chất phát từ vi nấm biển chiếm đến 36 % tổng số 1.277 hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học có giá trị ứng dụng y dược.[3] Vi nấm biển phân lập từ nhiều nguồn khác bao gồm nước biển, trầm tích biển, sống cộng sinh với rong biển, san hơ hải miên.[4] Trong đó, số lượng chủng vi nấm thu nhận từ nguồn hải miên chiếm tỷ lệ cao Các nghiên cứu cho thấy vi nấm chiếm đến 50% sinh khối vật chủ nên dễ dàng thu nhận từ mô bên hải miên.[5] Hệ vi sinh vật sống cộng sinh với hải miên đánh giá đa dạng có khả sinh tổng hợp nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học phong phú đóng vai trị quan trọng trình trao đổi chất vật chủ.[6] Với đa dạng loài cao phân bố rộng hải miên nên xem nguồn giá trị để thu nhận nhiều lồi vi nấm biển có khả tạo chất chuyển hóa thứ cấp mới.[7] Nhiều nghiên cứu chứng minh phần lớn hợp chất chuyển hóa thứ cấp có giá trị y dược thu nhận từ hải miên sinh tổng hợp chủng vi sinh vật sống cộng sinh.[8] Vịnh Nha Trang đánh giá có hệ sinh thái đa dạng với nhiều loài động thực vật sống cộng sinh với nhau, có đến 89 lồi hải miên diện.[9] Tuy nhiên, chưa có nhiều cơng trình đánh giá tiềm sinh tổng hợp hoạt chất sinh học nguồn vi nấm phân lập từ hải miên vùng biển Vì vậy, nghiên cứu thực nhằm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư số chủng vi nấm biển phân lập từ hải miên vịnh Nha Trang đồng thời tuyển chọn chủng vi nấm tiềm cho nghiên cứu phân tách thu nhận hợp chất kháng ung thư ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 200 Luan van TCHH, 2021, 59(4E1,2) Phan Thị Hoài Trinh cộng 2.1 Đối tượng nghiên cứu mẫu đối chứng huyền phù tế bào không bổ sung dịch chiết Các chủng vi nấm biển phân lập từ mẫu hải miên thu nhận vịnh Nha Trang (tọa độ 12o10’B; 109o16’Đ) độ sâu 8-10 mét Các chủng vi nấm lưu giữ Bộ sưu tập vi sinh vật biển Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập vi nấm biển Các mẫu hải miên rửa với nước biển vô trùng để loại bỏ vi sinh vật ngoại nhiễm Một gam mẫu đồng với mL nước biển vô trùng cấy trang 100 µL dịch lên đĩa thạch chứa mơi trường thạch Sabouraud có bổ sung kháng sinh gồm 10 g pepton, 20 g glucose, 18-20 g agar, 1.000 mL nước biển tự nhiên, 1,5 g penicillin, 1,5 g streptomycin, pH 6,07,0.[10] Hình thái khuẩn lạc vi nấm bắt đầu quan sát sau 3-5 ngày nuôi cấy 28 oC Các chủng vi nấm biển lưu giữ môi trường canh Sabouraud bổ sung 40 % glycerol -80 oC 2.2.2 Thu nhận cao chiết thô từ dịch chiết lên men chủng vi nấm biển Các chủng vi nấm lên men tĩnh 28oC bình Erlenmeyer 500 ml chứa mơi trường gồm 20 g gạo, 20 mg dịch chiết nấm men, 10 mg KH2PO4 40 ml nước biển tự nhiên thu vịnh Nha Trang Sinh khối vi nấm sau nuôi cấy ngày môi trường thạch Sabouraud cắt thành mẩu có kích thước 1×1 cm chuyển vào bình mơi trường gạo hấp khử trùng 12 1oC, 15 phút Sau 21 ngày lên men, sinh khối vi nấm môi trường nuôi cấy ngâm chiết ethyl acetate (200 ml/bình) 48 giờ, sau tiến hành lọc, quay chân khơng 40 oC thu nhận cao chiết thô để sử dụng cho thử nghiệm sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào.[11] 2.2.3 Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư Các cao chiết ethyl acetate thu nhận đánh giá hoạt tính gây độc hai dòng tế bào ung thư gồm ung thư cổ tử cung (Hela), ung thư vú (MCF-7) dựa phương pháp MTT.[12] Các dịng tế bào ni cấy đĩa 96 giếng 24 37 oC % CO2 Huyền phù tế bào (5×103 tế bào/giếng) ủ với dịch chiết thử nghiệm (100 µg/ml) chuẩn bị Dimethyl sulfoxit (DMSO) 24 Tiến hành đo OD máy ELISA (Biotek, Mỹ) để đọc kết quang phổ hấp phụ bước sóng 540 nm Từ đó, nồng độ % mật độ sống tế bào ung thư thử nghiệm xác định cách so sánh với 2.2.4 Phân loại vi nấm biển Các chủng vi nấm biển có hoạt tính cao tuyển chọn phân loại dựa phân tích trình tự gen vùng ITS cặp mồi ITS1 (5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’).[13] Các trình tự gen chủng vi nấm so sánh với trình tự gen tương ứng chủng vi nấm ngân hàng gen NCBI sử dụng công cụ BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trong nghiên cứu này, cao chiết ethyl acetate thu nhận từ dịch chiết lên men môi trường gạo 66 chủng vi nấm phân lập từ 37 mẫu hải miên vịnh Nha Trang xác định hoạt tính gây độc hai dòng tế bào ung thư gồm ung thư cổ tử cung (Hela), ung thư vú (MCF-7) Kết sàng lọc Bảng cho thấy 46,9 % (31/66) chủng vi nấm thử nghiệm thể hoạt tính kháng hai dịng tế bào ung thư thử nghiệm Các chủng vi nấm có khả ức chế 50 % khả sống dòng tế bào thử nghiệm so sánh với mẫu đối chứng Bên cạnh đó, kết thử nghiệm thể hoạt tính kháng tế bào ung thư vú MCF-7 ghi nhận cao so với dòng tế bào lại, 74,2 % (n = 49) 51,5% (n = 34) Trong số chủng vi nấm thể hoạt tính kháng ung thư, chủng vi nấm phân loại dựa phân tích trình tự gen vùng ITS xây dựng phát sinh chủng loại bao gồm Aspergillus sp 1901NT-1.2.2, Talaromyces sp 1901NT-1.39.3, Aspergillus subramanianii 1901NT-1.40.2, Phoma sp 1901NT1.45.1, Penicillium sp 1901NT-2.53.1 (hình 1) Theo báo cáo thu thập được, nghiên cứu đánh giá hoạt tính gây độc tế bào chủng vi nấm phân lập từ hải miên vùng biển Theo tài liệu công bố cho thấy 46,2 % chủng vi nấm phân lập từ loài hải miên Neopetrosia chaliniformis đảo Mandeh, Indonesia ghi nhận có hoạt tính gây độc tế bào ung thư đại tràng người (WiDr).[14] Trong số đó, đáng lưu ý chủng vi nấm Aspergillus nomius ND06 thể hoạt tính kháng tế bào ung thư thử nghiệm không ảnh hưởng đến phát triển dịng tế bào thường (Vero) Bên cạnh đó, 26,3 % chủng vi nấm thu nhận từ loài hải miên Tedania anhelans, Myxilla arenaria, Callyspongia fibrosa vùng biển Kerala, Ấn Độ báo cáo có hoạt tính kháng 201 Luan van TCHH, 2021, 59(4E1,2) Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào… hiệu dòng tế bào ung thư phổi người (NCI-H460) Các chủng vi nấm có hoạt tính xác định thuộc chi Aspergillus Pencillium.[15] Ngoài ra, chủng vi nấm thuộc loài Aspergillus versicolor phân lập từ hải miên Petrosia sp đảo Jeju, Hàn Quốc ghi nhận có khả sinh tổng hợp hợp chất thuộc nhóm polyketide có hoạt tính kháng đặc hiệu dòng tế bào ung thư thử nghiệm bao gồm A-549, SK-OV-3, SK-MEL-2, XF498, HCT-15.