Luận án thiết kế, tổng hợp và đánh giá tác động ức chế acetylcholinesterase và beta amyloid của một số dẫn chất tương đồng curcumin và flavonoid

1 MỞ ĐẦU Bệnh Alzheimer (Alzheimer’s Disease – AD) bệnh thối hóa thần kinh khơng hồi phục đƣợc Alois Alzheimer mô tả lần vào năm 1906 [104] Đây bệnh có tỷ lệ cao ngƣời lớn tuổi Theo ƣớc tính, năm 2018 tồn giới có khoảng 50 triệu ngƣời bị trí nhớ có liên quan đến AD, số tăng lên gần lần vào năm 2050 [89] AD tạo gánh nặng lớn kinh tế - xã hội lên hệ thống y tế nhiều nƣớc phát triển có dân số ngày già Chi phí cho chăm sóc y tế tồn cầu bệnh trí nhớ, bao gồm AD, lần lƣợt vào năm 2015, 2030 2050 tƣơng ứng 950 tỷ, 2.500 tỷ, 9.100 tỷ đô la Mỹ [70] Tại Việt Nam, nghiên cứu dịch tễ học ghi nhận có khoảng 500.000 ngƣời 60 tuổi bị sa sút trí tuệ bao gồm AD, số ngày tăng lên kèm theo chi phí cho điều trị bệnh ngày lớn [4] Các thuốc đƣợc sử dụng điều trị AD; bao gồm rivastigmin, galantamin, donepezil, memantin; làm chậm lại tiến triển trình suy giảm chức nhận thức mà khơng chữa lành đƣợc bệnh [101] Chính vậy, nhu cầu tìm kiếm liệu pháp chặn đứng đảo nghịch tiến triển bệnh lớn Về mặt bệnh học, AD đƣợc xác nhận bệnh với nhiều yếu tố bệnh sinh bao gồm: diện mảng β-amyloid (Aβ) ngoại bào đám rối sợi thần kinh với protein Tau bị phosphoryl hóa mức nội bào tế bào thần kinh [101], [165], tính tồn vẹn hệ vi mạch thần kinh não [62], thay đổi hoạt động synap/thần kinh chuyển hóa thần kinh [55] Nhƣ vậy, chất đa yếu tố phức tạp AD nên hƣớng trị liệu trọng đến việc tìm hợp chất có tác dụng đồng thời nhiều yếu tố bệnh học quan trọng bệnh Hai cách tiếp cận nghiên cứu thuốc điều trị AD thu hút nhiều mối quan tâm nhà khoa học thời gian dài tái lập dẫn truyền hệ cholinergic thông qua ức chế acetylcholinesterase (AChE) ức chế β-amyloid thông qua ức chế enzym β-secretase (beta-site amyloid precusor protein cleaving enzyme 1, BACE-1) Đây enzym quan trọng sinh bệnh học AD AChE chịu trách nhiệm cho khiếm khuyết đƣờng dẫn truyền tín hiệu cholinergic, cịn BACE-1 enzym có liên quan đến q trình sinh tổng hợp thành phần mảng β-amyloid [97] Curcuminoid (curcumin chất tƣơng đồng) flavonoid nhóm hợp chất thiên nhiên thu hút nhiều mối quan tâm thời gian gần hoạt tính sinh học đa dạng chúng, đặc biệt tác dụng đƣợc chứng minh có lợi AD [117], [153] Những lợi ích trị liệu dẫn chất curcumin flavonoid AD thông qua nhiều đƣờng khác nhau, có tác động AChE [10], [153] BACE-1 [169], [176] Thiết kế thuốc với hỗ trợ máy tính phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi lĩnh vực phát minh thuốc, cho đời nhiều tác nhân trị liệu hữu hiệu [75], [177], [180] Bằng cách sử dụng phƣơng pháp này, nhà khoa học đƣa nhiều gợi ý có giá trị để định hƣớng cho giai đoạn nghiên cứu thực nghiệm tiến trình phát triển thuốc Nhiều nghiên cứu gần phƣơng pháp thiết kế thuốc có hỗ trợ máy tính bao gồm nghiên cứu mối liên quan định lƣợng cấu trúc–hoạt tính sinh học chiều (two-dimensional quantitative structure–activity relationship, 2D-QSAR), mơ hình pharmacophore docking phân tử đƣợc áp dụng thành công tìm