Hiệu quả của PCR trong phát hiện M. Tuberculosis trực tiếp trong bệnh phẩm soi kính âm tính của bệnh nhân lao ppt

TCNCYH 23 (3) 2003 Hiệu quả của PCR trong phát hiện M. tuberculosis trực tiếp trong bệnh phẩm soi kính âm tính của bệnh nhân lao Hồ Minh Lý 1 , Nguyễn Vân Anh 1 , Phạm Kim Liên 1 , Nguyễn Hiền Anh 1 , Nguyễn Kim Trinh 1 , Đặng Đức Anh 1 , Nguyễn Văn Thiêm 2 1 Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ơng 2 Học viện quân y 103, Hà Nội PCR đợc áp dụng để xác định M. tuberculosis trực tiếp trong bệnh phẩm của 254 bệnh nhân lao và 60 bệnh phẩm của bệnh nhân nhóm chứng. Tất cả các bệnh nhân lao đều có kết quả âm tính với trực khuẩn kháng cồn, kháng axit (AFB) bằng soi kính hiển vi trực tiếp. Bệnh phẩm nhóm chứng bao gồm dịch não tuỷ, dịch màng phổi, và dịch rửa phế quản của bệnh nhân có căn nguyên ngoài lao. Đối với bệnh phẩm của bệnh nhân lao, PCR đã phát hiện đợc M. tuberculosis trong 60/100 (60%) bệnh phẩm đờm , 35/41 (85%) bệnh phẩm dịch rửa phế quản, 60/86 (70%) bệnh phẩm dịch não tuỷ và 19/27 (70%) bệnh phẩm dịch màng phổi, đạt độ nhậy chung là 69%. PCR chỉ cho dơng tính giả với 2 trong số 60 bệnh phẩm nhóm chứng, đạt độ đặc hiệu chung là 97%. Đối với các bệnh phẩm có kết quả nuôi cấy âm tính, PCR phát hiện đợc M. tuberculosis trong 81/118 trờng hợp đạt 69%. Tất cả các trờng hợp nuôi cấy dơng tính, ngoại trừ một mẫu dịch não tuỷ và hai mẫu dịch rửa phế quản, đều có phản ứng PCR dơng tính. Kết quả cho thấy PCR là một trong những công cụ có thể cải thiện khả năng chẩn đoán bệnh lao bao gồm cả lao phổi và lao ngoài phổi, đặc biệt là các trờng hợp AFB âm tính bằng soi kính. I. Đặt vấn đề Chẩn đoán lao phổi và lao ngoài phổi âm tính với trực khuẩn kháng cồn kháng toan (AFB) luôn là một thách thức khi mà kỹ thuật chẩn đoán phòng thí nghiệm chủ yếu cho các trờng hợp soi kính âm tính vẫn là nuôi cấy cổ điển. Do thời gian chờ đợi kéo dài (4-8 tuần) trong khi độ nhậy cũng không cao đặc biệt đối với lao ngoài phổi [1, 2, 3], các nhà lâm sàng nhiều khi phải áp dụng phơng pháp điều trị thử hoặc quyết định điều trị chỉ dựa trên triệu chứng lâm sàng. Hệ thống đo phóng xạ BACTEC ra đời cho phép phát hiện sớm quá trình mọc của vi khuẩn nhờ cơ chất có đánh dấu phóng xạ giúp làm giảm thời gian chờ đợi xuống còn một nửa. Tuy vậy do chi phí mua sắm cao và khó khăn trong xử lý chất thải phóng xạ, việc sử dụng vẫn còn hạn chế [4]. PCR là một kỹ thuật có thể thực hiện nhanh trong vòng 1-2 ngày, nhng lại có khả năng sao chép trình tự đặc hiệu trên genome của vi khuẩn từ một vài bản lên hàng trăm triệu đến hàng tỷ phiên bản. Trong khi soi kính chỉ xác định đợc vi khuẩn ở nồng độ tối thiểu 10 5 / 1 ml bệnh phẩm, PCR cho phép xác định vi khuẩn ở nồng độ rất thấp chỉ 1-3 vi khuẩn trong 1 bệnh phẩm [1]. PCR do vậy đợc đánh giá là một công cụ có giá trị trong chẩn đoán các bệnh nhiễm khuẩn trong đó có bệnh lao. Tuy nhiên cho đến nay việc sử dụng PCR trong chẩn đoán lao mới đợc áp dụng hạn chế ở một số phòng thí nghiệm lớn ở Việt Nam. Hiệu quả 14 TCNCYH 23 (3) 2003 và tính năng áp dụng của phơng pháp còn cha đợc nhiều nghiên cứu đề cấp đến một cách toàn diện, đặc biệt trong chẩn đoán lao AFB âm tính. Mục tiêu của nghiên cứu là: Đánh giá hiệu quả kỹ thuật PCR trong phát hiện M. tuberculosis trực tiếp trong bệnh phẩm soi kính âm tính với trực khuẩn kháng cồn kháng axit của bệnh nhân lao. II. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 1. Vật liệu: Vật liệu bao gồm 254 bệnh phẩm của bệnh nhân lao và 60 bệnh phẩm của bệnh nhân nhóm chứng đợc điều trị tại viện Lao trung ơng, bệnh viện Bạch Mai, viện Nhi trung ơng, viện Quân Y 103 và trung tâm Chống lao Hà Nội. Bệnh phẩm của bệnh nhân lao bao gồm 100 mẫu đờm, 41 mẫu dịch rửa phế quản, 86 mẫu dịch não tuỷ và 27 mẫu dịch màng phổi. Tất cả các bệnh nhân này đều có kết quả AFB âm tính bằng soi kính hiển vi trực tiếp và sau này đều đợc chẩn đoán là bệnh nhân lao dựa vào kết luận cuối cùng kết hợp các kết quả thăm khám lâm sàng và các xét nghiệm khác. Bệnh phẩm nhóm chứng bao gồm 37 mẫu dịch não tuỷ của bệnh nhân viêm màng não có căn nguyên ngoài lao, 13 bệnh phẩm dịch màng phổi của bệnh nhân tràn dịch màng phổi do ung th và 10 bệnh phẩm dịch rửa phế quản của bệnh nhân viêm phế quản không do lao. 2. Phơng pháp nghiên cứu: Tất cả các bệnh phẩm trên đợc thu thập trong thời gian nghiên cứu (1997-2001) riêng lẻ cho từng trờng hợp tại các bệnh viện mà bệnh nhân đến điều trị. Bệnh phẩm đợc gửi cùng ngày về phòng thí nghiệm Mycobacteria viện Vệ sinh dịch tễ trung ơng không kèm theo thông tin về lâm sàng của bệnh nhân. Tất cả các bệnh phẩm đều đợc chẩn đoán bằng kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi Pt18 và INS2 đặc hiệu cho trình tự trên IS6110 của vi khuẩn lao nhóm điển hình. Trừ bệnh phẩm đờm, tất cả các bệnh phẩm đều đợc tiến hành nuôi cấy phân lập song song với PCR tại đây. Kết quả PCR đợc đối chiếu với kết luận cuối cùng của lâm sàng tại thời điểm bệnh nhân ra viện đồng thời so sánh với nuôi cấy. Các tính toán thống kê cũng đợc sử dụng để so sánh kết quả. III. Kết quả Tất cả các bệnh phẩm kể cả bệnh phẩm của bệnh nhân lao và bệnh nhân không lao nhóm chứng đều đợc xử lý tách chiết DNA, chạy PCR và điện di xác định kết quả trên gel agarose. Bệnh phẩm dơng tính là bệnh phẩm cho vạch trên gel điện di đặc hiệu cho đoạn trình tự axit nucleic trên IS6110 đợc sao chép với cặp đoạn mồi sử dụng. Tỷ lệ dơng tính với PCR đối với mỗi loại bệnh phẩm của các bệnh nhân mắc các thể lao khác nhau bao gồm lao màng não, lao tràn dịch màng phổi, lao phổi, và bệnh nhân nhóm chứng đợc trình bầy ở bảng 1. Bảng 1. Kết quả PCR xác định M. tuberculosis trong bệnh phẩm của bệnh nhân lao và bệnh nhân nhóm chứng Bệnh phẩm PCR (+) Se (%) Sp(%) Bệnh nhân lao Đờm DRPQ DMP DNT 60/100 35/41 19/27 60/86 174/254 60 85 70 70 69 90 100 97 96 Bệnh nhân chứng DNT DMP DRPQ 1/37 0/13 1/10 DRPQ: dịch rửa phế quản; DMP: dịch màng phổi; DNT: dịch não tuỷ 15 TCNCYH 23 (3) 2003 Đối với bệnh phẩm của bệnh nhân lao, PCR phát hiện đợc M. tuberculosis trong 60/100 (60%) bệnh phẩm đờm , 35/41 (85%) bệnh phẩm dịch rửa phế quản, 60/86 (70%) bệnh phẩm dịch não tuỷ và 19/27 (70%) bệnh phẩm dịch màng phổi, đạt độ nhậy chung là 69%. PCR chỉ cho dơng tính giả với 2 trong số 60 bệnh phẩm nhóm chứng, bao gồm một mẫu dịch não tuỷ của bệnh nhân viêm màng não mủ và một mẫu dịch rửa phế quản của bệnh nhân viêm phế quản không do lao. Nh vậy độ đặc hiệu dao động từ 90% đến 100%, đạt độ đặc hiệu chung 96% (bảng 1). So với kết quả nuôi cấy, PCR có độ nhậy cao hơn một cách có ý nghĩa ở nhóm bệnh nhân lao màng não và bệnh nhân tràn dịch màng phổi do lao (P<0.01, 2 ), tuy nhiên lại không cao hơn một cách có ý nghĩa thống kê ở nhóm bệnh nhân lao phổi với bệnh phẩm là dịch rửa phế quản (bảng 2). Do không có điều kiện nuôi cấy phân lập bệnh phẩm đờm vào thời điểm nghiên cứu nên số liệu về nuôi cấy đối với loại bệnh phẩm này của bệnh nhân lao phổi AFB âm tính với soi kính không đợc trình bầy ở đây. Bảng 2. Kết quả của PCR so với nuôi cấy Bệnh nhân Bệnh phẩm PCR dơng tính Nuôi cấy dơng tính P Lao màng não Lao tràn dịch màng phổi Lao phổi DNT DMP DRPQ 60/ 86 (70%) 19/27 (70%) 35/41 (85%) 4/86 (5%) 2/ 27 (7%) 30/41 (73%) P<0.01 P<0.01 P>0.05 DRPQ: dịch rửa phế quản; DMP: dịch màng phổi; DNT: dịch não tuỷ Đối với bệnh phẩm nuôi cấy dơng tính PCR cho dơng tính với 33/36 trờng hợp (92%). Đối với bệnh phẩm có kết quả nuôi cấy âm tính PCR cho dơng tính với 17/25 (68%) bệnh phẩm dịch màng phổi, 56/82 (68%) bệnh phẩm dịch não tuỷ và 8/11 (73%) bệnh phẩm dịch rửa phế quản cho tỷ lệ chung là 69% (bảng 3). Bảng 3. Kết quả PCR trên bệnh phẩm nuôi cấy dơng tính và bệnh phẩm nuôi cấy âm tính PCR Dơng tính Âm tính Tổng số Nuôi cấy Dơng tính Âm tính 33 (92%) 81 (69%) 3 37 36 (100%) 118 (100%) Tổng số 114 40 154 So sánh tỷ lệ dơng tính của PCR trên nhóm bệnh nhân đã điều trị và cha điều trị thuốc lao cho thấy việc điều trị có thể ảnh hởng đến kết quả PCR trên bệnh nhân lao màng não. Tỷ lệ dơng tính của PCR trên nhóm bệnh nhân cha điều trị thuốc lao (84%) cao hơn có ý nghĩa so với nhóm bệnh nhân đã điều trị (33%) (P<0.01). Đối với bệnh nhân tràn dịch màng phổi do lao, tỷ lệ dơng tính với PCR không khác nhau có ý nghĩa giữa hai nhóm này (P>0.05, 2 ) (bảng 4). Tuy nhiên kết quả PCR trên nhóm bệnh nhân đợc điều trị thuốc lao trong thời gian dới hoặc bằng 10 ngày và nhóm bệnh nhân đã đợc điều trị trên 10 ngày 16 TCNCYH 23 (3) 2003 ở bệnh nhân lao màng não không có sự khác biệt với tỷ lệ tơng ứng là 67% và 60% (P>0.05). Bảng 4. Liên quan giữa kết quả PCR với điều trị thuốc lao của bệnh nhân lao. Dơng tính PCR Bệnh nhân Đã điều trị (%) Cha điều trị (%) P Lao MN 8/24 (33%) 54/64 (84) <0.01 Lao TDMP 5/6 (83%) 17/24 (71%) >0.05 TDMP: tràn dịch màng phổi; MN: màng não IV. Bàn luận Việc cho ra đời một phơng pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả đã trở nên rất quan trọng và cấp thiết trong trong cuộc chiến đấu chống lại bệnh lao, đặc biệt đối với các thể lao ít vi khuẩn không thể phát hiện bàng phơng pháp soi kính. Trong nghiên cứu của chúng tôi độ nhậy của PCR đối với bệnh phẩm của bệnh nhân lao phổi và lao ngoài phổi AFB âm tính với soi kính dao động từ 60% đối với bệnh phẩm đờm, 70% đối với bệnh phẩm dịch não tuỷ, 70% đối với bệnh phẩm dịch màng phổi, tới 85% đối với bệnh phẩm dịch rửa phế quản của bệnh nhân lao phổi, cho độ nhậy chung là 69%. Độ đặc hiệu dao động từ 90% đối với dịch rửa phế quản, 97% đối với dịch não tuỷ, đến 100% đối với dịch màng phổi, cho độ đặc hiệu chung là 96%. Khi so sánh với các phơng pháp khác cũng xác định M. tuberculosis trực tiếp từ bệnh phẩm, PCR có u thế hơn hẳn. So với nuôi cấy PCR có u thế về thời gian. Trong khi nuôi cấy phải chờ ít nhất 4 tuần để có kết quả thì độ nhậy trong nghiên cứu này cũng chỉ đạt từ 5% đến 73%. Soi kính cho kết quả ngay nhng lại không có giá trị trong các trờng hợp lao soi AFB âm tính. Khả năng phát hiện của PCR là 10 fg (10 - 14 g) DNA của M. tuberculosis trong một ống phản ứng (tơng đuơng với lợng DNA của 2 đến 3 vi khuẩn). Điều này có thể giải thích tại sao PCR lại đạt độ nhạy cao trong chẩn đoán lao, thậm chí lao có AFB âm tính với soi kính. Độ nhậy của PCR còn cao hơn hẳn so với nuôi cấy đặc biệt ở các thể lao ít vi khuẩn nhng lại nguy hiểm nh lao màng não, lao tràn dịch màng phổi (P<0.01). Trong nghiên cứu này PCR cho dơng tính với 69% trờng hợp bệnh phẩm có kết quả nuôi cấy âm tính. Tỷ lệ dơng tính của PCR trên nhóm bệnh nhân cha điều trị thuốc lao cao hơn một cách có ý nghĩa so với nhóm đã điều trị ở bệnh nhân lao màng não (P<0.01). Kết quả cho thấy việc điều trị có tác động loại bỏ vi khuẩn nhanh hơn ở bệnh nhân mắc thể lao này. Kết quả cũng phù hợp với một số nghiên cứu của tác giả nớc ngoài khi thấy rằng tỷ lệ dơng tính với PCR giảm hẳn ở bệnh nhân lao màng não sau khi đợc điều trị thuốc lao [5, 6]. V. Kết luận 1. PCR sử dụng đoạn mồi Pt18 và INS2 xác định trình tự đặc hiệu trên IS6110 của vi khuẩn lao nhóm điển hình M. tuberculosis cho độ nhậy từ 60% đền 85%, độ đặc hiệu từ 90% đến 100% đối với bệnh phẩm soi kính âm tính của bệnh nhân lao phổi và lao ngoài phổi. 2. So với nuôi cấy, độ nhậy của PCR cao hơn một cách có ý nghĩa đối với lao ngoài phổi (P<0.01) 17 TCNCYH 23 (3) 2003 3. PCR dơng tính với 69% bệnh phẩm có kết quả nuôi cấy âm tính. 4. Tỷ lệ dơng tính của PCR trên nhóm bệnh nhân cha điều trị thuốc lao cao hơn một cách có ý nghĩa so với nhóm đã điều trị ở bệnh nhân lao màng não (P<0.01). Nh vậy PCR là một kỹ thuật cho phép chẩn đoán nhanh bệnh lao với độ nhậy và độ đặc hiệu cao nhờ khả năng phát hiện vi khuẩn lao trực tiếp trong bệnh phẩm ngay ở nồng độ rất thấp. Thời gian để có kết quả chỉ trong vòng 1 đến 2 ngày. PCR thật sự là một công cụ hiệu quả để chẩn đoán các dạng lao khó chẩn đoán đặc biệt là lao có AFB âm tính với soi kính. TàI liệu tham khảo 1. Hồ Minh Lý, Đặng Đức Anh, Nguyên Kim Trinh, Nguyễn Vân Anh. Nguyễn Hiền Anh, Le Kim Tuyến, Hoàng Thi Phợng, Ngyễn Việt Cồ (1999): Chẩn đoán nhanh tràn dịch màng phổi nghi do lao bằng phản ứng PCR. Tạp chí Y học dự phòng. 1(39): 48-52. 2. Hồ Minh Lý, Đặng Đức Anh, Nguyễn Vân Anh. Nguyễn Hiền Anh, Nguyên Kim Trinh, Đặng Đức Trạch, Hoàng Thuỷ Long, Hoàng Thị Phợng, Nguyễn Thu Hà, Đặng Văn Khiêm, Nguyễn Thị Diễm Hồng, Nguyễn Quang Trung (2000): PCR trong chẩn đoán bệnh lao. Tuyển tập công trình viện Vệ sinh dịch tễ trung ơng 1997-2000, Nhà xuất bản Y học. Tr 200-204. 3. A. H. J. Kolk, A. R. J. Schuitema, S. Kuijper, J. van Leeuwen, P. W. M. Hermans, J. D. A. van Embden, and R. A. Hartskeerl (1992): Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by using polymerase chain reaction and a nonradioative detection system. J. Clin. Microbiol. 30: 2567- 2575. 4. Anargyros P., D. S. J. Astill, and I. S. L. Lim (1990): comparison of improved BACTEC and Lowenstein-Jensen media for culture of mycobacteria from clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 28: 1288-1291. 5. Bonington A, J. I. Strang, P. E. Klapper (1998): Use of Roche amplicor mycobacterium tuberculosis PCR in early diagnosis of tuberculous meningitis. J. Clin. Microbiol. 36: 1251-1254. 6. Lin J. J., H. J. Harn, Y. D. Hsu (1995): Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction assay of cerebrospinal fluid. J. Neurol. 242: 14. Summary Evaluation of polymerase chain reaction (PCR) for direct detection of M. tuberculosis in AFB smear negative clinical specimens of tuberculosis patients IS6110 based PCR was used for direct detection of M. Tuberculosis in clinical specimens obtained from 254 tuberculosis patients and from 60 other patients in control group. The tuberculous specimens included sputum samples, bronchial washes, cerebrospinal fluids, and pleural fluids. All these 254 patients were acid fast bacillus (AFB) smear negative and were diagnosed as tuberculosis according to clinical symptoms, biochemical criteria, biopsy or internal examination and response to therapy. The control specimens included 37 cerebrospinal fluids, 13 pleural fluids and 10 bronchial washes 18 TCNCYH 23 (3) 2003 taken from patients with pleural cancer, non-tuberculosis meningitis and bronchitis. The PCR could detect M. tuberculosis in 60/100 (60%) sputum samples, 35/41 (85%) bronchial washes, 60/86 (70%) cerebrospinal fluids and 19/27 (70%) pleural fluids. The overall sensitivity of the PCR for these AFB smear negative was 69%. False positive presented in only 2 out of 60 specimens of control group, the specificity therefore was 97%. PCR could detect M. tuberculosis in 81/118 (69%) culture negative specimens. Excepted one cerebrospinal fluid and two bronchial washes, all culture positive specimens were positive with PCR. The result demonstrate the usefulness of using PCR in rapid diagnosis of pulmonary and extra pulmonary tuberculosis, especially AFB smear negative cases. 19 . TCNCYH 23 (3) 2003 Hiệu quả của PCR trong phát hiện M. tuberculosis trực tiếp trong bệnh ph m soi kính m tính của bệnh nhân lao Hồ Minh Lý 1 , Nguyễn Vân Anh 1 , Ph m Kim Liên 1 , Nguyễn. M c tiêu của nghiên cứu là: Đánh giá hiệu quả kỹ thuật PCR trong phát hiện M. tuberculosis trực tiếp trong bệnh ph m soi kính m tính với trực khuẩn kháng cồn kháng axit của bệnh nhân lao. . bệnh nhân lao và 60 bệnh ph m của bệnh nhân nh m chứng. Tất cả các bệnh nhân lao đều có kết quả m tính với trực khuẩn kháng cồn, kháng axit (AFB) bằng soi kính hiển vi trực tiếp. Bệnh phẩm