[16] Thông qua công bố khẳng định tiềm vai trò quan trọng nguồn vi nấm liên kết với hải miên nghiên cứu hợp chất kháng ung thư Bảng 1: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư dịch chiết từ vi nấm biển STT Chủng vi nấm % tế bào sống sót HeLa MCF-7 1901NT - 1.2.2 1901NT - 1.32.1 1901NT - 1.37.1 21,8±2,8 47,3±22,1 13,5±1,5 16,8±0,7 25,0±0,9 15,0±0,4 1901NT - 1.37.4 11,5±0,7 11,5±0,2 1901NT - 1.39.2 45,9±3,8 39,5±3,7 1901NT - 1.39.3 42,0±5,6 25,7±1,6 1901NT - 1.40.1 17,3±0,5 13,5±0,3 1901NT - 1.40.2 20,9±2,0 12,5±0,3 1901NT - 1.40.3 47,6±8,6 46,2±4,4 10 1901NT - 1.40.4 12,0±1,9 14,6±0,5 11 1901NT - 1.42.1 29,6±4,4 18,4±1,3 12 1901NT - 1.44.1 12,8±0,7 37,4±7,6 13 1901NT - 1.45.1 35,2±6,0 27,5±1,8 14 1901NT - 1.45.2 16,3±4,0 21,8±1,8 15 1901NT - 1.45.4 38,4±9,7 20,3±1,1 16 1901NT - 1.50.1 14,9±2,8 24,3±0,4 17 1901NT - 1.71.5 21,7±4,4 16,1±3,0 18 1901NT - 2.2.1 47,9±13,2 25,7±2,1 19 1901NT - 2.2.2 18,8±2,7 10,7±0,4 20 1901NT - 2.9.1 12,2±0,2 48,2±4,8 21 1901NT - 2.11.3 39,8±6,3 39,8±1,8 22 1901NT - 2.24.1 18,4±2,2 11,2±0,8 23 1901NT - 2.31.2 42,2±3,4 30,3±0,4 24 1901NT - 2.35.3 15,4±2,1 21,5±1,6 25 1901NT - 3.13.4 11,7±0,3 12,4±0,2 26 1901NT - 2.45.2 32,3±2,6 33,0±5,2 27 1901NT - 2.45.3 11,2±1,0 19,8±1,1 28 1901NT - 2.45.5 31,3±9,9 30,2±2,4 29 1901NT - 2.50.2 11,4±0,8 12,9±0,8 30 1901NT - 2.51.4 38,6±1,7 35,6±2,0 31 1901NT - 2.53.1 25,9±2,5 26,2±1,1 202 Luan van TCHH, 2021, 59(4E1,2) Phan Thị Hoài Trinh cộng Các công bố chứng minh nhiều nhóm chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng ung thư đặc hiệu thu nhận từ chủng vi nấm thuộc chi Aspergillus Penicillium alkaloid, terpenoid, xanthone, sterol, diphenyl ether anthraquinone.[17, 18] Ở nghiên cứu trước, thu nhận hợp chất asterriquinone C1 từ chủng vi nấm Aspergillus flocculosus 01NT.1.1.5 phân lập từ hải miên Stylissa sp vịnh Nha Trang có khả ức chế phát triển 06 dòng tế bào ung thư người gồm ung thư đại tràng (HCT-15), ung thư dày (NUGC-3), ung thư phổi (NCI-H23), ung thư thận (ACHN), ung thư tuyến tiền liệt (PC-3) ung thư vú (MDA-MB-231) với giá trị IC50 30-40 µM.[19] Bên cạnh đó, hoạt tính kháng sinh chống oxy hóa ghi nhận chủng vi nấm phân lập từ hải miên vùng biển này.[20,]21] Từ kết sàng lọc bước đầu cho thấy chủng vi nấm phân lập từ hải miên vùng biển Nha Trang nguồn tiềm để tiếp tục nghiên cứu thu nhận hợp chất có hoạt tính kháng ung thư góp phần bổ sung vào danh mục hợp chất tự nhiên có giá trị y dược nước giới Hình 1: Cây phát sinh chủng loại chủng vi nấm biển tuyển chọn xây dựng dựa trình tự gen vùng ITS theo phương pháp Neighbor Joining, boostrap 1000 lần phần mềm MEGA7 KẾT LUẬN Nghiên cứu cho thấy chủng vi nấm phân lập từ hải miên vịnh Nha Trang có khả sinh tổng hợp hoạt chất gây độc hiệu hai dòng tế bào ung thư cổ tử cung (Hela) ung thư vú (MCF-7) người Trong số 31 chủng