Luận án nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của loài tỏa dương (balanophora laxiflora hemsl )

Tên viết tắt DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT Tên viết đầy đủ A.a Acid acetic Ace Aceton AP-1 Activator protein 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) Caff (E)-Caffeoyl Cin Cinnamoyl COSY Correlation Spectroscopy COX-2 Cyclooxygenase-2 CTCT Công thức cấu tạo CTHH Cấu trúc hóa học Cour p-Coumaroyl DCM Dichloromethan DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Dex Dexamethason DMEM Mơi trường dùng cho nhiều dịng tế bào khác (Dulbecco's Modified Eagle Medium) DMSO Dimethyl sulfoxid DPI Diphenyliodonium DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl EC50 Nồng độ có hiệu 50% (Effective Concentration 50%) EI-MS Phổ khối ion hóa điện tử (Electrospray Ionisation-Mass Spectrometry) ESI-MS Phổ khối ion hóa phun mù điện tử (Electro Spray Ionisation-Mass Spectrometry) EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol FBS Huyết thai bò (Fetal Bovine Serum) Gal Galloyl GAPDH Glyceraldehyd-3-Phosphate Dehydrogenase Glc Glucopyranosyl HepG2 Dòng tế bào ung thư gan người (Human hepatocellular carcinoma cell line) Hx n-Hexan HL-60 Dòng tế bào ung thư máu (Human leukemia cell line) HMBC H-NMR HSQC HPLC HR-ESI-MS Phổ tương quan dị nhân đa liên kết (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) Phổ tương tác dị nhân lượng tử đơn (Heteronuclear Single Quantum Coherence) Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Chromatography) Phổ khối ion hóa phun mù điện tử phân giải cao (High Resolution-Electron Spray Ionization-Mass Spectrometry) IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) IFN-β Interferon beta IL Interleukin iNOS Inducible Nitric Oxide Synthase IR Hồng ngoại (Infrared) KLPT Khối lượng phân tử LC-MS Liquyd Sắc ký lỏng kết hợp với phổ khối (Liquyd Chromatography–Mass Spectrometry) LPS Lipopolysaccharid m Khối lượng chất thu MAPK Mitogen-activated protein kinase MCF-7 Dòng tế bào ung thư vú (Human breast adenocarcinoma cell line) MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory Concentration) MTPA MTS Acid α-methoxy-α-(trifluoromethyl)phenylacetic 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4sulfophenyl)-2H-tetrazolium m/z Tỉ lệ khối lượng/điện tích (Mass to charge ratio) n-BuOH n-Butanol NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate NF-κB Yếu tố nhân kappa B (Nuclear Factor-kappa B) NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) NO Nitric oxid NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy NOS Nitric Oxid Synthase NOX NADPH oxidase NXB Nhà xuất OVASHO Tế bào ung thư buồng trứng ppm Phần triệu ROS Các gốc oxy hóa hoạt động (Reactive Oxygen Species) SOD Superoxid Dismutase STT Số thứ tự TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TLTK Tài liệu tham khảo TNF-α Yếu tố hoại tử khối u alpha (Tumor Necrosis Factor-alpha) TT Thuốc thử UV Tử ngoại (Ultra Violet) DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Cấu trúc hợp chất tannin phân lập từ lồi B laxiflora………………… 24 Hình 1.2 Cấu trúc phenylpropanoid đơn giản phân lập từ loài B laxiflora … 25 Hình 1.3 Cấu trúc hợp chất lignan phân lập từ lồi B laxiflora………………… 26 Hình 1.4 Cấu trúc hợp chất coumarin phân lập từ lồi B laxiflora……………………26 Hình 1.5 Cấu trúc hợp chất flavonoid phân lập từ lồi B laxiflora…………… 27 Hình 1.6 Cấu trúc hợp chất terpenoid phân lập từ lồi B laxiflora……………….28 Hình 1.7 Cấu trúc hợp chất steroid phân lập từ loài B laxiflora ………………….28 Hình 1.8 Cấu trúc hợp chất khác phân lập từ lồi B laxiflora ………………… 28 Hình 1.9 Viêm gốc oxy hóa hoạt động (ROS)……………………………… 37 Hình 2.1 Tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl.) 42 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu loài Tỏa dương B laxiflora .46 Hình 2.3 Quy trình thử nghiệm đánh giá tác dụng chống viêm cấp mơ hình gây phù bàn chân chuột carrageenan 54 Hình 2.4 Quy trình thử nghiệm đánh