ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC BÙI THỊ YẾN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K KOCH) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC BÙI THỊ YẾN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: Bùi Thị Yến NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa : QH2015.Y Người hướng dẫn : PGS TS Đinh Đoàn Long ThS Phạm Thị Hồng Nhung Hà Nội – 2020 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, tơi may mắn nhận nhiều giúp đỡ quý báu vật chất, tinh thần thầy cô, bạn bè Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ kính trọng lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đinh Đoàn Long, ThS Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người trực tiếp hướng dẫn tơi, dạy tận tình suốt q trình thực nghiên cứu hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn Đỗ Thị Lệ Hằng, bạn Đỗ Hạnh Nguyên giúp đỡ, hỗ trợ tơi thực hành thí nghiệm Các thầy cô, bạn không trang bị cho kinh nghiệm kỹ chun mơn mà cịn truyền cho tơi tình u, lịng nhiệt huyết với nghiên cứu ln sẵn sàng giúp đỡ tơi gặp khó khăn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Y Dược học sở hết lòng quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi thực nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn cán Viện dược liệu - Bộ Y tế khơng quản ngại khó khăn thu thập cung cấp mẫu vật giúp đỡ thực đề tài cách thuận lợi Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, toàn thể thầy cô giáo Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội cho kiến thức quý báu trình học tập nhà trường Chúng trân trọng cảm ơn tài trợ kinh phí Bộ Khoa học Cơng nghệ Việt Nam cho đề tài mã số NVQG-2018/02 PGS.TS Đinh Đoàn Long chủ trì để thực nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn yêu thương đến gia đình, người thân bạn bè, người bên cổ vũ, động viên tạo điều kiện giúp đỡ thời gian học tập thực đề tài khóa luận Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2020 Tác giả Bùi Thị Yến DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT bp Cặp bazơ (base pair) DNA Deoxyribo Nucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide 5’ Triphosphate Genbank Ngân hàng liệu gen quốc tế H.helix Hedera helix L (Thường xuân) H.nepalensis Hedera nepalensis K.Koch (Dây thường xuân) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) ITS Vùng đệm mã (Internal transcribed spacer) Kit Thermo GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) ML Maximum Likelihood NCBI Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (National Center for Biotechnology Information) NJ Neighbor - Joining OD Mật độ quang học (Optical Density) PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) RNA Ribo Nucleic Acid UPGMA Unweighted PairGroup with Method using arthmetic Averages DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thông tin mẫu thực vật nghiên cứu 19 Bảng 3.1 Nồng độ OD260/280 DNA tổng số của mẫu nghiên cứu 24 Bảng 3.2.Thành phần chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân dịng đoạn gen ITS 27 Bảng 3.3 Các haplotype nghiên cứu .30 Bảng 3.4 Khoảng cách di truyền (phía bên trái) số lượng nucleotide sai khác (phía bên phải) 11 nhóm mẫu nghiên cứu H.nepalen sis (AJ131238.1), H.helix (AM503887.2), H sinensis (GU054623.1) Kalopanax septemlobus (MH711151.1) 31 Bảng 3.5 Vị trí nucleotide sai khác so sánh trình tự BioEdit 32 Bảng 3.6 Các trình tự tham chiếu Genbank .35 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc tổng qt vùng rDNA thực vật Hình 1.2 Dạng phát sinh lồi biết rõ nguồn gốc .11 Hình 1.3 Cây Dây thường xuân H nepalensis 13 Hình 1.4 Phân bố địa lý H nepalensis miền Bắc nước ta 14 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 21 Hình 2.2 Hiển thị kết giải trình tự qua phần mềm BioEdit 23 Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số số mẫu gel agarose 1,2 % .24 Hình 3.2 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi phản ứng nhân dòng gen ITS 26 Hình 3.3 Tối ưu nồng độ DNA phản ứng nhân dòng gen ITS 26 Hình 3.4 Tối ưu nồng độ mồi phản ứng nhân dịng gen ITS 27 Hình 3.5 Kết PCR nhân dòng gen ITS số mẫu 28 Hình 3.6 Kết hiển thị giải trình tự mẫu H1 qua phần mềm BioEdit 28 Hình 3.7 Kết so