vi nấm thể hoạt tính, 05 chủng 1901NT-1.2.2, 1901NT-1.39.3, 1901NT1.40.2, 1901NT-1.45.1, 1901NT-2.53.1 phân loài thuộc chi Aspergillus, Penicillium, Phoma Talaromyces Kết nghiên cứu sở để tiếp tục phân tách thu nhận hợp chất kháng ung thư từ cao chiết lên men chủng vi nấm có hoạt tính cao tuyển chọn Lời cảm ơn Cơng trình nghiên cứu tài trợ kinh phí từ đề tài KHCN cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam (Mã số VAST06.02/21-22) Nhóm tác giả trân trọng cảm ơn TS Ekaterina A Yurchenko (Viện Hóa sinh Hữu Thái Bình Dương, Phân Viện Viễn Đông, Viện Hàn lâm Khoa học Nga) hỗ trợ xác định hoạt tính sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO A Jemal, F Bray, M M Center, J Ferlay, E Ward, D Forman Global cancer statistics, CA: a cancer journal for clinicians, 2011, 61(2), 69-90 M Nigam, H A R Suleria, M H Farzaei, A P Mishra Marine anticancer drugs and their relevant 203 Luan van TCHH, 2021, 59(4E1,2) Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào… targets: a treasure from the ocean, DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 2019, 1-25 J W Blunt, A R Carroll, B R Copp, R A Davis, R A Keyzers, M R Prinsep Marine natural products, Natural product reports, 2018, 35(1), 8-53 P Singh, C Raghukumar, P Verma, Y Shouche Fungal community analysis in the deep-sea sediments of the Central Indian Basin by culture-independent approach, Microbial ecology, 2011, 61(3), 507-517 E Bovio, L Garzoli, A Poli, V Prigione, D Firsova, G McCormack, G Varese The culturable mycobiota associated with three Atlantic sponges, including two new species: Thelebolus balaustiformis and T spongiae, Fungal Systematics and Evolution, 2018, 1(1), 141-167 S P Banakar, L Karthik, Z Li, Mass Production of Natural Products from Microbes Derived from Sponges and Corals, in Symbiotic Microbiomes of Coral Reefs Sponges and Corals, 2019, Springer, 505-526 T S Suryanarayanan The diversity and importance of fungi associated with marine sponges, Botanica Marina, 2012, 55(6), 553-564 J W Blunt, B R Copp, R A Keyzers, M H Munro, M R Prinsep Marine natural products, Nat Prod Rep, 2015, 32(2), 116-211 I Marin, O Savinkin, T Britayev, D Pavlov Benthic fauna of the Bay of Nhatrang, southern Vietnam, Moscow: KMK Scientific Press, 2007, 235 10 D Handayani, R Ornando Rustini, Antimicrobial Activity Screening of Symbiotic Fungi from Marine Sponge Petrosia nigrans collected from South Coast of West Sumatera Indonesia, International Journal of Pharmacognosy and Phtochemical research, 2016, 8(4), 623-625 11 M P Sobolevskaya, E V Leshchenko, P T H Trinh, V A Denisenko, S A Dyshlovoy, N N Kirichuk, Y V Khudyakova, N Y Kim, D V Berdyshev, E A Pislyagin, A S Kuzmich, A V Gerasimenko, R S Popov, G V Amsberg, A S Antonov, S S Afiyatullov Pallidopenillines: Polyketides from the alga-derived fungus Penicillium thomii Maire KMM 4675, Journal of natural products, 2016, 79(12), 3031-3038 12 E G Lyakhova, S A Kolesnikova, A I Kalinovsky, D V Berdyshev, E A Pislyagin, A S Kuzmich, R S Popov, P S Dmitrenok, T N Makarieva , V A Stonik Lissodendoric Acids A and B, manzamine- 13 14 15 16 17 18 19 20 21 related alkaloids from the far eastern sponge Lissodendoryx florida, Organic letters, 2017, 19(19), 5320-5323 T J White, T Bruns, S Lee, J Taylor Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, PCR protocols: a guide to methods and applications, 1990, 18(1), 315-322 M A Artasasta, A D Yanwirasti, S Handayani Cytotoxic activity screening of ethyl acetate fungal extracts derived from the marine sponge Neopetrosia chaliniformis AR-01, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 2017, 7(12), 174-178 T Sajeevan Endophytic fungi isolated from the marine sponges as a source of potential bioactive compounds, Journal of Aquatic Biology & Fisheries, 2020, 8, 58-66 Y M Lee, H Li, J Hong, H Y Cho, K S Bae, M A Kim, D K Kim, J H Jung Bioactive metabolites from the sponge-derived fungus Aspergillus versicolor, Archives of pharmacal research, 2010, 33(2), 231-235 P Wang, J H Yu, K Zhu, Y Wang, Z Q Cheng, C S Jiang, J G Dai, J Wu, H Zhang Phenolic bisabolane sesquiterpenoids from a Thai mangrove endophytic fungus, Aspergillus sp xy02, Fitoterapia, 2018, 127, 322-327 J F Imhoff Natural products from marine fungi— Still an underrepresented resource, Marine drugs, 2016, 14(1), 19 H Shin, B K Choi, P T H Trinh, H S Lee, J Kang, T T T Van, H S Lee, J Lee, Y J Lee, J Lee Suppression of RANKL-Induced osteoclastogenesis by the metabolites from the marine fungus Aspergillus flocculosus isolated from a sponge Stylissa sp., Marine drugs, 2018, 16(1), 14 P T H Trinh, P Q Tien, N T D Ngoc, B M Ly, T T T Van Isolation and screening marine fungi with antimicrobial activity from samples collected in Nha Trang bay, Viet Nam, J Biotechnol., 2018, 16(1), 181-187 Phan Thị Hồi Trinh, Trần Thị Thanh Vân, Ngơ Thị Duy Ngọc, Cao Thị Thúy Hằng, Lê Thị Hoa, Đinh Thành Trung, Huỳnh Hồng Như Khánh, Lê Đình Hùng Đánh giá hoạt tính kháng sinh chống oxy hóa số chủng vi nấm phân lập vùng biển Nha Trang, Tạp chí sinh học, 2019, 41(2se1 & 2se2), 409-417 Liên hệ: Phan Thị Hoài Trinh Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Hùng Vương, Nha Trang, Khánh Hòa 65000, Việt Nam E-mail: phanhoaitrinh@nitra.vast.vn, Tel.: +84- 902793684 204 Luan van ... miên vùng biển Khánh Hòa Nội dung nghiên cứu: - Phân lập chủng vi nấm biển từ mẫu hải miên vùng biển Khánh Hòa - Sàng lọc hoạt tính kháng ung thư cao chiết lên men từ chủng vi nấm biển phân lập. .. phân lập từ hải miên vùng biển Khánh Hòa? ?? Mục tiêu nội dung nghiên cứu đề tài: Mục tiêu nghiên cứu: Sàng lọc tuyển chọn chủng vi nấm biển có khả sinh tổng hợp chất kháng ung thư phân lập từ hải miên. .. tìm kiếm chủng vi nấm liên kết với hải miên vùng biển Khánh Hịa có khả sinh tổng hợp chất kháng ung thư đánh giá cần thiết, góp phần khai thác hợp chất kháng ung thư đồng thời nâng cao giá trị