kiếm cấu trúc có tiềm ức chế AChE BACE-1 Điều giúp cho viễn cảnh tìm kiếm chất điều trị AD ngày rộng mở đầy hứa hẹn [8], [66], [86], [87] Nhƣ với việc nhận thấy rõ bệnh Alzheimer bệnh có nhiều yếu tố bệnh sinh, đáng ý rối loạn dẫn truyền cholinergic hình thành kết tập mảng Aβ, đồng thời nhận thấy rõ dẫn chất flavonoid curcumin có hoạt tính sinh học đa dạng, có hoạt tính quan trọng sinh bệnh học Alzheimer, đặc biệt hoạt tính liên quan đến AChE BACE-1, đề tài “Thiết kế, tổng hợp đánh giá tác động ức chế acetylcholinesterase -amyloid số dẫn chất tƣơng đồng curcumin flavonoid” đƣợc thực với mục tiêu: Thiết kế in silico dẫn chất curcumin flavonoid đƣợc dự đốn có hoạt tính ức chế đích tác động bệnh Alzheimer AChE BACE-1 - Xây dựng thƣ viện tổ hợp ảo dẫn chất curcumin flavonoid phục vụ cho nghiên cứu sàng lọc để tìm kiếm dẫn chất khung cấu trúc có tác động đồng thời AChE BACE-1 - Xây dựng mơ hình pharmacophore AChE BACE-1 sàng lọc thƣ viện tổ hợp ảo để tìm kiếm dẫn chất khung cấu trúc có tiềm ức chế mạnh AChE BACE-1 - Thiết kế dẫn chất từ khung cấu trúc đƣợc dự đoán có tiềm ức chế enzym - Xây dựng mơ hình 2D-QSAR để dự đốn hoạt tính sinh học dẫn chất sàng lọc đƣợc thiết kế - Xây dựng mơ hình docking phân tử để đánh giá phân tích khả gắn kết dẫn chất sàng lọc đƣợc thiết kế - Đề xuất danh sách chất tiềm để lựa chọn cho tổng hợp hóa học đánh giá hoạt tính sinh học in vitro Tổng hợp dẫn chất lựa chọn từ danh sách chất đƣợc thiết kế Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro dẫn chất tổng hợp đƣợc CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh Alzheimer Bệnh Alzheimer (AD) thách thức lớn mặt y tế kỷ nguyên Bệnh biểu sa sút lực trí tuệ, dần trí nhớ, rối loạn ngơn ngữ khả sử dụng động tác nhƣ nhận thức, dẫn đến ảnh hƣởng nghiêm trọng cho lao động nghề nghiệp giao tiếp xã hội bệnh nhân AD gây tác động nặng nề đến gia đình ngƣời xung quanh chăm sóc bệnh nhân AD thƣờng khó khăn tốn AD tiến triển trầm trọng theo thời gian cuối dẫn đến tử vong [101] Hiện số ngƣời bị sa sút trí tuệ có liên quan đến AD tồn giới vào khoảng 50 triệu ngƣời (năm 2018), số tăng lên đến 152 triệu vào năm 2050 [89], với chi phí cho chăm sóc y tế tồn cầu bệnh hàng ngàn tỷ la Mỹ [70] AD có yếu tố nguy cơ, bao gồm: tuổi tác, yếu tố di truyền, lối sống, chế độ ăn, bia rƣợu, thuốc lá, bệnh lý tim mạch, đái tháo đƣờng, trầm cảm, béo phì Ngồi ra, yếu tố làm tăng dự trữ nhận thức bao gồm giáo dục, trí thơng minh, nghề nghiệp hoạt động xã hội suốt đời góp phần làm tăng giảm nguy AD [133] Về mặt bệnh học, AD đƣợc xác định bệnh với nhiều chế bệnh sinh bao gồm: (i) lắng đọng ngoại bào mảng Aβ; (ii) xuất bên nội bào đám rối tơ sợi thần kinh có chứa protein Tau bị phosphoryl hóa mức [101], [165]; (iii) rối loạn dẫn truyền thần kinh cholinergic [59]; (iv) hậu đáp ứng viêm miễn dịch kéo dài [80]; (v) nhiều yếu tố khác [29] Về thuốc điều trị, chất ức chế acetylcholinesterase có donepezil, rivastigmin galantamin chất đƣợc sử dụng rộng rãi Các thuốc ức chế có hồi phục AChE Tác dụng điều trị nhƣ tác dụng khơng mong muốn nhóm thuốc gần nhƣ tƣơng đƣơng việc lựa chọn sử dụng thuốc điều trị chủ yếu dựa vào giá thành, khả dung nạp bệnh nhân kinh nghiệm bác sĩ [98] Memantin chất kháng thụ thể Nmetyl-D-aspartat đƣợc Cơ quan quản lý Thực Dƣợc phẩm Hoa Kỳ cấp phép vào năm 2003 để điều trị AD giai đoạn trung bình đến nặng Memantin dùng phối hợp với chất ức chế acetylcholinesterase [73] Ngoài thuốc đƣợc cấp phép, nay, có nhiều thuốc đƣợc thử nghiệm lâm sàng AD thể giai đoạn khác nhƣ: (i) liệu pháp kháng amyloid: bao gồm chất ức chế BACE-1, chất ức chế hay điều hòa -secretase; (ii) liệu pháp chủng ngừa nhƣ vaccin hay immunoglobulin; (iii) kháng thể đơn dòng; (iv) liệu pháp tác động lên protein Tau nhƣ: chất ức chế phosphoryl hóa Tau, chất ổn định cấu trúc vi ống, (v) nhiều liệu pháp khác Tuy nhiên, chƣa có thử nghiệm lâm sàng cho kết tác dụng khả quan chất nghiên cứu [98] 1.2 Tổng quan acetylcholinesterase 1.2.1 Vai trò bệnh Alzheimer Giả thuyết cholinergic nhấn mạnh synap thần kinh diện khắp nơi hệ thần kinh trung ƣơng ngƣời, với mật độ dày đặc vùng dƣới đồi, thể vân, hệ viền vùng tân vỏ não (neocortex) Điều gợi ý dẫn truyền thần kinh cholinergic có khả đóng vai trị tối quan trọng trí nhớ, khả học hỏi, tập trung chức thần kinh cao cấp khác Chính vậy, hệ cholinergic não chiếm vai trò trung tâm nghiên cứu đƣợc thực tình trạng sa sút trí tuệ tuổi gây ra, có AD [59] Acetylcholinesterase (AChE, EC 3.1.1.7) có vai trò xúc tác cho phản ứng thủy phân acetylcholin (ACh) số ester cholin dẫn truyền thần kinh khác AChE đƣợc tìm thấy chủ yếu synap thần kinh cholinergic, nhanh chóng phân hủy ACh để giải phóng cholin acetat Do AChE đóng vai trị thiết yếu dẫn truyền thần kinh cholinergic [35] Các chất ức chế acetylcholinesterase làm tăng nồng độ acetylcholin khe synap não liệu pháp trị liệu đƣợc chứng minh lâm sàng có hiệu điều trị tình trạng sa sút trí tuệ AD gây Chính điều xác nhận hệ cholinergic đích trị liệu quan trọng bệnh [59] Từ thực tế nhận thấy đƣợc tầm quan trọng AChE mà enzym trở thành mục tiêu loại thuốc đƣợc thiết kế để điều trị khơng bệnh Alzheimer mà cịn số bệnh khác liên quan đến hệ cholinergic nhƣ nhƣợc cơ, tăng nhãn áp…[145] 1.2.2 Cơ chế xúc tác AChE có khả tạo sản phẩm trung gian cấu trúc tứ diện thông qua phản ứng acid–base với ba xúc tác (gồm acid amin serin, histidin, glutamat) Histidin cho phép chuyển proton nguyên tử oxy serin ACh, loại phần cholin để tạo serin đƣợc acetyl hóa Khi acetyl-serin bị deacetyl hóa, q trình tái tạo AChE trạng thái tự bắt đầu Trong phản ứng acid amin aspatat giúp ổn định acid amin histidin bị proton hóa, acid amin phóng thích acetat để khôi phục enzym trạng thái tự Tƣơng tác acid amin (tyrosin, phenylalanin, tryptophan) tạo nên vùng anion ngoại bào ảnh hƣởng đến cấu dạng gắn kết ACh vào vị trí [182] Cơ chế phản ứng phân hủy ACh AChE đƣợc trình bày Hình 1.1 Hình 1.1 Cơ chế phản ứng phân hủy acetylcholin acetylcholinesterase ACh: acetylcholin, Ser: serin, His: histidin (Nguồn: Zhou cộng (2010) [182]) 1.2.3 Cấu trúc acetylcholinesterase Cấu trúc AChE đƣợc nghiên cứu đầy đủ enzym loài Tetronarce californica (trƣớc gọi Torpedo california) Đây polypeptid có chứa 528 acid amin Trong cấu trúc AChE, hai vùng gắn kết quan trọng đƣợc nghiên cứu chi tiết vùng xúc tác vùng ngoại biên Cấu trúc AChE vùng gắn kết đƣợc trình bày Hình 1.2, chức thành phần acid amin quan trọng vùng gắn kết AChE đƣợc trình bày Bảng 1.1 [175] Hình 1.2 Cấu tạo acetylcholinesterase vùng gắn kết quan trọng (tinh thể 1EVE) Ala: alanin, Asp: aspartat, Glu: glutamat, Gly: glycin, His: histidin, Phe: phenylalanin, Ser: serin, Trp: tryptophan, Tyr: tyrosin (Nguồn: Bajda cộng (2013) [12]) Bảng 1.1 Vị trí, chức thành phần acid amin quan trọng vùng gắn kết acetylcholinesterase Các acid amin Vùng Vai trò Xúc tác Nằm đáy khoang tác động hẹp (khoảng Å) sâu (khoảng 20 Å) Bộ ba xúc tác Ser200, His440, Glu327 Phân hủy ACh Túi ―oxyanion‖ Gly118, Gly119, Ala201 Ổn định phức trung gian đƣợc hình thành cách tiếp nhận oxy nhóm carbonyl acetylcholin Túi acyl Trp233, Phe288, Phe290, Phe331 Ổn định nhóm methyl cấu tử acetat q trình xúc tác đóng vai trị quan trọng tính chọn lọc chất cho enzym Vùng anion Trp84, Glu199, Phe330 Ổn định điện tích dƣơng phối tử tƣơng tác tĩnh điện với Glu199 đặc biệt tƣơng tác với electron π nhân thơm Trp84 Phe330 Vùng ngoại biên Nằm lối vào khoang tác động Tyr70, Asp72, Tyr121, Trp279, Tyr334 Thúc đẩy kết tập mảng -amyloid đồng thời biến đổi chức synap tế bào thần kinh hải mã Ala: alanin, Asp: aspartat, Ser: serin, His: histidin, Glu: glutamat, Gly: glycin, Ala: alanin, Trp: tryptophan, Phe: phenylalanin, Tyr: tyrosin (Nguồn: Xu cộng (2017) [175]) 1.2.4 Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế acetylcholinesterase Có nhiều phƣơng pháp khác đƣợc mô tả để xác định hoạt tính ức chế AChE bao gồm phƣơng pháp đo màu sử dụng thuốc thử Ellman [48] hay thuốc thử muối Fast Blue B [99], phƣơng pháp huỳnh quang [132], hay HPLC [68] Tuy nhiên, phƣơng pháp Ellman phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi để định lƣợng hoạt tính ức chế AChE Đây phƣơng pháp đo quang nhạy Phƣơng pháp đƣợc tiến hành việc đo độ hấp thụ quang bƣớc sóng 405 nm hợp chất có màu vàng đƣợc tạo thành thiocholin (sản phẩm thủy phân chất acetylthiocholin iodid - ATCI AChE) với thuốc thử Ellman (acid 5,5’-dithiobis-nitrobenzoic - DTNB) theo nhƣ Sơ đồ 1.1 Sơ đồ 1.1 Phản ứng tạo sản phẩm màu theo phƣơng pháp Ellman (Nguồn: Ellman cộng (1961) [48]) 1.3 Tổng quan β-secretase 1.3.1 Vai trò bệnh Alzheimer Khi có phân cắt bất thƣờng protein tiền sinh chất amyloid (amyloid precursor protein, APP), monomer Aβ đƣợc tạo thành kết tập lại thành oligomer Aβ cuối lắng đọng dƣới dạng tơ sợi mảng Aβ Các lắng đọng Aβ đám rối tơ sợi thần kinh gây synap thần kinh neuron, kết vùng não bị ảnh hƣởng bị teo nhỏ [37] APP đƣợc phân cắt theo đƣờng khác với tham gia enzym -, -, secretase Sự phân cắt liên tiếp phức hợp -secretase -secretase ngăn chặn việc tạo thành A Trong đƣờng tạo amyloid, -secretase phân cắt APP vị trí β (nên đƣợc gọi beta-site APP cleaving enzyme hay BACE-1) để tạo phân mảnh đầu C liên kết với màng chứa 99 acid amin (C-terminal fragment consisting of 99 amino acids, CTF99), mảnh APP hòa tan (soluble APPβ, sAPP) sAPP chất phức hợp -secretase bị enzym phân cắt làm phóng thích vùng APP nội bào (AICD) monomer A có chứa từ 1–38 đến 1–43 acid amin Các monomer A sau kết tập lại tạo thành oligomer mảng A [181] (Hình 1.3) Hình 1.3 Quá trình phân cắt protein tiền sinh chất amyloid APP: protein tiền sinh chất amyloid, AICD: vùng APP nội bào, BACE-1: β-secretase, CTF83: phân mảnh gắn kết với màng có đầu C tận chứa 83 acid amin, CTF99: phân mảnh liên kết với màng có đầu C tận chứa 99 acid amin, sAPP: mảnh APP hòa tan (Nguồn: Zhou cộng (2019) [181]) 10 1.3.2 Cơ chế xúc tác BACE-1 BACE-1 xúc tác theo chế acid–base để phân cắt liên kết peptid trình xúc tác (Hình 1.4) [14] Cơ chế gồm hai bƣớc: Đầu tiên, Asp228 khơng proton hóa có vai trị base Asp32 proton hóa đóng vai trò acid Asp228 nhận proton từ phân tử nƣớc tạo ion hydroxyl (OH-) Ion hydroxyl có tính nhân cơng vào ngun tử C nhóm carbonyl liên kết peptid (I) đồng thời Asp32 chuyển proton cho nguyên tử oxy nhóm carbonyl tạo thành dẫn chất gem-diol trung gian (II) Bƣớc hai, hai acid amin aspartat đảo ngƣợc vai trò so với bƣớc đầu, lúc Asp32 base Asp228 acid Asp228 chuyển proton cho nhóm –NH– liên kết peptid Asp32 nhận proton hai OH- nhóm gemdiol, dẫn đến phân cắt liên kết peptid (III) Hình 1.4 Cơ chế hoạt động BACE-1 Asp: aspartat (Nguồn: Barman cộng (2014) [14]) 1.3.3 Cấu trúc BACE-1 Nhiều cấu trúc tinh thể BACE-1 đƣợc xác định dƣới dạng có khơng có phối tử đồng kết tinh vị trí hoạt động BACE-1 có đặc điểm cấu tạo nhƣ sau [105]: - Một vùng có hoạt tính protease thùy N tận cùng, chuỗi liên kết, vùng xuyên màng, vùng nằm bào tƣơng B7 4,29 4,52 –17,91 B8 4,18 4,56 –19,61 D1 (Diosmetin) 3,83 4,50 –22,86 D2 4,06 4,42 –21,05 D3 3,89 4,37 –20,90 D4 3,82 4,26 –15,22 D5 4,13 4,39 –21,80 D6 4,12 4,31 –20,39 D7 3,47 4,35 –25,35 Galantamin 5,88 5,14 –33,28 Tương tác với BACE-1 (Tinh thể 6EQM) pIC50 Thực nghiệm Dự đoán Điểm số docking (kJ.mol–1) B1 (Baicalein) 4,16 3,66 –17,64 B2 4,36 4,82 –16,37 Dẫn chất Mơ hình tương tác B3 5,40 5,11 –12,35 B4 4,15 4,35 –10,84 B5 4,77 4,60 –8,29 B6 4,90 5,18 –17,35 B7 4,50 4,73 –12,95 B8 4,65 4,75 –10,75 D1 (Diosmetin) 4,36 3,55 –19,32 D2 5,67 5,83 –19,33 D3 5,50 6,04 –17,18 D4 5,44 5,24 –13,31 D5 5,78 6,20 –13,46 D6 5,80 6,34 –12,02 D7 5,54 6,07 –22,07 Quercetin 5,02 5,24 –22,55 Umibecestat –47,04 ... đề tài ? ?Thiết kế, tổng hợp đánh giá tác động ức chế acetylcholinesterase  -amyloid số dẫn chất tƣơng đồng curcumin flavonoid? ?? đƣợc thực với mục tiêu: Thiết kế in silico dẫn chất curcumin flavonoid. .. thiết kế, tổng hợp đánh giá hoạt tính ức chế AChE dãy 20 dẫn chất chalcon Dẫn chất có tác dụng ức chế mạnh số phân tử tổng hợp đƣợc có IC50 = 4,68 μmol/L 40 Polo cộng (2019) [123] tổng hợp đƣợc... hóa học đánh giá hoạt tính sinh học in vitro Tổng hợp dẫn chất lựa chọn từ danh sách chất đƣợc thiết kế Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro dẫn chất tổng hợp đƣợc 4 CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan