ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ======= NGUYỄN THỊ NHUNG XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC MS/[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ======= NGUYỄN THỊ NHUNG XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC-MS/MS Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Bản khóa luận thực hoàn thành Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia với hướng dẫn PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn PGS TS Lê Thị Hồng Hảo định hướng nghiên cứu, hướng dẫn góp ý giúp em hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Thị Hà Bình hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS Trần Cao Sơn cán khoa Độc học dị nguyên, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện giúp hồn thành đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy cô giáo giảng dạy khoa Hố, đặc biệt thầy mơn Hố Phân tích, cho tơi kiến thức q giá trình học tập thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn bè tập thể lớp cao học hố K24, đặc biệt người bạn nhóm hố phân tích K24 giúp đỡ, chia sẻ khó khăn suốt q trình tơi học tập thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè ln bên tơi, chia sẻ khó khăn, động viên giúp đỡ học tập sống Do thời gian thực đề tài có hạn nên khơng tránh thiếu sót Tơi mong nhận ý kiến đóng góp thầy bạn sinh viên Hà Nội, ngày 07 tháng 11 năm 2016 Nguyễn Thị Nhung Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu độc tố nhuyễn thể gây liệt 1.1.1 Giới thiệu STX 1.1.2 Giới thiệu NEO 1.1.3 Giới thiệu GTX-1 1.1.4 Giới hạn tối đa cho phép (ML) .6 1.1.5 Những tác hại độc tố nhuyễn thể gây liệt 1.2 Các phương pháp xác định độc tố gây liệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ 1.2.1 Các phương pháp thử sinh học 1.2.2 Phương pháp xét nghiệm miễn dịch ELISA 10 1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) .10 1.2.4 Kỹ thuật điện di .12 1.2.5 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), (LC-MS/MS) 13 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 Đối tượng nội dung nghiên cứu 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu .16 2.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 16 2.2.2 Phương phápsắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) 17 2.2.3 Thẩm định phương pháp 23 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 26 2.3 Phương tiện nghiên cứu 26 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 26 2.3.2 Dung mơi, hóa chất 27 Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Tối ưu hóa điều kiện chạy thiết bị LC-MS/MS 29 3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện chạy thiết bị khối phổ MS/MS 29 3.1.2 Tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 33 3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu .35 3.2.1 Chọn qui trình xử lí mẫu .35 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên trình chiết mẫu 40 3.2.3 Khảo sát trình pha loãng dịch chiết .42 3.2.4 Khảo sát thể tích dung mơi chiết 43 3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 46 3.3.1 Tính đặc hiệu / chọn lọc 46 3.3.2 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) .49 3.3.3 Xác định khoảng tuyến tính 50 3.3.4 Độ xác (accuracy) phương pháp phân tích (độ độ chụm) 52 3.4 Áp dụng phân tích mẫu thực tế 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên DANH SÁCH BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học độc tính vài độc tố