sánh BLAST mẫu H4 H nepalensis (AJ131238) 29 Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại xây dựng phương pháp UPGMA dựa thị phân tử ITS .35 Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại xây dựng phương pháp NJ dựa thị phân tử ITS 36 Hình 3.10 Cây phát sinh chủng loại xây dựng phương pháp ML dựa thị phân tử ITS 36 Hình 4.1 Phân bố địa lý haplotype Dây thường xuân tỉnh Lào Cai, Hà Giang, Lạng Sơn 46 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Đa dạng phân loại sinh học 1.1.1 Khái niệm đa dạng sinh học .3 1.1.2 Đa dạng di truyền .3 1.1.3 Thực trạng đa dạng sinh học Việt Nam 1.1.4 Các phương pháp phân loại học .4 1.2 Cơng cụ phân tích đa dạng di truyền tiến hóa .6 1.2.1 Tổng quan thị DNA .6 1.2.2 Các kỹ thuật chị DNA 1.2.3 Vùng đệm mã (Internal Transcribed Spacer - ITS) 1.2.4 Các phương pháp xây dựng phát sinh chủng loại 10 1.3 Tổng quan Dây thường xuân (Hedera nepalensis K Koch) 13 1.3.1 Phân loại học loài Hedera nepalensis K Koch 13 1.3.2 Đặc điểm hình thái phân bố địa lý .14 1.3.3 Giá trị y học 14 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 2.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.1.1 Vật liệu thực vật .19 2.1.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 20 2.1.3 Thiết bị 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu .21 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 21 2.2.2 Nhân dịng đoạn gen đích kỹ thuật PCR 22 2.2.3 Giải trình tự 22 2.3.4 Xử lý số liệu phân tích kết 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 i 3.1 Tách chiết DNA tổng số 24 3.2 Kết nhân dòng đoạn gen ITS phản ứng PCR 25 3.2.1 Kết phản ứng tối ưu 25 3.2.2 Kết nhân dòng gen ITS từ mẫu thực vật 28 3.3 Giải trình tự 28 3.4 Độ tương đồng trình tự gen ITS khuếch đại 29 3.5 Cây phát sinh chủng loại dựa vùng gen ITS 30 3.5.1 Lựa chọn mơ hình 30 3.5.2 Khoảng cách di truyền 30 3.5.3 Xây dựng chủng loại 35 CHƯƠNG BÀN LUẬN .37 4.1 Tách chiết DNA tổng số 37 4.2 Tối ưu quy trình nhân dịng gen ITS phản ứng PCR giải trình tự 38 4.3 Khoảng cách di truyền 40 4.5 So sánh phương pháp xây dựng phát sinh chủng loại 41 4.5.1 Phương pháp UPGMA 41 4.5.2 Phương pháp Neighbor- Joining 42 4.5.3 Phương pháp Maximum LikeLihood .42 4.6 Dự đoán bảo tồn chọn tạo giống 43 4.7 So sánh với phân tích hình thái học .44 4.8 Phân tích địa lý mẫu nghiên cứu .45 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 ii ĐẶT VẤN ĐỀ Trên giới nước ta xu hướng sử dụng dược liệu sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ thực vật ngày tăng cao Theo số liệu Tổ chức Y tế giới (WHO), khoảng 80% dân số nước phát triển có nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu liên quan đến y học cổ truyền [23] Trong gần 20 năm trở lại đây, ước tính có khoảng 40 - 50% thuốc đưa thị trường trực tiếp gián tiếp có nguồn gốc từ hợp chất thiên nhiên [25] Tại Mỹ, doanh số bán thực phẩm chức có nguồn gốc từ thực vật tăng 8,5%, đạt tổng doanh thu khoảng tỷ USD năm 2017 [51] Cây dược liệu coi kho tàng vô giá cung cấp hợp chất sinh học phục vụ nghiên cứu phát triển thuốc, thành phần thiếu ngành dược liệu, góp phần phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng, nâng cao đời sống phát triển kinh tế - xã hội [23] Đây lý ngày có nhiều lồi thuốc đầu tư nghiên cứu, mở rộng quy mô sản xuất để phát triển thành sản phẩm chất lượng đáp ứng cho thị trường [23] Họ Nhân Sâm (Araliaceae) thực vật cung cấp nhiều thuốc quý, dân gian sử dụng lâu đời Tuy nhiên, loài chi Hedera họ cịn biết đến Việt Nam Trong chi này, Thường xuân (Hedera helix) Dây thường xuân (Hedera nepalensis) hai loài nghiên cứu nhiều [19] Ở châu Âu, Thường xuân sử dụng từ lâu đời, sản phẩm tiếng khắp giới siro ho Prospan® Cơng ty Engelhard Arzneimitel GmbH&Co.KG (Cộng hòa Liên bang Đức) Ở Việt Nam, Thường xuân địa Dây thường xuân ghi nhận phân bố nhiều vùng núi cao miền Bắc hai lồi có hình thái dễ nhầm lẫn Một số nghiên cứu dược lý ghi nhận Dây thường xuân có nhiều tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, hạ đường huyết, giảm đau, kháng viêm…[32, 39, 43, 57] Mặc dù có tiềm dược lý vậy, song nghiên cứu Dây thường xuân Việt Nam hạn chế, đặc biệt nghiên cứu đa dạng di truyền Khai thác dược liệu q mức, khơng có