TCNCYH 23 (3) 2003 Tìm hiểu R-plasmid ở một số chủng Salmonella typhi phân lập tại Hà Nội, Huế và thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đắc Trung 1 , Lê Văn Phủng 2 và Lê Huy Chính 2 1 Đại học Y Thái Nguyên 2 Đại học Y Hà Nội Các chủng Salmonella typhi đa đề kháng hiện đã lan tràn tới hầu hết các vùng trong cả nớc. Nghiên cứu đã dùng 90 chủng Salmonella typhi phân lập từ Hà Nội, Huế và Thành phố Hồ Chí Minh để nghiên cứu về các plasmid của chúng. Kết quả cho thấy: Đã tìm thấy hai plasmid 120 Kb và 102 Kb ở các chủng kể trên, plasmid 120 Kb có 2 copy. Plasmid 120 Kb là một R-plasmid lớn, có khả năng tự truyền cho chủng khác và mang ít nhất 5 gene kháng kháng sinh: chloramphenicol, tetracycline, ampicillin, trimethoprim và sulphamethoxazole. Phân tích bằng enzyme hạn chế EcoR I cho thấy, các R-plasmid từ các chủng Salmonella phân lập ở Hà Nội, Huế và Thành phố Hồ Chí Minh đều giống nhau. I. đặt vấn đề Thơng hàn là một bệnh truyền nhiễm hay gây thành dịch, do một số loài thuộc giống Salmonella gây nên, trong đó hay gặp nhất là do Salmonella typhi. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy S. typhi đề kháng kháng sinh chủ yếu qua R- plasmid- đó là những phân tử ADN mang thông tin di truyền nằm ngoài nhiễm sắc thể với các gen mã hoá cho sự đề kháng nhiều kháng sinh khác nhau. Cho đến nay, tại Việt Nam, S. typhi kháng đa kháng sinh đã xuất hiện ở nhiều tỉnh, thành phố và đã gây nhiều ổ dịch thơng hàn lu hành trong toàn quốc [1]. Mức độ và kiểu cách kháng thuốc của vi khuẩn cũng ngày một gia tăng và phức tạp. Đứng trớc thực trạng đó, việc giám sát tỷ lệ và mức độ kháng thuốc của vi khuẩn đã đợc tiến hành thờng xuyên tại nhiều khu vực. Tuy vậy, những nghiên cứu về cơ chế đề kháng cũng nh phơng thức lan truyền tính kháng thuốc của vi khuẩn ở cộng đồng và trong bệnh viện còn rất hạn chế. Để góp phần làm rõ thêm về vấn đề này, chúng tôi tiến hành đề tài với mục tiêu: 1. Tìm hiểu về plasmid ở S. typhi và nghiên cứu một số đặc điểm của chúng (độ lớn, số lợng các bản sao). 2. Xác định R-plasmid tự truyền ở các chủng S. typhi đa đề kháng qua tiếp hợp. 3. So sánh R-plasmid tự truyền của các chủng S. typhi phân lập từ những vùng khác nhau trong nớc. II. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng nghiên cứu 90 chủng S. typhi đợc phân lập từ các bệnh nhân thơng hàn: - Hà Nội : 30 chủng 32 TCNCYH 23 (3) 2003 - Huế : 30 chủng - Tp Hồ Chí Minh : 30 chủng Những chủng S. typhi đợc nghiên cứu đều đã đợc xác định mức độ nhạy cảm với 4 kháng sinh: chloramphenicol (CHL), ampicillin (AMP), tetracycline (TET) và co-trimoxazole (SXT). Những chủng kháng CHL đều là những chủng đa kháng thuốc (kháng với 2 kháng sinh trở lên). 2. Vật liệu * Chủng vi khuẩn mẫu: Do trờng đại học Gifu, Nhật Bản cung cấp (40-Tsukasa-machi, Gifu, Japan), gồm E.coli V517 (mang 8 plasmid mẫu, đã biết trớc kích cỡ) và E.coli GGS 75 (nhạy cảm với CHL, kháng với Nalidixic axit). * Enzyme hạn chế EcoR I (BioRad, Pháp) * Kháng sinh bột và khoanh giấy kháng sinh (Meiji, Nhật Bản). 3. Phơng pháp nghiên cứu 3.1. Xác định lại các chủng S. typhi: Theo thờng quy chuẩn của WHO [9] 3.2. Kỹ thuật tách chiết ADN và nghiên cứu về plasmid: Theo phơng pháp của Kado và Liu [6]. - Xác định kích cỡ plasmid qua điện di trên gel agarose 0,8% và tính toán bằng đồ thị trên thang logarit. - Xác định số lợng bản sao các plasmid theo công thức: % ADN plasmid Kích cỡ chromosome Số lợng bản sao = % ADN chromosome x Kích cỡ plasmid 3.3. Xác định R-plasmid tự truyền qua tiếp hợp: Theo Roy Curtiss (1981) [8]. III. Kết quả 1. Tỷ lệ mang plasmid ở 90 chủng S. typhi phân lập tại Hà Nội, Huế và Tp Hồ Chí Minh: Số lợng plasmid CHL (n=90) 0 1 2 Nhạy cảm 20 1 0 21 Đề kháng 6 31 32 69 26 32 32 90 % 28,8 35,6 35,6 - 64/ 90 chủng S. typhi (71,1%) có plasmid. - 63/ 69 chủng S. typhi kháng CHL (91,3%) có plasmid. - 6/ 69 chủng S. typhi kháng CHL (8,7%) không tìm thấy plasmid, 6 chủng này là những chủng đặc biệt. Chúng đa kháng thuốc (theo hồ sơ) nhng lại không tìm thấy plasmid nào, vì vậy, chúng đã đợc kiểm tra lại mức độ nhạy cảm với 4 kháng sinh CHL, AMP, TET và SXT. Kết quả cho thấy có 1 chủng trở nên nhạy cảm với các kháng sinh đợc thử, 5 chủng còn lại vẫn giữ nguyên khả năng đề kháng. 2. Số lợng và độ lớn plasmid Sau khi tiến hành tách chiết plasmid theo quy trình của Kado và Liu và quan sát trên điện di gel agarose chúng tôi đã xác định đợc sự xuất hiện của 2 loại plasmid ở các chủng S. typhi đợc nghiên cứu (Hình 1). 33 TCNCYH 23 (3) 2003 Hình 1 : Hai loại plasmid ở Salmonella typhi 1. S. typhi VCMM 1142 4. S. typhi VCMM 1022 7. S. typhi VCMM 465 2. S. typhi VCMM 250 5. S. typhi VCMM 1024 8. S. typhi VCMM 466 3. S. typhi VCMM 254 6. S. typhi VCMM 463 9. S. typhi VCMM 1048 10. S. typhi VCMM 470 11. S. typhi VCMM 468 (chủng nhạy cảm) - Loại plasmid thứ nhất xuất hiện ở đa số những chủng S. typhi đa kháng thuốc phân lập ở cả ba khu vực đợc nghiên cứu. Qua điện di trên gel agarose, ở các chủng đa kháng thuốc, chúng tôi thấy băng ADN plasmid này đều xuất hiện ở một vị trí giống nhau. Việc lập đồ thị logarit biểu diễn mối tơng quan giữa kích cỡ plasmid và khoảng cách điện di tơng đối của chúng đã cho phép chúng tôi xác định đợc kích cỡ của plasmid này là khoảng 120 Kb. Plasmid 120 Kb này đều không thấy xuất hiện ở bất kỳ một chủng S. typhi nhạy cảm CHL nào đợc nghiên cứu. - Ngoài plasmid 120 Kb kể trên, qua nghiên cứu chúng tôi cũng đã xác định đợc plasmid thứ 2 với kích cỡ khoảng 102 Kb (Hình 1). Plasmid 102 Kb không tồn tại riêng rẽ mà thờng đi kèm với plasmid 120 Kb ở những chủng đa kháng thuốc này. Tuy nhiên, plasmid này còn đợc tìm thấy duy nhất ở một chủng S. typhi nhạy cảm CHL phân lập tại Huế. Nh vậy, có thể sơ bộ nghĩ rằng plasmid này không mang gen kháng thuốc. 3. Số lợng bản sao plasmid 120 Kb Trên cơ sở kết quả tỷ lệ ADN của plasmid và chromosome tơng ứng qua phép đo mật độ màu hai thành phần này, kích cỡ plasmid và chromosome của chủng S. typhi đã biết, cho phép chúng tôi xác định đợc số bản sao đặc trng so với chromosome của plasmid 120 Kb là 2. 4. R-plasmid tự truyền ở S. typhi đa kháng thuốc Sự xuất hiện phổ biến của plasmid 120 Kb ở đa số những chủng S. typhi đa kháng thuốc phân lập tại Hà Nội, Huế và Tp Hồ Chí Minh, cũng nh kích cỡ và số lợng bản sao của plasmid này cho phép hiểu rằng đây có thể là một plasmid tiếp hợp mang một số gen kháng thuốc của vi khuẩn (R-plasmid tự truyền). Để xác định vai trò của plasmid này trong cơ chế đề kháng cũng nh sự lan truyền của một số gen kháng kháng sinh ở S. typhi, chúng tôi đã tiến hành thực nghiệm tiếp hợp giữa một chủng S. typhi kháng CHL (mang 1 plasmid 120 Kb) nhng nhạy cảm NAL với chủng 34 TCNCYH 23 (3) 2003 E.coli GGS 75 nhạy cảm CHL (không mang plasmid) nhng kháng NAL. Kết quả thực nghiệm tiếp hợp cho thấy tính kháng thuốc của S. typhi đã đợc truyền sang cho chủng E.coli GGS 75 thông qua R-plasmid 120 Kb. Các gen đề kháng với những kháng sinh thông thờng (CHL, AMP, TET và SXT) đợc theo dõi cùng nằm trên plasmid này và plasmid này đã đợc truyền hoàn chỉnh sang chủng nhận E.coli (vì ở chủng vi khuẩn lai xuất hiện một băng ADN có cùng vị trí với băng plasmid 120 Kb ở chủng S. typhi trớc khi mang vào tiếp hợp (Hình 2). Hình 2 : Kết quả tách chiết ADN plasmid sau thực nghiệm tiếp hợp 1. E. coli V517 (chứng plasmid) 2. E. coli GGS 75 3. S. typhi VCMM 250 4. E. coli lai 5. Kết quả phân tích R-plasmid tự truyền bằng enzyme hạn chế: Nghiên cứu bớc đầu dùng enzyme hạn chế EcoR I phân tích R-plasmid 120 Kb ở 3 chủng S. typhi đa kháng thuốc phân lập tại Hà Nội, Huế và Tp Hồ Chí Minh đợc trình bày trong hình 3. Hình 3. Các mảnh cắt plasmid bằng EcoR I 1. Hà Nội; 2. Huế; 3. Kiên Giang Có thể thấy, hình ảnh các mảnh cắt các plasmid ở 3 vùng khác nhau là giống nhau. Iv. Bàn luận 1. Tỷ lệ mang plasmid ở S. typhi: Trong số 69 chủng S. typhi đa đề kháng đợc nghiên cứu, đã tìm thấy 2 loại plasmid. Có 63 (91,3%) chủng có mang ít nhất 1 plasmid còn 6 chủng không tìm thấy plasmid nào. Hiện tợng vi khuẩn đề kháng trở nên nhạy cảm với các kháng sinh sau một thời gian dài lu giữ và cấy chuyển đã đợc y văn ghi nhận từ lâu. Trong nghiên cứu này, 1 chủng S. typhi đã có hiện tợng nh vậy, hiện tợng này đợc giải thích là do chúng đã mất các gen đề kháng với những kháng sinh đó khi giữ chúng trong những điều kiện không có áp lực chọn lọc. Còn hiện tợng không tìm thấy plasmid và giữ nguyên khả năng đề kháng với các kháng sinh thông thờng (nghĩa là các gen kháng thuốc 35 TCNCYH 23 (3) 2003 vẫn tồn tại trong tế bào vi khuẩn) ở 5 chủng S. typhi còn lại có thể do các plasmid đã bị phân ly thành những thành phần có kích cỡ nhỏ hơn [2], nên với kỹ thuật tách chiết plasmid đã sử dụng, không phát hiện đợc; hoặc có thể do các transposon mang các gen kháng thuốc đã chuyển vị trí từ R-plasmid vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn [3, 5]. 2. Đặc điểm của các plasmid: Plasmid lớn thờng có cấu tạo gồm đầy đủ các thành phần cần thiết để có thể tự truyền cho vi khuẩn khác [3, 4]. Plasmid 120 kb trong nghiên cứu này cũng là một plasmid lớn và đã đợc chứng minh là có khả năng tự truyền: plasmid này xuất hiện ở các chủng lai (Hình 2) sau khi tiếp hợp mà không cần tác động bằng bất cứ điều kiện nào khác. Số lợng bản sao plasmid này rất thấp (2 bản sao) phù hợp với quy luật thờng thấy ở vi khuẩn: kích cỡ plasmid thờng tỷ lệ nghịch với số các bản sao và số các bản sao plasmid là hằng định ở một loài vi khuẩn nhất định, ví dụ 2 plasmid: pBR322 (kích cỡ 4,36 Kb) có 15-20 bản sao, pUC (kích cỡ 2,69 Kb) có tới 500-700 bản sao [7]. Plasmid 120 kb chỉ xuất hiện ở các chủng đa đề kháng, không thấy ở bất cứ chủng nhạy cảm nào. Nh vậy, plasmid này có liên quan tới cơ chế đề kháng cũng nh sự lan truyền của một số gen kháng thuốc ở những chủng S. typhi này. Những chủng nhận đợc plasmid này sau tiếp hợp đều trở nên đề kháng với các kháng sinh vốn trớc đó chúng vẫn nhạy cảm, đồng thời, kiểu cách đề kháng của các chủng lai giống hệt kiểu cách đề kháng của các chủng cho; vì vậy, plasmid đã truyền này đã mang các gene đề kháng. Những plasmid nh thế, trong y văn gọi là các R-plasmid [3]. 3. So sánh các plasmid tự truyền: Trên điện di gel agarose các plasmid 120 Kb sau khi cắt bằng EcoR I đều xuất hiện các băng (mảnh cắt) với số lợng và vị trí giống nhau. Tuy cha có điều kiện xác định chính xác kích cỡ của các mảnh cắt, song có thể thấy rõ trên Hình 3: 3 plasmid ở 3 chủng S. typhi đa kháng thuốc phân lập tại ba khu vực khác nhau đều giống nhau. Các R-plasmid tự truyền, giống nhau là một chỉ điểm dịch tễ học phân tử quan trọng để coi chúng có cùng một nguồn gốc. Nh vậy, với việc bùng phát dịch thơng hàn kháng thuốc từ Kiên Giang năm 1993, có thể coi Kiên Giang đã là nguồn gốc của các chủng S. typhi đa đề kháng và từ đó, chúng lan tràn ra cả nớc. Phân tích nh trên, một lần nữa, nhắc nhở chúng ta phải dùng kháng sinh thận trọng, phải giữ vệ sinh môi trờng tốt để tránh sự xuất hiện và lan tràn các chủng vi khuẩn kháng thuốc, gây ra những hậu quả trầm trọng. V. Kết luận 1. 2. 3. Hai plasmid với kích cỡ khoảng 120 Kb và 102 Kb đã đợc tìm thấy ở các chủng S. typhi phân lập tại ba khu vực đợc nghiên cứu. Plasmid 120 Kb có 2 bản sao. Plasmid 120 Kb là một R- plasmid tự truyền, mang ít nhất các gen đề kháng với chloramphenicol, ampicillin, tetracycline và trimethoprim/sulfamethoxazole. Qua tiếp hợp, toàn bộ kiểu cách đề kháng này của S. typhi đã đợc truyền sang chủng nhận E. coli thông qua R-plasmid 120 Kb. Phân tích bớc đầu R-plasmid tự truyền ở các chủng S. typhi phân lập tại ba khu vực bằng enzyme hạn chế EcoRI, sơ bộ cho thấy các R-plasmid giống nhau. Tài liệu tham khảo 1. Lê Đăng Hà (1996): Tình hình thơng hàn đa kháng thuốc tại viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới (1988-1995). Bộ Y tế, Viện YHLSCBNĐ. Tài liệu tập huấn. 2. Chopra G. S., Basu S. K., Bhattacharya S. R (1992): Present phage types and antibiotic 36 TCNCYH 23 (3) 2003 susceptibility of Salmonella. Indian J Pathol Microbiol. 35 (4): 345-350. 3. Fox A. P.: Bacterial Genetics. In: Medical microbiology. 2nd ed. Edit. by Murray P. R., Kobayashi G. S., Pfaller M. A., Rosenthal K. S. Missouri: Mosby. 1994: 28-45. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Hoa N. T., Diep T. S., Wain J. et al (1998): Community-acquired septicaemia in southern Viet Nam: the importance of multidrug- resistant Salmonella typhi. Trans R Soc Trop Med Hyg. 92 (5): 503-508. Holmes R. K. (1986): Genitics. In: Medical microbiology. 2 nd ed. Edit. by Baron S. California: Addison-Wesley. 243: 261-264. Kado C. I., Liu S. T. (1981): Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J Bacteriol. 145: 1365- 1373. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. (1989): Molecular cloning. A laboratory manual. 2nd ed, Vol 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Roy Curtiss (1981): Gene Transfer, Mannal of Methods for General Bacterilogy, American Society for Microbiology, 14: 243- 265. WHO (1991). Blood culture. In: Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology. 21-25. C¶m ¬n: C«ng tr×nh nµy ®−îc thùc hiÖn t¹i labo Trung t©m Y sinh häc vµ bé m«n Vi sinh Y häc tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi. Summary r-plasmid in several salmonella typhi strains isolated from Ha Noi, Hue and Ho Chi Minh city The multi-antibiotic resistant Salmonella typhi strains have already spread over the country. Authors analysed 90 Salmonella typhi strains isolated in Ha Noi, Hue and Ho Chi Minh city and had some observation as follows. - Two plasmids with size about 120 kilobase (Kb) and 102 Kb had been found in S. typhi strains isolated in 3 studied areas. Plasmid 120 Kb had two copies. - Plasmid 120 Kb is a conjugated R-plasmid and carrying at least antibiotic resistant genes to chloramphenicol, ampicillin, tetracycline and trimethoprim/sulfamethoxazole. By conjugation, all the resistant genes of S. typhi were transferred to recipient E. coli strains through R-plasmid 120 Kb. Through the initial analysis on the R-plasmids in S. typhi strains isolated in 3 areas by a restricted enzyme of EcoR I, we saw that these self-transmitted R-plasmids may have the same origin. 37 . TCNCYH 23 (3) 2003 Tìm hiểu R-plasmid ở một số chủng Salmonella typhi phân lập tại Hà Nội, Huế và thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đắc Trung 1 , Lê Văn Phủng 2 và Lê Huy Chính 2 1 Đại học. các chủng Salmonella phân lập ở Hà Nội, Huế và Thành phố Hồ Chí Minh đều giống nhau. I. đặt vấn đề Thơng hàn là một bệnh truyền nhiễm hay gây thành dịch, do một số loài thuộc giống Salmonella. Y Hà Nội Các chủng Salmonella typhi đa đề kháng hiện đã lan tràn tới hầu hết các vùng trong cả nớc. Nghiên cứu đã dùng 90 chủng Salmonella typhi phân lập từ Hà Nội, Huế và Thành phố Hồ Chí