PSP Bảng 1.2: Một số nước đưa qui định giới hạn tối đa cho phép (ML) PSP Bảng 1.3: Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC-FLD để xác định PSP 11 Bảng 2.1: Bảng pha dung dịch chuẩn làm việc 28 Bảng 3.1: Ion mẹ chất 29 Bảng 3.2: Điều kiện tối ưu cho ESI-MS/MS 30 Bảng 3.3: Các thông số tối ưu MS/MS 32 Bảng 3.4: Chương trình gradient 34 Bảng 3.5: Lựa chọn quy trình chiết mẫu 39 Bảng 3.6: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên trình chiết mẫu 40 Bảng 3.7: Khảo sát q trình pha lỗng dịch chiết 42 Bảng 3.8: Khảo sát thể tích dung mơi chiết 43 Bảng 3.9: Ion mẹ ion STX, GTX-1, NEO 46 Bảng 3.10: LOD LOQ STX, GTX-1, NEO 50 Bảng 3.11: Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ PSP 51 Bảng 3.12: Độ lặp lại độ thu hồi STX, GTX-1, NEO mẫu Ngao 53 Bảng 3.13: Độ lặp lại độ thu hồi STX, GTX-1, NEO mẫu Hàu 53 Bảng 3.14: Kết phân tích mẫu thực tế địa bàn Hà Nội 54 Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên DANH SÁCH H NH Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo tổng quát độc tố PSP Hình 1.2: Cơng thức cấu tạo STX Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo Neo Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo GTX-1 Hình 2.1: Sơ đồ đơn giản hệ thống sắc ký lỏng 18 Hình 2.2: Bộ kết nối phun điện tử 20 Hình 2.3: Bộ phân tích tứ cực 22 Hình 2.4: Bộ phân tích khối ba tứ cực 22 Hình 3.1: Sắc kí đồ mix PSP chuẩn 100 ng/mL chạy chương trình gradient 35 Hình 3.2: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 1Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình theo tác giả Van De Riet 36 Hình 3.3: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 37 Hình 3.4: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 38 Hình 3.5:Sắc kí đồ PSP 100 ng/mL quy trình 39 Hình 3.6: Sắc kí đồ quy trình khơng gia nhiệt thêm chuẩn mix PSP 100 ng/mL 41 Hình 3.7: Sắc kí đồ quy trình gia nhiệt thêm chuẩn mix PSP 100 ng/mL 41 Hình 3.8: Đồ thị khảo sát ảnh hưởng q trình pha lỗng đến hiệu suất thu hồi 42 Hình 3.9: Đồ thị khảo sát ảnh hưởng thể tích chiết đến hiệu suất thu hồi 44 Hình 3.10: Quy trình xử lí mẫu tối ưu 45 Hình 3.11: Phổ khối PSP 47 Hình 3.12: Sắc đồ mẫu trắng khơng có tín hiệu chất phân tích 47 Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên Hình 3.13: Sắc đồ mẫu chuẩn mức 200 ng/mL 48 Hình 3.14: Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn mức 200 ng/mL 48 Hình 3.15: Sắc kí đồ STX LOD 10 ng/mL (tương đương 100 µg/kg mẫu) 49 Hình 3.16: Sắc kí đồ NEO LOD 15 ng/mL (tương đương 150 µg/kg mẫu) 49 Hình 3.17: Sắc kí đồ GTX-1 LOD 15 ng/mL (tương đương 150 µg/kg mẫu) 50 Hình 3.18: Đường chuẩn STX theo diện tích pic 51 Hình 3.19: Đường chuẩn GTX-1 theo diện tích pic 52 Hình 3.20: Đường chuẩn NEO theo diện tích pic 52 Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu CAN AOAC Tiếng Anh Acetonitrile Association of Official Analytical Communities Tiếng Việt Acetonitril Hiệp hội nhà phân tích Độc tố nhuyễn thể gây trí ASP Amnesic Shellfish Poisoning CAD Collision Gas Pressure Áp suất khí va chạm CE Collision Energy Năng lượng va chạm CUR Curtain Gas Khí màng CXP Collision Cell Exit Potential Thế đầu DP Declustering Potential Thế phân mảnh DSP Diarrhetic Shellfish Poisoning Độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy d-SPE Dispersive solid phase extraction nhớ Chiết phân tán pha rắn Eq Equivalents Tương đương ESI Electronspray ionization Ion hóa phun điện tử FLD Fluoroscence detector Detector huỳnh quang GCB Graphitized carbon black Than hoạt tính GS1 Ion Source Gas Khí nguồn ion GS2 Ion Source Gas Khí nguồn ion GTX-1 Gonyautoxins-1 Độc tố gonyautoxins-1 HPLC High performance liquid chromatography Nguyễn Thị Nhung Sắc ký lỏng hiệu cao Trường ĐHKH Tự Nhiên HILIC IS LC-MS/MS Hydrophilic interaction liquid chromatography Ionspray Voltage Liquid chromatography tandem mass spectrometry Sắc kí lỏng tương tác thân nước Thế phun ion Sắc ký lỏng ghép khối phổ lần LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MBA Mouse bioassay Thử nghiệm sinh học chuột ML Maximum level Giới hạn tối đa cho phép MS Mass spectrometry Khối phổ NEO Neosaxitoxin Độc tố neosaxitoxin PSP Paralytic Shellfish poisoning Độc tố nhuyễn thể gây liệt R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi RSD(%) Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn STX Saxitoxin Độc tố saxitoxin TEM Ion source temperature Nhiệt độ nguồn Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần việc ni trồng thủy sản nói chung việc ni lồi hai mảnh vỏ nói riêng phát triển rầm rộ nhiều địa phương ven biển nước ta Điều góp phần vào việc phát triển ngành kinh tế biển, phục vụ cho nhu cầu thị trường tiêu thụ nước, tăng thêm thu nhập, cải thiện đời sống cho nhiều hộ dân cư ven biển Đơ thị hóa, nhiễm môi trường làm môi trường biển ngày bị suy thoái tạo điều kiện cho xuất bùng nổ loài vi tảo biển độc hại Các loài thân mềm hai mảnh vỏ đối tượng trung gian để gây tượng ngộ độc người sinh vật bậc cao chim biển, thú biển Đặc biệt có mặt nhóm độc tố độc tố gây liệt PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) Chính vậy, nghien cứu phát độc tố cần quan tâm để giảm nguy ảnh hưởng đến sức khỏe tính mạng người Trong đề tài tập trung nghiên cứu nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) Độc tố gây nguy hiểm đến sức khoẻ tính mạng người động vật nhyễn thể bị nhiễm tích lũy độc tố PSP ăn phải tảo độc nhóm Dinoflagellates bao gồm lồi Dinophysis spp, Aurocentum, prorocentrumlima.Việc xác định số độc tố nhuyễn thể gây liêt cần thiết, công cụ tốt phục vụ cho công tác tra, kiểm tra an tồn thực phẩm Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu phát triển phương pháp “Xác định đồng thời số độc tố gây liệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS” Phương pháp đại, có độ tin cậy xác cao Mục tiêu thực đề tài luận văn là: - Xây dựng phương pháp xác định đồng thời số độc tố gây liệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC - MS/MS - Sơ đánh giá số độc tố gây liệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ tiêu thụ Hà Nội Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên Hình 2.3: Bộ phân tích tứ cực Một số ion có tỷ số m/z xác định cộng hưởng với xoay chiều xác định thẳng qua khoảng khơng đến detector Trong ion khác khơng có qu đạo không ổn định va chạm với cực bị giữ lại Tuy nhiên để thu tất ion ta quét điện áp theo chu kỳ từ zero đến điện áp định tăng dần sau lại trở lại zero, ion vượt qua tứ cực có khối lượng từ nhỏ đến lớn để đến detector Máy tứ cực chặp ba: Q0 Q1 Q2 Q3 Hình 2.4: Bộ phân tích khối ba tứ cực Trong đó: Q0: Nguồn ion mẹ Q1: Bộ tứ cực thứ nhất, có nhiệm vụ tách ion Lựa chọn ion mẹ với m/z định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2 Q2: Bộ tứ cực thứ hai, điều kiện áp suất cao, ion mẹ bị phân li va chạm với khí trơ có mặt khí N2, Ar, He Bộ Q2 tạo phân ly ion mẹ Nguyễn Thị Nhung 22 Trường ĐHKH Tự Nhiên bị phân mảnh tạo ion nhỏ hơn, ion (daughter ions) Q2 khơng đóng vai trị lọc ion mà chấp nhận tất ion Q1 chuyển đến Sau tất ion chuyển qua tách Q3 Q3: Bộ tứ cực thứ ba làm nhiệm vụ tách ion chuyển từ Q2 để tới phận phát Bộ phận phát Sau khỏi thiết bị phân tích khối lượng, ion đưa tới phần cuối thiết bị khối phổ phận phát ion Có hai loại phận phát phổ biến: phận phát nhân electron (electron multipler) phận phát nhân quang (photo multipler) Bộ phận phát nhân electron detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao Một ion đập vào bề mặt dinod làm bật electron Các electron thứ cấp sau dẫn tới dinod tạo electron thứ cấp nhiều nữa, tạo thành dòng electron (1-106) Bộ phận phát nhân quang giống thiết bị nhân electron, ion ban đầu đập vào dinot tạo dòng electron Các photon phát nhân quang hoạt động thiết bị nhân electron Số lượng photon tỷ lệ với cường độ tín hiệu 2.2.3 Thẩm định phương pháp 2.2.3.1 Tính đặc hiệu/ chọn lọc - Khái niệm [5], [6] Tính đặc hiệu: khả phát chất phân tích có mặt tạp chất khác như: tiền chất, chất chuyển hóa, tạp chất Tính chọn lọc: khái niệm rộng tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích số nhiều chất trình - Xác định: Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ Nguyễn Thị Nhung 23 Trường ĐHKH Tự Nhiên Sử dụng phương pháp xác nhận (confirmation method) cách tốt để đảm bảo tính đặc hiệu phương pháp Hội đồng châu Âu quy định cách tính điểm IP (điểm nhận dạng – indenfication point) phương pháp khác để khẳng định chắn có mặt chất 2.2.3.2 Giới hạn phát (LOD), Giới hạn định lượng (LOQ) - Khái niệm [5], [6] Giới hạn phát (LOD): nồng độ khối lượng nhỏ phát với mức tin cậy xác định Giới hạn định lượng (LOQ): nồng độ tối thiểu chất có mẫu thử mà ta định lượng phương pháp khảo sát cho kết có độ xác mong muốn - Xác định: Dựa tỷ lệ tín hiệu nhiễu (S/N) Phân tích mẫu nồng độ thấp cịn xuất tín hiệu chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N) Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu chất phân tích N: Nhiễu đường LOD chấp nhận nồng độ mà tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=3 LOQ chấp nhận nồng độ mà tín hiệu lớn gấp 10-20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=10 2.2.3.3 Xây dựng đường chuẩn - Khái niệm [5] Đường chuẩn: đường biểu diễn phụ thuộc tuyến tính đại lượng đo nồng độ chất phân tích - Xác định: Nguyễn Thị Nhung 24 Trường ĐHKH Tự Nhiên Đo dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi khảo sát phụ thuộc tín hiệu nồng độ Vẽ đường thẳng tuyến tính biểu diễn phụ thuộc tín hiệu nồng độ chất phân tích 2.2.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi Độ lặp lại (độ chụm): mức độ gần giá trị riêng lẻ phép đo lặp lại biểu diễn độ lệch chuẩn S hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) [6] Trong đó: - xi : Nồng độ tính lần thử nghiệm thứ i - : Nồng độ trung bình tính N lần thử nghiệm - N: Số lần thử nghiệm Độ phương pháp: khái niệm mức độ gần giá trị trung bình kết thử nghiệm giá trị thực giá trị chấp nhận Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): tỷ lệ phần trăm giá trị thu so với giá trị lý thuyết Trong đó: - R: độ thu hồi (%) Nguyễn Thị Nhung 25 Trường ĐHKH Tự Nhiên - C: Nồng độ chất phân tích mẫu trắng thêm chuẩn (ng/mL) - Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ng/mL) 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu Các kết tính tốn tự động theo phần mềm phân tích thiết bị (phần mềm Analyst 1.5.1, ABSciex) Xử lý kết phần mềm Minitab 14 2.3 Phƣơng tiện nghiên cứu 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 2.3.1.1 Thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS Shimadzu bao gồm: + Thiết bị sắc ký lỏng Shimadzu Mode 20 AD-UFLC + Đầu dò khối phổ: Triplequard 5500 AB Sciex (M ) Cột sắc ký: Acclaim 120- cột C18 3μm (150mm × 2.1mm × 3μm) Máy lắc vortex Máy đồng mẫu Máy li tâm MIKRO 22R Cân phân tích (có độ xác 0,1mg 0,01mg) Cân kĩ thuật (có độ xác 0,01g) Máy cất quay chân không Eyela 2.3.1.2 Dụng cụ Pipet: 1, 2, 5, 10, 20 mL Bình định mức: 5, 10, 50, 100 mL Ống li tâm 50 mL Bình quay 50 mL, 100 mL Vial loại 1,8 mL Ống đong, phễu, giấy lọc Nguyễn Thị Nhung 26 Trường ĐHKH Tự Nhiên Micropipet loại 200 µL, 1000 µL, 5000 µL thay đổi thể tích đầu tương ứng 2.3.2 Dung mơi, hóa chất Các loại hố chất sử dụng thuộc loại tinh khiết phân tích - Methanol, acetonitril (Merck) - Acid formic, acid acetic, natri hydroxyd, acid trichloracetic (TCA) (Merck) - Nước cất lần - Chất hấp phụ C18, GCB cung cấp công ty Agilent, M - Tất dung dịch (trừ trường hợp sử dụng nguyên trạng dung môi loại tinh khiết sắc ký) lọc qua màng lọc 0,45 µm trước đưa vào hệ thống sắc kí * Chuẩn bị dung dịch chuẩn - Chuẩn STX, NEO, GTX-1 vật liệu chuẩn chứng nhận NCR, Canada - Các chuẩn PSP sử dụng Canada chuẩn vật liệu chứng nhận - Chuẩn STX dạng Saxitoxin Dihydrochloride nồng độ 66,3 µmol/L, khối lượng phân tử 372,2g/mol, tương đương với hàm lượng 24,7 µg/mL - Chuẩn Neo nồng độ 65,6 µmol/L, khối lượng phân tử 315,1g/mol, tương đương với hàm lượng 20,5 µg/mL - Chuẩn GTX-1 nồng độ 60,4 µmol/L, khối lượng phân tử 411,4g/mol, tương đương với hàm lượng 24,8 µg/mL - Dung dịch chuẩn trung gian 1000 ng/mL: Lấy xác thể tích chuẩn STX, NEO, GTX-1lần lượt 40,5; 48,8; 40,3 µL thêm 870 µL Nguyễn Thị Nhung 27 Trường ĐHKH Tự Nhiên dung môi HCOOH 0,1%, đậy nắp, lắc Chuẩn trung gian bảo quản nhiệt độ khoảng 4C, giữ tháng Các dung dịch chuẩn xây dựng đường chuẩn: Pha dãy dung dịch dùng để xây dựng đường chuẩn bảng 2.1 Bảng 2.1: Bảng pha dung dịch chuẩn làm việc Thể tích chuẩn trung gian (µL) 30 50 100 200 500 Thể tích dung mơi (µL) 970 950 900 800 500 Nồng độ STX (ng/mL) 30 50 100 200 500 Nồng độ Neo (ng/mL) 30 50 100 200 500 Nồng độ GTX-1 (ng/mL) 30 50 100 200 500 (*) Trường hợp pha đường chuẩn mẫu thay dịch chiết mẫu trắng - Dung dịch chuẩn trung gian µg/mL: Hút xác 40,5 µl chuẩn gốc STX vào lọ mẫu 1,8 mL thêm 960 µL dung mơi CH3COOH 1%, đậy nắp, lắc - Dung dịch chuẩn trung gian 100 ng/mL: Hút xác 100 µL dung dịch chuẩn µg/mL vào lọ mẫu 1,8 mL thêm 900 µL dung mơi CH3COOH 1%, đậy nắp, lắc - Dung dịch chuẩn trung gian 50 ng/mL: Hút xác 50 µL dung dịch chuẩn µg/mL vào lọ mẫu 1,8 mL thêm 950 µL dung mơi CH3COOH 1%, đậy nắp, lắc - Các dung dịch chuẩn trung gian bảo quản - 20oC giữ tháng Nguyễn Thị Nhung 28 Trường ĐHKH Tự Nhiên CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ƣu hóa điều kiện chạy thiết bị LC-MS/MS Để tìm điều kiện chạy sắc ký tốt cho số độc tố gây liệt trước tiên phải tìm ion định lượng ion định tính Do ban đầu chúng tơi tìm điều kiện tối ưu cho thiết bị khối phổ MS/MS 3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện chạy thiết bị khối phổ MS/MS 3.1.1.1 Khảo sát ion mẹ ion Trong nghiên cứu tiến hành kháo sát xác định độc tố PSP kĩ thuật ion hóa phun điện tử (ESI) với chế độ bắn phá ion dương Để tối ưu hóa điều kiện khối phổ, tiến hành tiêm dung dịch gồm STX, GTX-1, NEO 100ng/mL tiêm trực tiếp vào detector khối phổ để khảo sát Chọn chế độ khảo sát tự động chất để chọn ion mẹ, ion dùng để định lượng định tính chất Ion mẹ chất bảng 3.1 Bảng 3.1: Ion mẹ chất Độc tố Khối lượng phân tử M (g/mol) Ion mẹ (m/z) STX 299 300 [M+H]+ GTX-1 331 332 [M+H]+ Neo 315 316 [M+H]+ Nguyễn Thị Nhung 29 Trường ĐHKH Tự Nhiên Bảng 3.2: Điều kiện tối ưu cho ESI-MS/MS Ion mẹ Độc tố Ion DP (V) CE (V) CXP (V) 23 18 + 31 26 314[M+H]+ 25 18 + 35 14 298[M+H]+ 23 16 31 12 (m/z) (m/z) 282[M+H]+ STX 300[M+H] + 210 204[M+H] GTX-1 332[M+H] + 160 151[M+H] NEO 316[M+H] + 170 220[M+H] + Trong đó: + DP (Declustering Potential): Thế đầu vào, áp vào chắn phận phân tích khối Nó có tác dụng bẻ gẫy cụm ion [M+H3O+]+ khử nhiễu hóa học tạo thành, làm tăng độ nhạy phép phân tích Tuy nhiên, q cao, bẻ gẫy ln cấu trúc phân tử ion mẹ + CXP (Collision Cell Exit Potential): Thế áp tứ cực Q2 Q3 + CE (Collision Energy): Là lượng va chạm tao áp vào tứ cực Q2, tạo lượng để phân mảnh ion mẹ 3.1.1.2 Tối ưu điều kiện MS/MS Để tối ưu hóa điều kiện MS/MS cho độc tố cuối đưa thông điều kiện mà tối ưu cho chất phân tích, chúng tơi bơm hỗn hợp chất chuẩn PSP gồm STX, GTX-1, NEO 100ng/mL vào detector khối phổ để khảo sát Chọn chế độ khảo sát tự động ion định lượng định tính chất Nguyễn Thị Nhung 30 Trường ĐHKH Tự Nhiên Các thông số cho phận tạo nguồn ion + IS (IonSpray Voltage): Thế ion hóa, áp lên đầu phun chắn phân phân tích ion Thế định loại ion chuyển đến phận phân tích khối Đối với loại ion dương 4000 – 5500V, ion âm (-) 3000(-)4000V + GS1 (Ion Source Gas 1): Tạo áp suất khí hai bên đầu phun, có tác dụng làm cho hình thành nên giọt dễ dàng Tốc độ khí Gas thường cao so với Gas + TEM ( Temperature): Nhiệt độ nguồn khí nóng thổi vào (Gas2) Nó thúc đẩy q trình hóa giọt chất phân tích khỏi đầu phun + GS2 (Ion Source Gas 2): Tạo áp suất luồng khí nóng, hỗ trợ q trình làm bay dung mơi, tăng hiệu q trình ion hóa + CUR (Curtain Gas): Luồng khí N2 tinh khiết thổi vào khe chắn phận ion hóa phận phân tích phổ Nó có tác dụng đẩy giọt dung mơi phân tử trung hịa, để giữ cho Q0 (nguồn ion mẹ ) hơnCác thông số phận phân phân tích khối: + DP, CE, CXP giải thích + EP (Entrance Potential): Thế áp vào Q0 + CAD (Collision Gas Pressure): Kiểm sốt áp suất khí N2 tứ cực Q2, thúc đẩy trình phân mảnh thứ cấp, ngồi cịn có tác dụng làm mát ion hướng chúng đến tứ cực Q3 Tự động khảo sát thông số sau: + IS (V): 4000; 4500; 5000; 5500 + TEM (oC) : 350; 400;450; 500 + GS1 (psi):; 10;15; 25; 30 + GS2 (psi): 8,0; 9,0; 10,0; 25; 30 Nguyễn Thị Nhung 31 Trường ĐHKH Tự Nhiên + CUR (psi): 15,0;20,0; 25; 30 + DP (V) :210; 170; 160; 60; 70; 230 + EP (V) : 7; 8; 9; 10; 11 + CAD (psi): 7,0; 8,0; 9,0; 5,0; 6,0 + CXP (V): 18,0; 20,0; 26,0; 28,0; 16,0; 14,0; 12,0; 10 + CE (V): 13,0; 17,0; 23,0; 27,0; 31,0; 35,0; 10 Qua khảo sát ta thu giá trị tối ưu thông số cho chất nghiên cứu Giá trị liệt kê bảng 3.4 Bảng 3.3: Các thông số tối ưu MS/MS Nguyễn Thị Nhung IS 5500 V TEM 450 oC GS1 25 psi GS2 25 psi CUR 20 psi DP 200 V EP 10 V CAD psi CXP 26 V CE 35 psi 32 Trường ĐHKH Tự Nhiên 3.1.2 Tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 3.1.2.1 Chọn pha tĩnh Cột tách trái tim hệ thống sắc ký, đóng góp phần quan trọng việc định q trình tách Các chất nhóm PSP chất phân cực mạnh, chúng tan tốt nước nên việc dùng cột C18 khơng có ý nghĩa việc lưu giữ, tham khảo [32] sử dụng cột TSK-gel Amide 80 (Tosoh) Đây dạng cột Hillic, pha tĩnh vừa có gắn nhóm phân cực nhóm khơng phân cực nên có khả lưu giữ rửa giải chất PSP tốt Cột sắc ký sử dụng cột TSK-gel Amide 80 (Tosoh) 150 mm x mm x µm 3.1.2.2 Chọn pha động Tải FULL (89 trang): https://bit.ly/3zWPSQR Dự phịng: fb.com/TaiHo123doc.net Trong phương pháp sắc kí lỏng khối phổ, pha động không ảnh hưởng tới q trình tách chất mà cịn ảnh hưởng tới q trình ion hóa tín hiệu chất phân tích Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá chế độ ion dương, trình ion hóa tăng có thêm chất acid acetic, acid formic Trong nghiên cứu này, sử dụng hệ dung môi pha động sau: - Pha động A: acid formic 0,1% - Pha động B: acetonitril Điều kiện chạy máy cố định sau: - Cột: TSK-gel Amide-80® (3 m; 2,0 x 150 mm) - Detector khối phổ với thông số mục 3.1.1 - Tốc độ dịng: 0,5 mL/phút Chúng tơi dùng dung dịch mix PSP chuẩn 100 ng/mL để tiến hành khảo sát tỷ lệ thành phần pha động với chương trình gradient sau: Nguyễn Thị Nhung 33 Trường ĐHKH Tự Nhiên Bảng 3.4: Chương trình gradient Thời gian Tỷ lệ (%) thành phần pha động (phút) %A %B 10 90 50 50 50 50 7,5 10 90 10 10 90 15 85 60 40 12 60 40 12,5 15 85 15 15 85 15 85 90 10 12 90 10 12,5 15 85 15 15 85 10 90 60 40 60 40 7,5 10 90 10 10 90 Gradient Gradient Gradient Gradient Nguyễn Thị Nhung 34 Trường ĐHKH Tự Nhiên STX Neo GTX-1 Hình 3.1: Sắc kí đồ mix PSP chuẩn 100 ng/mL chạy chương trình gradient Nhận xét: Chương trình gradient (1), (2), (3) chạy sắc kí cho pic xấu (theo phụ lục 1), độ rộng chân pic kéo dài Chương trình gradient (4), chạy sắc kí cho píc nhọn, chân pic hẹp, cân đối Trong nghiên cứu chọn chương trình gradient (4) để tiến hành chạy sắc kí phân tích độc tố PSP 3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu Tải FULL (89 trang): https://bit.ly/3zWPSQR Dự phịng: fb.com/TaiHo123doc.net 3.2.1 Chọn qui trình xử lí mẫu Trong thành phần nhuyễn thể hai mảnh vỏ có chứa nhiều protein, acid amin, chất béo, vitamin hàm lượng muối cao, trước đo thiết bị LC-MS/MS cần phải xử lý mẫu, tách chiết, loại tạp chất, giảm ảnh hưởng mẫu, tránh làm hỏng detetor tăng khả phát chất phân tích Trong nghiên cứu này, chúng tơi tham khảo quy trình chiết mẫu mẫu thử thêm chuẩn mức 100 ng/mL Nguyễn Thị Nhung 35 Trường ĐHKH Tự Nhiên Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình theo tác giả Zhuo [31]: Cân g mẫu/ ống ly tâm 15 mL Chiết + mL ACN/H2O (90/10, v/v) chứa lần HCOOH 0,1% Lắc xoáy, siêu âm phút, ly tâm Cắn Dịch Làm lạnh -20oC Bỏ lớp dịch trên, lấy lớp đá Thổi khô N2 40oC Định mức 1mL Làm SPE (C18) d-SPE (50 mg C18 + mg GCB) Ly tâm, lọc LC-MS/MS Hình 3.2: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu Nguyễn Thị Nhung 36 8307875 Trường ĐHKH Tự Nhiên ... dựng phương pháp xác định đồng thời số độc tố gây liệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC - MS/MS - Sơ đánh giá số độc tố gây liệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ tiêu thụ Hà Nội... phương pháp ? ?Xác định đồng thời số độc tố gây liệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/ MS” Phương pháp đại, có độ tin cậy xác cao Mục tiêu thực đề tài luận văn là: - Xây dựng phương pháp. .. dàng độc tố tảo giáp với lượng độc tố tương đương hàu ngừng lọc 1.2 Các phƣơng pháp xác định độc tố gây liệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ Có hai nhóm phương pháp để xác định độc tố sinh học biển nhuyễn