giá tác dụng chống viêm mạn mô hình gây u hạt 55 Hình 3.1 Hình thái cụm hoa đực 58 Hình 3.2 Hình thái cụm hoa 59 Hình 3.3 Vi phẫu thân khí sinh 60 Hình 3.4 Cấu tạo vi phẫu thân rễ, bó mạch 61 Hình 3.5 Cấu tạo vi phẫu 61 Hình 3.6 Cấu tạo vi phẫu rễ Tỏa dương .62 Hình 3.7 Đặc điểm bột dược liệu 63 Hình 3.8 Quy trình chiết xuất phân lập hợp chất từ Tỏa dương 69 Hình 3.9 Cấu trúc hóa học hợp chất BL1 70 Hình 3.10 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL2…………72 Hình 3.11 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL3 74 Hình 3.12 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL4 75 Hình 3.13 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL5 77 Hình 3.14 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL6 79 Hình 3.15 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL7 80 Hình 3.16 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL8……… 82 Hình 3.17 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL9 84 Hình 3.18 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL10 86 Hình 3.19 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL11 87 Hình 3.20 Cấu trúc hóa học hợp chất BL12 88 Hình 3.21 Cấu trúc hóa học hợp chất BL13 89 Hình 3.22 Cấu trúc hóa học hợp chất BL14 89 Hình 3.23 Cấu trúc hóa học hợp chất BL15 90 Hình 3.24 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL16 91 Hình 3.25 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL17 93 Hình 3.26 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL18 94 Hình 3.27 Cấu trúc hóa học hợp chất BL19 96 Hình 3.28 Cấu trúc hóa học hợp chất BL20 97 Hình 3.29 Cấu trúc hóa học hợp chất BL21 99 Hình 3.30 Cấu trúc hóa học hợp chất BL22 .100 Hình 3.31 Cấu trúc hóa học hợp chất BL23 .101 Hình 3.32 Cấu trúc hóa học hợp chất BL24 .102 Hình 3.33 Cấu trúc hóa học hợp chất BL25 .103 Hình 3.34 Cấu trúc hóa học hợp chất BL26 .103 Hình 3.35 Cấu trúc hóa học hợp chất BL27 hợp chất tham khảo 104 Hình 3.36 Tác dụng ức chế mức độ biểu gen COX-2 cao toàn phần cao phân đoạn nồng độ 30 µg/ml .106 Hình 3.37 Tác dụng ức chế mức độ biểu protein COX-2 hợp chất phân lập từ phân đoạn EtOAc nồng độ 10 µM 107 Hình 3.38 Ảnh hưởng BL23 đến khả sống sót tế bào RAW 264.7 .107 Hình 3.39 Tác dụng BL23 biểu COX-2 phụ thuộc theo nồng độ 108 Hình 3.40 Tác dụng BL23 (10 µM) mức độ biểu gen iNOS, IL-1β, IL-6, INF-β TNFα 109 Hình 3.41 Ảnh hưởng BL23 lên trình sản xuất ROS 110 Hình 3.42 Tác dụng chống viêm BL23 liên quan đến tín hiệu MAPK 111 Hình 3.43 Tác dụng chống viêm cấp phân đoạn chất phân lập từ Tỏa dương 114 Hình 3.44 Tác dụng chống viêm mạn phân đoạn chất phân lập từ Tỏa dương 116 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Balanophora Việt Nam Bảng 1.2 Các hợp chất tannin (1-66) phân lập từ chi Balanophora Bảng 1.3 Các phenylpropanoid đơn giản (67-91) phân lập từ chi Balanophora 10 Bảng 1.4 Các hợp chất lignan (92-114) phân lập từ chi Balanophora 11 Bảng 1.5 Các hợp chất flavonoid (119-150) phân lập từ chi Balanophora 12 Bảng 1.6 Các hợp chất terpenoid (151-169) phân lập từ chi Balanophora 14 Bảng 1.7 Các hợp chất khác (173-198) phân lập từ chi Balanophora 15 Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất Tỏa dương 64 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL1 70 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL2 hợp chất tham khảo 71 Bảng 3.4 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL3 hợp chất tham khảo 73 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL4 hợp chất tham khảo 74 Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL5 hợp chất tham khảo 76 Bảng 3.7 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL6 hợp chất tham khảo 78 Bảng 3.8 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL7 hợp chất tham khảo 79 Bảng 3.9 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL8 81 Bảng 3.10 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL9 83 Bảng 3.11 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL10 hợp chất tham khảo 85 Bảng 3.12 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL11 hợp chất tham khảo 86 Bảng 3.13 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL12 hợp chất tham khảo 87 Bảng 3.14 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL13 hợp chất tham khảo 88 Bảng 3.15 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL14 89 Bảng 3.16 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL15 hợp chất tham khảo 90 Bảng 3.17 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL16 hợp chất tham khảo 91 Bảng 3.18 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL17 hợp chất tham khảo 92 Bảng 3.19 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL18 hợp chất tham khảo 93 Bảng 3.20 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL19 hợp chất tham khảo 95 Bảng 3.21 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL20 96 Bảng 3.22 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL21 98 Bảng 3.23 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL22 99 Bảng 3.24 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL23 .100 Bảng 3.25 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL24 hợp chất tham khảo 102 Bảng 3.26 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL25 hợp chất tham khảo 102 Bảng 3.27 Dữ liệu phổ NMR hợp chất BL26 .103 Bảng 3.28 Số liệu phổ NMR hợp chất BL27 hợp chất tham khảo 103 Bảng 3.29 Tác dụng chống oxy hóa in vitro mẫu chiết từ Tỏa dương 112 Bảng 3.30 Ảnh hưởng phân đoạn tiềm chất phân lập tiềm lên mức độ phù chân chuột theo thời gian .113 Bảng 3.31 Ảnh hưởng phân đoạn chất phân lập tiềm lên khối lượng u hạt chuột cống trắng .116 Bảng 4.1 Các chất phân lập từ Tỏa dương 120 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, xu hướng nghiên cứu phát triển thuốc từ loại dược liệu thơng qua việc tìm kiếm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học ngày nhà khoa học giới Việt Nam quan tâm Từ dược liệu sử dụng nhiều dân gian, nhà khoa học có nhiều cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học chúng, từ mở nhiều hướng nghiên cứu phát triển thuốc nhằm hỗ trợ điều trị bệnh Ở Việt Nam, có nhiều lồi thuộc chi Dó đất (Balanophora), họ Dó đất (Balanophoraceae) sử dụng nhiều dân gian dùng làm thuốc bổ, kích thích tiêu hóa tăng cường khả sinh dục …, lồi Tỏa dương B laxiflora dùng phổ biến Khoảng chục năm gần đây, loài khai thác buôn bán nhiều tỉnh miền núi (Lào Cai, Sơn La, Cao Bằng, Yên Bái, Hà Giang …) đồng thời thu hút nhiều quan tâm người dân nhà khoa học Loài B laxiflora sử dụng làm thuốc chữa đau đầu, đau lưng, đinh nhọt, tăng cường khả sinh dục thuốc kích thích tiêu hóa phục hồi sức khỏe cho phụ nữ sau sinh [1] Các nghiên cứu thành phần hóa học lồi B laxiflora cho thấy có mặt nhóm chất như: tannin, lignan, flavonoid, terpenoid, steroid … Các cao chiết số hợp chất phân lập từ loài B laxiflora thể tác dụng chống viêm rõ rệt Cho đến nay, nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi B laxiflora Việt Nam cịn hạn chế, đặc biệt hoạt tính chống viêm lồi Chính vậy, nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học hoạt tính chống viêm loài B laxiflora Việt Nam tạo sở khoa học việc sử dụng tài nguyên thuốc này, đồng thời tạo tiền đề cho nghiên cứu việc tạo chế phẩm có hoạt tính sinh học cao phục vụ cơng tác bảo vệ, chăm sóc sức khỏe cộng đồng, luận án: “Nghiên cứu thực vật, thành phần hoá học tác dụng chớng viêm lồi Tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl.)” thực với mục tiêu sau: Xác định tên khoa học mô tả đặc điểm hình thái đặc điểm vi học Tỏa dương Nghiên cứu thành phần hóa học Tỏa dương Đánh giá tác dụng chống viêm cao toàn phần, cao phân đoạn số hợp chất phân lập từ Tỏa dương Để thực ba mục tiêu trên, đề tài tiến hành với nội dung sau đây: • Nghiên cứu thực vật - Mơ tả đặc điểm hình thái xác định tên khoa học mẫu nghiên cứu - Xác định đặc điểm giải phẫu số phận đặc điểm bột dược liệu Tỏa dương • Nghiên cứu hóa học - Định tính có mặt nhóm chất chủ yếu có Tỏa dương - Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc số hợp chất tinh khiết từ Tỏa dương • Nghiên cứu tác dụng chống viêm - Đánh giá tác dụng chống viêm chống oxy hóa in vitro cao chiết hợp chất phân lập từ Tỏa dương - Đánh giá tác dụng chống viêm in vivo (chống viêm cấp viêm mạn) cao chiết số hợp chất phân lập từ Tỏa dương PHỤ LỤC 24: DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT BL23 Cấu trúc hợp chất BL23 Phụ lục 24.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL23 Phụ lục 24.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL23 Phụ lục 24.3 Phổ DEPT hợp chất BL23 Phụ lục 24.4 Phổ ESI-MS hợp chất BL23 Phụ lục 24.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL23 Phụ lục 24.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL23 Phụ lục 24.3 Phổ DEPT hợp chất BL23 + Pic ion giả phân tử m/z: 465,0 [M+Na] (C30H50ONa) Phụ lục 24.4 Phổ ESI-MS hợp chất BL23 PHỤ LỤC 25: DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT BL24 Cấu trúc hợp chất BL24 Phụ lục 25.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL24 Phụ lục 25.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL24 Phụ lục 25.3 Phổ ESI-MS hợp chất BL24 Phụ lục 25.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL24 Phụ lục 25.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL24 + Pic ion giả phân tử m/z: 123,05 [M+H] (C30H51O) Inten.(x10,000,000) 123.05 164.15194.15 1.75 153.15 1.50 1.25 1.00 0.75 105.05 338.50 0.50 0.25 288.40 218.20 391.45 454.45 0.00 50 100 150 200 250 300 350 400 Phụ lục 25.3 Phổ ESI-MS hợp chất BL24 450 m/z PHỤ LỤC 26: DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT BL25 Cấu trúc hợp chất BL25 Phụ lục 26.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL25 Phụ lục 26.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL25 Phụ lục 26.3 Phổ ESI-MS hợp chất BL25 Phụ lục 26.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL25 Phụ lục 26.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL25 - Pic ion giả phân tử m/z: 135,1 [M-H] (C8H7O2) Inten.(x10,000,000) 2.00 135.10 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 339.25 349.25 0.50 311.20 0.25 377.30 175.05 0.00 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Phụ lục 26.3 Phổ ESI-MS hợp chất BL25 m/z PHỤ LỤC 27: DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT BL26 Cấu trúc hợp chất BL26 Phụ lục 27.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL26 Phụ lục 27.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL26 Phụ lục 27.3 Phổ DEPT hợp chất BL26 Phụ lục 27.4 Phổ ESI-MS hợp chất BL26 Phụ lục 27.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL26 Phụ lục 27.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL26 Phụ lục 27.3 Phổ DEPT hợp chất BL26 + Pic ion giả phân tử m/z: 127,5 [M+H] (C6H7O3) Phụ lục 27.4 Phổ ESI-MS hợp chất BL26 PHỤ LỤC 28: DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT BL27 Cấu trúc hợp chất BL27 Phụ lục 28.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL27 Phụ lục 28.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL27 Phụ lục 28.3 Phổ HR-ESI-MS hợp chất BL27 Phụ lục 28.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL27 Phụ lục 28.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL27 - Pic ion giả phân tử m/z: 427,1080 [M+HCOO] (C17H32O5) Phụ lục 28.3 Phổ HR-ESI-MS hợp chất BL27 ... học mô tả đặc điểm hình thái đặc điểm vi học Tỏa dương Nghiên cứu thành phần hóa học Tỏa dương Đánh giá tác dụng chống viêm cao toàn phần, cao phân đoạn số hợp chất phân lập từ Tỏa dương Để thực. .. thấy thành phần hóa học lồi B laxiflora đa dạng, gồm đầy đủ nhóm hợp chất giống thành phần loài thuộc chi 28 1.2.3 Tác dụng sinh học loài Tỏa dương (Balanophora laxiflora) Tác dụng chống viêm. .. tính sinh học cao phục vụ cơng tác bảo vệ, chăm sóc sức khỏe cộng đồng, luận án: ? ?Nghiên cứu thực vật, thành phần hoá học tác dụng chớng viêm lồi Tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl.)” thực với