định hướng kiểm sốt chặt chẽ đe dọa trực tiếp đến nguồn tài ngun thuốc nước ta Do đó, cơng tác bảo tồn đa dạng sinh học, nguồn gen quý mối quan tâm hàng đầu nhà quản lý Nhà nước Đánh giá mức độ đa dạng di truyền nguồn gen thuốc kết hợp với phân tích thành phần hóa học giống cho phép chọn lọc giống sản xuất hiệu hợp chất quan tâm Qua đó, thơng tin nguồn gen giúp đưa chiến lược bảo tồn phát triển thuốc tiềm cách hiệu bền vững Hiện nay, thị DNA trở thành công cụ hỗ trợ đắc lực cho nghiên cứu phân loại, phân tích đa dạng sinh học Nó giúp xác định khoảng cách di truyền đặc trưng cấp độ cá thể, quần thể phục vụ bảo tồn chọn giống [14, 26, 38] Vùng đệm mã (Internal Transcribed Spacer, viết tắt ITS) thị phân loại tốt thực vật Song ITS có phải thị tốt để đánh giá mức độ đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân Việt Nam hay không? Để tìm lời giải cho câu hỏi chúng tơi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân (Hedera nepalensis K Koch) Việt Nam dựa thị ITS” với hai mục tiêu: Xây dựng quy trình tối ưu nhân dịng vùng gen ITS Dây thường xuân Định danh khoa học mẫu Dây thường xuân thu thập Việt Nam thông qua xây dựng phát sinh loài dựa thị phân tử ITS Để thực mục tiêu nghiên cứu trên, tiến hành nội dung nghiên cứu sau: Tách chiết DNA tổng số 45 mẫu Dây thường xuân Tối ưu quy trình nhân dịng gen ITS với cặp mồi đặc hiệu Nhân dòng gen ITS kỹ thuật PCR giải trình tự gen Phân tích số liệu thu xây dựng phát sinh chủng loại nhiên xuất “cụm lân cận” tức là, hai trình tự gọi lân cận (gần nhau) cây, chúng có nút 1.2.3.2 Phương pháp Tiết kiệm tối đa (Maximum Parisimony) Dựa nguyên tắc sinh học “đột biến xảy ra” Thuật toán cho rằng: Cây tiến hóa phù hợp có đột biến thấp tất tiến hóa taxon phân tích Do vậy, tiến hóa thu từ phương pháp gọi tích phân tiến hóa tối ưu [10] Chỉ số tin cậy cho nhánh gọi giá trị tin cậy (bootstrap), nhánh coi có độ tin cậy giá trị đạt 70% [33] Ưu điểm phương pháp tốc độ tính tốn nhanh cho khách quan Phương pháp không đưa giả định q trình tiến hóa, mà dựa nguyên lý giản tiện tối đa: Cây tốt chọn dựa vào việc giảm thiểu hóa số lượng vị trí thay cần thiết để giải thích cho vị trí mang thơng tin 1.2.3.4 Phương pháp Xác suất tối đa (Maximum Likelihood) Đây phương pháp xác suất [10, 60] túy thường dùng để kiểm chứng lại tiến hóa xây dựng phương pháp khác Phương pháp đánh giá giả thiết tiến hóa xây dựng tất tiến hóa có khả xảy Tiếp theo, xác định tiến hóa nội suy có xác suất xảy cao qua việc phân tích yếu tố tiến hóa Chẳng hạn, đại thể tần số đột biến đồng hoán cao khoảng lần so với đột biến dị hoán [10] Đây coi phương pháp cung cấp thơng tin xác chi tiết so với phương pháp khác Nhưng thực tế, tốc độ xử lí thơng tin theo phương pháp chậm khơng khả thi phân tích lượng liệu lớn Phương pháp cho tiến hóa có độ tin cậy giá trị độ tin cậy (bootstrap) đạt 70% nhánh [33] Thông thường nghiên cứu tiến hành dựa nhiều phương pháp khác nhau, kết nghiên cứu tốt tiến hóa xây dựng từ nhiều phương pháp cho cấu trúc tương đồng Trong nghiên cứu sử dụng ba phương pháp là: Tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony), hợp lý tối đa (Maximum Likelihood) phương pháp ma trận khoảng cách với thuật toán UPGMA phần mềm MEGA X 12 1.3 Tổng quan Dây thường xuân (Hedera nepalensis K Koch) 1.3.1 Phân loại học loài Hedera nepalensis K Koch Vị trí chi Hedera hệ thống phân loại thực vật sau: Ngành Ngọc lan Magnoliophyta Lớp Ngọc lan Magnoliopsida Phân lớp Hoa hồng Rosidae Bộ Hoa tán Apiales Họ Nhân sâm Araliaceae Chi Hedera Loài Hedera nepalenis K Koch Đặc điểm hình thái chung chi Hedera: Theo nghiên cứu gần đây, chi Hedera bao gồm 16 loài [19] khác phân bố châu Âu, Bắc Phi, Macaronesia châu Á Trong họ Nhân sâm (Araliaceae), chi Hedera (L.) chi đại diện có đặc điểm hình thái dạng dây leo Chúng leo thường xanh có nhiều rễ móc khí sinh, nhẵn khơng có gai Lá mọc so le, đơn khơng có kèm, phiến phân thùy, dài từ – 10 cm, rộng từ - cm, gân chân vịt Cụm hoa chùy, gồm nhiều tán, có lơng Hoa nhỏ, màu vàng trắng lục trắng; bắc nhỏ, dài có nhỏ; tràng 5, gốc rộng, có mào giữa; nhị 5; bầu Quả hạch trịn, chín có màu đen [1, 3, 5] H nepalnensis lồi có dây bị dài lên tới 20 m, có nhiều rễ mọc khí sinh mắt, đơn, cụm hoa có lơng đỏ nâu, mọc rải rác rừng thưa; phổ biến độ cao 1000 – 3000 m [1, 2] Hình 1.3 Cây Dây thường xuân H nepalensis [61] 13 1.3.2 Đặc điểm hình thái phân bố địa lý Theo nghiên cứu phát sinh chủng lồi cho thấy Châu Á trung tâm xuất xứ chi Hedera, sau lồi thuộc chi phát tán đến Châu Âu vùng Địa Trung Hải Ngày nay, loài thuộc chi Hedera phân bố chủ yếu vùng ôn đới cận nhiệt đới Châu Âu số vùng Châu Á với nhiệt trung bình tương đối mát từ 26 – 30oC cần độ ẩm cao [7] Hai loài đến sử dụng rộng rãi nghiên cứu nhiều dược học Thường xuân (H helix) Dây thường xuân (H nepalensis) có phạm vi phân bố tương đối hẹp giới Theo thống kê Viện Dược liệu Việt Nam có trữ lượng lớn Dây thường xuân phân bố chủ yếu tỉnh miền phía Bắc nước ta Sơn La, Lào Cai, Hịa Bình, Lai Châu, Hà Giang… (Hình 1.3) Hình 1.4 Phân bố địa lý H nepalensis miền Bắc nước ta 1.3.3 Giá trị y học 1.3.3.1 Nghiên cứu dược lý giới Tác dụng chống ung thư Năm 2015, Laila cộng thực nghiên cứu ống nghiệm: Phân tích tác dụng ức chế gây độc dòng tế bào ung thư phân đoạn dịch chiết H nepalensis Thí nghiệm sử dụng 05 mẫu thử chiết xuất thô (HNC), phân đoạn n-hexane (HNN), phân đoạn ethyl acetate (HNE), phần dịch chiết lại (HNA) Lupeol Các phân đoạn tiến hành xét nghiệm 14 Nitrate, xét nghiệm NFκB, xét nghiệm aromatase xét nghiệm quinone reductase (QR1) Tiềm gây độc tế bào đánh giá dòng tế bào ung thư MCF-7, MDA-MB-231, Hela với xét nghiệm sulforhodamine B (SKB) Kết phân tích chiết xuất thô phần phân đoạn H nepalensis có khả ức chế tăng trưởng (hơn 60%) ba dòng tế bào ung thư Cụ thể chất lupeol phân lập từ n-hexane, ethyl acetate có giá trị IC50 thay đổi đa dạng 2,32 – 10,2 μM; ức chế 84,78% sản xuất oxid nitric (50 μM) với giá trị IC50 2,1 ± 1,3 μM Đồng thời, lượng lupeol đánh giá HPLC đầu dị DAD mơ khác (rễ, thân, lá) chứng minh H.nepalensis nguồn lupeol phong phú (0,196 mg/100 mg trọng lượng khô) Báo cáo báo cáo đưa tiềm H nepalensis chứa tác nhân hóa trị ung thư gây độc tế bào [35] Các phân tích dược lý T Li cộng (2015) thực chứng minh saponin từ H nepalensis K Koch có tác dụng chống ung thư thông qua việc gây chết theo chu trình tế bào ung thư ống nghiệm Họ tìm thấy chiết xuất ethanol 95% từ H nepalensis K Koch ức chế phát triển dòng tế bào ung thư phổi tế bào nhỏ người A549 (28,39 ± 4,36 μg/ml) Hai hợp chất chống ung thư pulsatilla saponin A hederagenin 3- O -α-L-arabinopyranoside (phân lập từ chiết xuất ethanol 95% H nepalensis K Koch) dựa khả ức chế phát triển tế bào A549 ống nghiệm Các hoạt động ức chế tăng trưởng pulsatilla saponin A thông qua việc gây chết theo chu trình cho tế bào A549 báo cáo trước người khác Tuy nhiên, hoạt động ức chế tăng trưởng tế bào A549 hederagenin 3- O -α-L-arabinopyranoside, hành động gây apoptosis chưa báo cáo trước Những kết giúp phát triển hướng trị liệu tương lai chống ung thư phổi tế bào nhỏ từ H nepalensis K Koch [43] Một nghiên cứu Qamar cộng (2019), tác giả nỗ lực thực thí nghiệm để sàng lọc số thuốc khám phá trước Tổng cộng 10 thuốc thuộc họ, chi khác sử dụng, có H nepalensis Thí nghiệm chứng minh thuốc lựa chọn có hoạt tính chống ung thư mạnh với giá trị gây độc tế bào tối thiểu (IC50 > μM) độc tính thấp khơng đáng kể Theo đó, thuốc đánh giá gây độc tế bào phụ thuộc vào liều thông qua xét nghiệm MTT ống nghiệm mơ hình 15 khối u động vật (IC50 khoảng 0,009 - 0,528 mg/mL) Các phát có khả ức chế phát triển khối u cách nhắm vào mục tiêu phân tử chống tăng sinh, prooptotic, chống di chống angiogen Chúng sử dụng rộng rãi tính có sẵn, giá phải tác dụng phụ tối thiểu [46] Tác dụng chống oxi hóa Nghiên cứu thiết kế để xác định hợp chất polyphenolic (có tác dụng chống oxy hóa) phân đoạn H nepalensis thực Laila Jafri cộng (2014) Các mẫu nghiên cứu bao gồm: chiết xuất thô H nepalensis phần phân đoạn thu dung môi n -hexane, ethyl acetate nước Khả chống oxy hóa H nepalensis đánh giá cách đo khả loại bỏ nhóm hydro peroxide (H2O2) Tất phân đoạn dịch chiết cho thấy tiềm loại bỏ hydro peroxide đáng kể ( P < 0,05) với giá trị IC50 từ 31,19 đến 200 g/mL Trong đó, phần ethyl acetate cho thấy hoạt tính chống oxy hóa cao phương pháp phosphomolybdenum, sau n -hexane, chiết xuất thơ phần nước Nghiên cứu chứng cho thấy phần ethyl acetate H nepalensis có tiềm chống oxy hóa với hàm lượng phenolic flavonoid cao [36] Một nghiên cứu khác xác định tiềm chống oxy hóa dịch chiết methanol H nepalensis thử môi trường nước lipid Trong môi trường nước, nghiên cứu sử dụng xét nghiệm dọn gốc tự DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl) ABTS (2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) Trong đó, mơi trường lipid đánh giá khả chống oxy hóa đánh giá số hóa (TBARS – Thiobarbituric Acid Reactive Substances) Cơ chế dọn gốc tự dung dịch có chứa nồng độ chất tự xác định làm giảm màu dung dịch; sau đo độ hấp thụ quang bước sóng thích hợp Kết nghiên cứu đưa hàm lượng gốc DPPH, ABTS, TBARS 26,7 ± 0,2 (mM TE/g); 54,7 ± 1,6 (mmol TE/g); 393 ± 3,4 (mmol TE/g) Nghiên cứu xác định dịch chiết chiết thô H nepalensis chứa hai chất có khả chống oxy hóa axit chlorogen rutin [43] Tác dụng chống tiểu đường Samreen Saleem cộng (2014) nghiên cứu chất có khả ức chế DPP-4 lồi Fagonia cretica H nepalensis có tác dụng điều trị tiểu đường Các mẫu thử bao gồm chiết xuất thô H nepalensis, phân đoạn 16 dung môi hexane, ethyl acetate nước Tất phần có tác dụng ức chế hoạt động DPP-4 (DPP-4 biết đến làm bất hoạt hai hormone incretin gọi peptide giống glucagon (GLP-1) polypeptide phụ thuộc glucose (GIP)) Triterpenoid lupeol tìm thấy từ H nepalensis với IC50 31,6 μM Các hợp chất flavonoid báo cáo chất ức chế hiệu DPP-4 cải thiện tình trạng đường huyết mơ hình động vật Tác dụng giải thích đặc tính chống oxy hóa flavonoid nên chúng có khả chống tiểu đường ngày có nhiều chứng cho thấy ức chế DPP-4 chế hoạt động hợp lý [17, 49] Waleed Javed Hashmi cộng (2018) sử dụng chiết xuất thô H nepalensis (HNC) chuột Kết cho thấy làm giảm đáng kể mức đường huyết (phụ thuộc thời gian) dấu hiệu chức gan phục hồi mức bình thường tăng cao đáng kể (P < 0,05) HNC làm gia tăng mức độ men catalase (CAT), superoxide effutase (SOD) giảm glutathione (GSH) Ngoài ra, định lượng HPLC cho thấy điều trị HNC dẫn đến gia tăng đáng kể (p < 0,001) mức độ dẫn truyền thần kinh (dopamine serotonin) so với nhóm kiểm sốt Alzheimer (AC) Nhìn chung, kết nghiên cứu cho thấy H nepalensis có tiềm điều trị điều trị bệnh Alzheimer tiểu đường [57] Tác dụng giảm đau Phản ứng đau thử nghiệm hiệu thuốc giảm đau cách quan sát phản ứng với đau nhiệt thực thông qua thử nghiệm Hot Plate H nepalensis cho thấy khả giảm đau vừa phải 59,1% so với morphine 80% [34] Các polyphenol có mặt cho có vai trị hoạt động giảm đau Cơ chế phản ứng đặc trưng giải phóng chất trung gian giảm đau nội sinh cyclooxygenase hay arachidonic Tác dụng kháng viêm Trong thử nghiệm chống viêm, chiết xuất thô cho thấy ức chế phù nề đáng kể, phụ thuộc vào liều sử dụng Xét nghiệm carrageenan sử dụng để đánh giá khả chống viêm thuốc H nepalensis báo cáo có khả ức chế phù nề lên đến 63,3 %, P < 0,05 có ý nghĩa thống kê Cơ chế tác dụng chống viêm cho thuốc chứa hoạt tính có khả ức chế đáng kể chất trung gian gây viêm serotonin, histamine, bradykinin… Các tác giả tiếp tục làm xét nghiệm histamine để đánh giá xác nhận lại thí 17 nghiệm carrageenan với nồng độ hiệu 200 mg/kg Sự ức chế phù tối đa phát 90 phút H nepalensis cho kết ức chế trung bình mức 63,5 % (P < 0,01), cho thấy khả kháng viêm đáng kể histamine gây [34] Ngoài ra, nghiên cứu vài tác dụng khác H nepalensis cần đánh giá nghiên cứu thêm tác dụng chống trầm cảm, chống đông máu [34], tác dụng hạ huyết áp …[49] mở tiềm nghiên cứu phát triển thuốc từ H nepalensis lớn 1.3.3.1 Nghiên cứu dược lý nước Ở Việt Nam, nhìn chung nghiên cứu Dây thường xuân cịn hạn chế Đã có vài nghiên cứu nông – sinh học nhân trồng Viện Dược liệu ghi nhận Dây thường xuân hay có tên khác Bách cước ngơ cơng [7] phân bố Sơn La, Lào Cai, Hịa Bình, Lai Châu, Hà Giang bước đầu xác định Hedera nepalensis K.Koch Nghiên cứu để xác định đặc điểm sinh thái khả nhân giống Hedera nepalensis K.Koch Theo đó, lồi có dây bị tới 20 m, có nhiều rễ mọc khí sinh mắt, đơn, cụm hoa có lơng đỏ nâu, mọc rải rác rừng thưa, độ cao 100 – 1600 m Về công dụng: Thân, lá, hạt uống với rượu ấm giải ngộ độc Hạt ngâm rượu chữa bệnh phong huyết, đau lưng Còn dùng trị viêm khớp, viêm gan, đau đầu, nôn máu, mắt mờ, nhọt độc sưng đau Lá hơ nóng chườm chữa sưng hạch Quả hãm uống trị thấp khớp [1, 5, 12] Theo y học cổ truyền Bộ phận dùng: tất phận (rễ, thân, lá, quả) dùng tươi phơi khơ Tính vị: Dây thường xn có vị đắng, tính mát, tác dụng khu phong, giải độc, hoạt huyết, tiêu sưng Quả có vị ngọt, tính ấm dùng để trừ phong huyết [7] Cơng dụng: Lấy dây thường xuân giã nhỏ chế với rượu sau gạn lấy dịch uống, phần bã cịn lại đem đắp vào chỗ sưng đau Trường hợp bị phong thấp hay mụn lở lấy thân rễ ngâm rượu uống sắc Ngoài ra, Dây thường xuân đem ngâm rượu thuốc sắc có cơng dụng chữa huyết bế bụng, giảm đau lưng, mỏi gối người già [7] Dây thường xuân loại thơng thường có chứa hợp chất chất làm loãng dịch nhầy làm cho dễ long đờm Nó thường kết hợp với nguyên liệu như: cỏ xạ hương hoa anh thảo để làm dịu ho 18 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu thực vật 45 mẫu thường xuân, 44 mẫu thu thập từ tỉnh khắp Việt Nam; 01 mẫu thu thập từ vườn thực vật Hoa Nam, Trung Quốc Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu (Bộ Y tế) cung cấp (Bảng 2.1) Các mẫu nhận phịng thí nghiệm sấy khô đựng túi nilon chứa silicagel bảo quản nhiệt độ phịng Sau nghiền mịn nitơ lỏng chia vào ống eppendorf 1,5 mL bảo quản -30 ºC đến sử dụng tách chiết DNA tổng số Bảng 2.1 Thông tin mẫu thực vật nghiên cứu STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Ký hiệu mẫu H1* H2* H3** H4* H5* H6* H9* H13* H14* HH** H16* H17* H18* H19* H20* H21* H22* H23* H24* H25* H26* H27* H28* H29* H30* H31* Địa điểm lấy mẫu (huyện, tỉnh) Sa Pa, Lào Cai Sa Pa, Lào Cai Sa Pa, Lào Cai Hồng Su Phì, Hà Giang Sa Pa, Lào Cai Sa Pa, Lào Cai Sa Pa, Lào Cai Sa Pa, Lào Cai Sa Pa, Lào Cai Vườn TV Hoa Nam, TQ Đồng Văn, Hà Giang Đồng Văn, Hà Giang Đồng Văn, Hà Giang Đồng Văn, Hà Giang Đồng Văn, Hà Giang Đồng Văn, Hà Giang Đồng Văn, Hà Giang Đồng Văn, Hà Giang Đồng Văn, Hà Giang Đồng Văn, Hà Giang Đồng Văn, Hà Giang Hồng Su Phì, Hà Giang Hồng Su Phì, Hà Giang Xín Mần, Hà Giang Xín Mần, Hà Giang Hồng Su Phì, Hà Giang 19 Tọa độ lấy mẫu 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E 22°21'10.29"N - 103°51'36.04"E 22°39'28.47"N - 104°35'57.14"E 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E 22°22'59.25"N - 103°47'6.49"E 22°23'0.01"N - 103°47'9.97"E 22°23'0.01"N - 103°47'9.97"E 23°11'12"N - 113°21'51"E 23°14'49.81"N - 105°11'36.53"E 23°14'46.36"N - 105°11'30.49"E 23°15'01.61"N - 105°11'24.46"E 23°15'48.33"N - 105°09'56.85"E 23°15'20.97"N - 105°10'29.61"E 23°14'39.08"N - 105°12'48.68"E 23°14'38.03"N - 105°12'52.79"E 23°14'37.25"N - 105°47'6.49"E 23°12'49.49"N - 103°47'6.49"E 23°13'00.07"N - 105°10'31.06"E 23°14'39.08"N - 105°10'38.25"E 22°39'18.38"N - 104°35'45.13"E 22°39'43.50"N - 104°36'11.35"E 22°38'51.74"N - 104°35'05.68"E 22°39'01.08"N - 104°35'31.20"E 22°40'11.06"N - 104°36'11.85"E 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 H32* H33* H34* H35* H37* H38* H40* H41* H42* H43* H44* H45* H46* H47* H48** H49* H50* H51* H52** Hồng Su Phì, Hà Giang Hồng Su Phì, Hà Giang Hồng Su Phì, Hà Giang Đồng Văn, Hà Giang Đồng Văn, Hà Giang Hồng Su Phì, Hà Giang Đồng Văn, Hà Giang Hồng Su Phì, Hà Giang Hồng Su Phì, Hà Giang Hồng Su Phì, Hà Giang Hồng Su Phì, Hà Giang Sa Pa, Lào Cai Sa Pa, Lào Cai Sa Pa, Lào Cai Sa Pa, Lào Cai Lộc Bình, Lạng Sơn Lộc Bình, Lạng Sơn Lộc Bình, Lạng Sơn Đà Lạt, Lâm Đồng 22°39'28.47"N - 104°35'57.14"E 22°40'08.44"N - 104°36'17.29"E 22°40'00.73"N - 104°36'19.57"E 23°14'47.62"N - 105°12'43.66"E 23°14'47.62"N - 105°12'43.66"E 22°39'31.37"N - 104°36'11.12"E 23°14'47.62"N - 105°12'43.66"E 22°39'31.37"N - 104°36'11.12"E 22°39'31.37"N - 104°36'11.12"E 22°40'04.61"N - 104°35'59.54"E 22°40'04.61"N - 104°35'59.54"E 22°22'59.25"N - 103°47'6.49"E 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E 22°22'51.15"N - 103°47'45.99"E 22°21'10.29"N - 103°51'36.04"E 21°50'56.21"N - 106°55'4.78"E 21°50'53.03"N - 106°55'4.96"E 21°50'51.63"N - 106°55'2.76"E 11°56'11.56"N - 108°27'28.12"E Ghi phân loại hình thái: * - H nepalensis; ** - H helix 2.1.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu Tách DNA tổng số: Bộ kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini (Thermo Scientific, Mỹ) Nhân dịng đoạn gen đích ITS: Cặp mồi 17SE (5’ACG AAT TCA TGG TCC GGT GAA GTG TTC3’) 28SE (5’ TAG AAT TCC CCG GTT CGC TCG CCG TTA C3’) đặt tổng hợp từ công ty Phusa Biochem (Việt Nam), 5X Buffer, dNTP mix (Thermo Scientific), Phusion DNA Polymerase (Thermo Scientific), nước khử ion Điện di: Gel Agarose, 5X DNA loading dye (Lonza), GeneRuler 100bp DNA Ladder (Thermo Scientific), Lambda DNA/HindIII Ladder (Thermo Scientific) 2.1.3 Thiết bị Các trang thiết bị dụng cụ thí nghiệm tiến hành Phịng thí nghiệm mơn Y Dược học sở - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Các thiết bị bao gồm: Cân phân tích, Máy quang phổ NP80 (Nanophotometer, Đức), Máy chụp ảnh gel (Gel Doc It, Mỹ), Hệ thống điện di (Cleaver Scientific Ltd, Anh), Bể ổn nhiệt, Máy lắc VELP (Scientifica, Đức), Tủ ấm (Panasonic, Nhật Bản), Tủ lạnh âm sâu -30oC (Panasonic, Nhật Bản), Tủ mát 4oC (FRIMED, Nhật Bản) 20 Máy PCR (Prime Thermal Cycler, Anh), Tủ an toàn sinh học (ESCO, Singapore), Máy li tâm EBA 21 (Hettich Zentrifugen, Đức) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Quy trình nghiên cứu tiến hành theo sơ đồ Hình 2.1 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số tách chiết từ mẫu khô nghiền thành bột mịn nitơ lỏng, sử dung kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) Bộ kit sử dụng công nghệ màng silica dạng cột quay thuận tiện, không độc hại tiết kiệm thời gian, tách chiết DNA có kích thước lên đến 30 kb Quy trình tách chiết thực theo khuyến cáo hãng (Phụ lục 1) 21 Kiểm tra định lượng DNA DNA tổng số sau tách chiết kiểm tra có mặt cách điện di gel agarose 1,2 % với hiệu điện 100 V, 500 mA khoảng thời gian 40 phút đệm TAE 1X Chúng tơi sử dụng tỉ lệ µL mẫu µL DYE 5X Định lượng nồng độ DNA độ tinh cách đo số OD260/280 (tỷ lệ hấp thụ quang DNA bước sóng 260 nm so với độ hấp thụ quang bước sóng 280 nm) máy quang phổ NP80 Mỗi mẫu DNA tổng số đo 02 lần lấy giá trị trung bình 02 lần đo Nồng độ DNA thu cao giá trị OD260/280 nằm khoảng 1,8 – 2,0 coi DNA tách chiết có độ tinh cao 2.2.2 Nhân dịng đoạn gen đích kỹ thuật PCR Để tìm quy trình nhân dòng đặc hiệu ổn định cho mẫu q trình PCR, chúng tơi tiến hành loại phản ứng tối ưu: Tối ưu nhiệt độ, tối ưu nồng độ DNA tối ưu nồng độ mồi Các phản ứng có đối chứng âm ống phản ứng không bổ sung DNA khuôn để loại bỏ khả bị nhiễm mẫu trình thao tác Đối chứng dương mẫu DNA Dây thường xuân khuếch đại thành công đoạn gen GBSSI (mẫu H3) Chúng tơi sử dụng enzyme Phusion Hight-Fidelity DNA Polymerase có hiệu suất cao Taq thông thường đến 52 lần, giảm thiểu thời gian phản ứng PCR Enzyme cho hiệu suất cao với phản ứng có chứa DNA có nhiều sản phẩm thứ cấp DNA tổng số có nguồn gốc thực vật Mỗi phản ứng PCR bao gồm 25 μL bao gồm 5x buffer, dNTP 2M, Phusion DNA polymerase, mồi 17SE/28SE, nước khử ion DNA khn Phản ứng nhân dịng gen ITS tiến hành máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700, Mỹ) Kiểm tra sản phẩm PCR: Điện di Gel agarose 1,5% điều kiện 100 V, 500 mA với thời gian 45 phút đệm TAE 1x, sử dụng thang chuẩn GeneRuler 100 bp DNA Ladder để xác định kích thước Ảnh điện di chụp máy soi Gel Doc (Mỹ) 2.2.3 Giải trình tự Chúng tơi tiến hành đóng gói sản phẩm phản ứng PCR ống eppendorf 1,5 mL, thể tích khoảng 20 μL gửi hãng First Base (Malaysia) để tinh giải trình tự theo 01 chiều mồi xi 17SE Kết giải trình tự sau nhận hiển thị thơng qua phần mềm BioEdit ver 7.2.6.1 Chromas pro 2.1.6, qua xác định kiểu gen mẫu nghiên cứu Cách đọc kết quả: 04 nucleotide 22 thể 04 màu khác (G: màu đen, T: màu đỏ, C: màu xanh dương, A: màu xanh cây) Hình 2.2 Hiển thị kết giải trình tự qua phần mềm BioEdit 2.3.4 Xử lý số liệu phân tích kết Tải FULL (65 trang): https://bit.ly/3S4UrzD Dự phịng: fb.com/TaiHo123doc.net Sau thu trình tự đoạn gen ITS mẫu cần quan tâm, chúng tơi tiến hành chỉnh sửa, lắp ghép đoạn trình tự phần mềm Sequencher ver 5.4.6 cắt bỏ đoạn trình tự bị nhiễu (thường đoạn đầu đoạn cuối) Tiếp theo trình tự sử dụng để so sánh với mẫu có sẵn ngân hàng Genbank thông qua https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi để xem xét tương đồng Kết hợp giữ mẫu thu với trình tự có sẵn ngân hàng Genbank, tiến hành xây dựng phát sinh chủng loại nhiều phương pháp khác (UPGMA, Maximum likelihood, Neiber- Joining) thông qua phần mềm MEGA phiên X với giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại Dựa kết thu từ phát sinh, tiến hành định danh nguồn gen Dây thường xuân dựa theo phân nhánh với trình tự lựa chọn tham chiếu 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số 45 mẫu tách chiết theo Kit Thermo, sau điện di gel agarose 1,2 % Kết bước đầu ghi nhận thông qua điện di sau: Tất mẫu quan sát băng DNA tổng số với kích thước tương ứng khoảng 23,1 kb marker, băng rõ rét chứng tỏ DNA thu có nồng độ cao, đứt gãy đủ điều kiện để thực thí nghiệm Băng điện di DNA tổng số số mẫu thực vật thể Hình 3.1 Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số số mẫu gel agarose 1,2 % Làn M: Lamda DNA/HindIII marker Làn 01-19: mẫu DNA tổng số thu mẫu thực vật có ký hiệu tương ứng Làn (-): Đối chứng âm Định lượng đo độ tinh DNA tổng số mẫu khơ cho kết quả: Nồng độ DNA trung bình đạt 12,23 ng/μL ± 4,28; số hấp thụ quang đo bước sóng 260 280 nm có giá trị trung bình 2,00 ± 0,80 Số liệu chi tiết thống kê Tải FULL (65 trang): https://bit.ly/3S4UrzD Bảng 3.1 Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net Bảng 3.1 Nồng độ OD260/280 DNA tổng số của mẫu nghiên cứu STT Ký hiệu mẫu Nồng độ trung bình (ng/µL) OD260/280 trung bình H1 6,15 2,016 H2 11,70 2,071 H3 7,75 2,214 H4 11,20 2,154 H5 12,35 2,148 H6 4,10 1,952 H9 12,75 2,125 H13 16,60 2,049 H14 21,05 2,024 10 HH 9,20 1,806 11 H16 10,7 1,372 12 H17 12,05 1,700 13 H18 6,35 2,702 24 14 H19 5,50 1,964 15 H20 11,65 1,371 16 H21 15,30 1,672 17 H22 12,00 1,446 18 H23 7,45 2,569 19 H24 15,00 2,128 20 H25 14,55 1,441 21 H26 11,90 2,088 22 H27 12,85 2,295 23 H28 11,45 1,991 24 H29 8,75 2,303 25 H30 15,15 1,870 26 H31 19,35 1,548 27 H32 18,85 1,508 28 H33 7,55 1,325 29 H34 12,55 1,540 30 H35 9,15 1,289 31 H37 10,20 1,299 32 H38 14,50 1,480 33 H40 5,60 1,750 34 H41 7,95 1,574 35 H42 7,15 1,644 36 H43 8,65 1,730 37 H44 10,75 1,667 38 H45 11,30 2,825 39 H46 15,70 2,635 40 H47 13,40 3,526 41 H48 17,25 3,017 42 H49 18,30 3,021 43 H50 18,70 3,041 44 H51 17,70 2,565 45 H52 22,25 2,392 12,23 ± 4,28 1,997 ± 0,80 Trung bình 3.2 Kết nhân dòng đoạn gen ITS phản ứng PCR 3.2.1 Kết phản ứng tối ưu Chúng tiến hành tối ưu thành phần phản ứng nhân dòng đoạn gen ITS nhiệt độ gắn mồi, nồng độ DNA, nồng độ mồi, để đảm bảo có quy trình nhân dịng gen đặc hiệu ổn định 25 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi Phản ứng tối ưu nhiệt độ gắn mồi phản ứng quan trọng định hiệu suất PCR Chúng tiến hành PCR với nhiệt độ xung quanh nhiệt độ gắn mồi tham khảo cho gen ITS Kết điện di gel agarose 1,5% cho thấy: Ở dải nhiệt độ từ 43,9 – 62,1 ºC xuất băng điện di đặc hiệu, có độ sáng tăng dần, đặc biệt từ 55,1 – 62,1 ºC băng sáng đều, rõ nét, đặc hiệu Để phản ứng PCR không bị ảnh hưởng nhiệt độ cao, chúng tơi lựa chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng nhân dịng gen ITS 55,1ºC (Hình 3.2) Hình 3.2 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi phản ứng nhân dòng gen ITS; Làn M: Thang chuẩn Gene Ruler 100 bp; Ký hiệu làn: nhiệt độ gắn mồi (ºC); Làn (-): Đối chứng âm; Làn (+): Đối chứng dương Tối ưu nồng độ DNA Chúng lựa chọn dải nồng độ DNA theo cấp sô nhân: 0,75; 1,25; 2,5; 5; 10; 20 ng/µL Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5% Theo đó, dải nồng độ chọn, băng lên đặc hiệu, sáng rõ, riêng nồng độ ng/µL cho băng sáng rõ nét Do chúng tơi lựa chọn ng/µL nồng độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng nhân dòng gen ITS (Hình 3.3) Hình 3.3 Tối ưu nồng độ DNA phản ứng nhân dòng gen ITS; Làn M: Thang chuẩn Gene Ruler 100 bp; Ký hiệu làn:nồng độ DNA (ng/µL); Làn (-): Đối chứng âm; Làn (+): Đối chứng dương 26 8313481 ... đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xn Việt Nam hay khơng? Để tìm lời giải cho câu hỏi lựa chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân (Hedera nepalensis K Koch) Việt. .. 1.1.2 Đa dạng di truyền Đa dạng di truyền hay gọi đa dạng nguồn gen phần đa dạng sinh học Đa dạng di truyền thể phong phú biến dị cấu trúc di truyền cá thể bên loài loài; bên quần thể Đa dạng di truyền. .. KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: Bùi Thị Yến NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH