Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu.Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu.Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu.Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu.Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu.Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu.Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu.Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu.Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu.Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu.Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Nguyễn Thị Minh Diệp NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ KHÁNG SINH THUỘC NHĨM FLUROQUINOLON TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG VÀ NƯỚC TIỂU Ngành: Hóa học Mã số: 9440112 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2022 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Xuân Trường GS.TS Trần Tứ Hiếu Phản biện 1:……………………………………… Phản biện 2: ……………………………………… Phản biện 3: ……………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp Trường Trường Đại học Bách khoa Hà Nội vào hồi .giờ .phút, ngày .tháng .năm ……… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Tạ Quang Bửu – Trường ĐHBK Hà Nội - Thư viện Quốc gia Việt Nam A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Fluoroquinolon (FQL) nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp có hiệu lực kháng khuẩn mạnh, phổ rộng, chống lại nhiều vi sinh vật gây bệnh nguy hiểm Chúng có tác dụng tốt với nhiều bệnh nhiễm khuẩn như: nhiễm trùng đường tiết niệu, đường tiêu hóa, hơ hấp, tình dục, da mơ mềm Các kháng sinh sử dụng phổ biến điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm tuyến tiền liệt, nhiễm trùng da, xương, nhiễm trùng đường ruột vi khuẩn bệnh chủng vi sinh vật kháng penicillin macrolid, dự phòng bệnh bạch cầu trung tính Tác dụng kháng khuẩn nhóm kháng sinh ức chế ADN gyrase, ngăn cản tổng hợp ADN vi khuẩn Ngoài ra, chúng tác dụng mARN nên ức chế tổng hợp protein vi khuẩn Do chế ức chế tổng hợp acid nucleic, nhóm kháng sinh cho nguy gây đột biến gen, gây sẩy thai cho người động vật mang thai sử dụng Các FQL sử dụng phổ biến điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu Hòa Kỳ Châu Âu ciproflxacin, levofloxacin, moxifloxacin norfloxacin Mức liều sử dụng quy định kháng sinh trên, giúp phân bố thuốc đạt nồng độ vị trí nhiễm trùng để thể tác dụng Tuy nhiên sử dụng liều chuẩn, dẫn tới phơi nhiễm mức số cá thể, thể nhiều tác dụng không mong muốn làm cho bệnh nhân không tuân thủ ngừng dùng thuốc Hoặc, số bệnh nhân bị thiếu hàm lượng thuốc vị trí tác dụng, dẫn đến thất bại điều trị Các yếu tố ảnh hưởng tới nồng độ tối ưu đích tác dụng đặc điểm sinh lý bệnh nhân, vi khuẩn gây bệnh, vị trí nhiễm trùng, dược động học, dược lực học thuốc Trong phân tích FQL, nhiều phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với kỹ thuật phát khác áp dụng Phổ biến HPLC ghép nối với detector UV hay PDA, huỳnh quang (FLD) khối phổ (MS) Để phân tích FQL chế phẩm bào chế thường đơn giản, cần hòa tan dược chất, pha lỗng cần sau phân tích hệ thống HPLC Đối với mẫu dịch sinh học huyết tương, dịch mật, nước tiểu, nước bọt phức tạp lẫn nhiều tạp có nồng độ thấp khó phát Do đó, cần có phương pháp thích hợp để chiết xuất chất phân tích khỏi mẫu, đồng thời loại tạp gây nhiễu Phương pháp phân tích đồng thời FQL xây dựng với ưu điểm dùng phương pháp, điều kiện áp dụng để định lượng FQL khác Tuy nhiên, việc lựa chọn tối ưu điều kiện phân tích cho FQL khác gặp khó khăn tính chất khác chúng Việc theo dõi đánh giá dược động học kháng sinh FQL công cụ hữu ích để tránh thất bại sử dụng thuốc điều trị bệnh nhiễm khuẩn Do đó, xây dựng phương pháp phân tích xác định hàm lượng kháng sinh dịch sinh học người bệnh cần thiết Các phương pháp đề xuất phù hợp với điều kiện kỹ thuật sẵn có sở y tế, góp phần ứng dụng thành cơng điều trị bệnh nhiễm khuẩn kháng sinh FQL Căn điều kiện thực tế phòng thí nghiệm, kiểm nghiệm, phịng nghiên cứu Việt Nam vai trị việc phân tích hàm lượng kháng sinh dịch sinh học, đề xuất thực đề tài luận án tiến sỹ có tên: “Nghiên cứu phân tích số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon mẫu huyết tương nước tiểu ” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN Phát triển phương pháp phân tích định lượng thuốc kháng sinh fluoroquinolon dịch sinh học hai phương pháp khác phương pháp quang phổ huỳnh quang (FLS) phương pháp sắc ký hỏng hiệu cao (HPLC), cụ thể sau: Xây dựng quy trình xác định hàm lượng moxifloxacin mẫu huyết tương phương pháp HPLC –PDA Xây dựng quy trình xác định hàm lượng moxifloxacin huyết tương phương pháp FLS Xây dựng quy trình tách xác định đồng thời bốn fluoroquinolon (norfloxacin, ciprocaxin, levofloxacin, moxifloxaxin) huyết tương nước tiểu phương pháp HPLC-FLD ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: bốn loại kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon hệ 2, gồm norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin moxifloxacin mẫu huyết tương nước tiểu Các loại kháng sinh này, moxifloxacin (thế hệ 4), sử dụng phổ biến điều trị bệnh nhiễm khuẩn nặng đến nặng Phạm vi nghiên cứu: khảo sát xây dựng đánh giá quy trình phân tích đơn kháng sinh (moxifloxacin) mẫu huyết tương phân tích đồng thời kháng sinh (norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin moxifloxacin) mẫu huyết tương nước tiểu; áp dụng thử nghiệm quy trình phân tích xây dựng với đơn kháng sinh moxifloxacin mẫu thử huyết tương NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Về giá trị khoa học - Moxiflocaxin kháng sinh fluoroquinolon hệ chưa có phương pháp phân tích Dược điển Việt Nam Moxifloxacin sử dụng rộng rãi điều trị đặc tính độc so với FQL khác Phương pháp xác định moxifloxacin dược phẩm dịch sinh học (huyết tương, nước tiểu) có khơng cơng trình cơng bố Tuy nhiên Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu việc định lượng moxiflocaxin huyết tương, đề tài xây dựng quy trình định lượng kháng sinh hai phương pháp phương pháp HPLC- PDA phương pháp FLS Phương pháp để xác định đối tượng nghiên cứu chưa công bố đề tài Đối với phương pháp quang phổ huỳnh quang việc sử dụng chất hoạt động bề mặt sodium dodecyl benzen sulfonat (SDBS) làm tăng cường độ huỳnh quang, tăng độ nhạy giới hạn phát điểm việc nghiên cứu phân tích xác định moxiflocaxin huyết tương thời điểm Việt Nam - Khả phát huỳnh quang đặc trưng điển hình cho cấu trúc kháng sinh họ FQL sở để định lượng FQL dược phẩm dịch sinh học Ngoài việc phát triển phương pháp quang phổ huỳnh quang để định lượng moxifloxacin huyết tương, luận án chúng tơi cịn phát triển thành công phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép nối với detector huỳnh quang hai kênh Ưu điểm HPLC-FLD cho độ nhạy độ chọn lọc cao Phương pháp HPLC-FLD hai kênh khảo sát lựa chọn hai cặp bước sóng kích thích/phát xạ phù hợp với hai nhóm chất cho đạt tín hiệu chất phân tích lớn nhất, tăng độ đặc hiệu giới hạn phát phương pháp Ý nghĩa thực tiễn: - Đề tài nghiên cứu xây dựng thành cơng hai quy trình định lượng đơn kháng sinh moxifloxacin HPLC-PDA FLS mẫu huyết tương Việc áp dụng thử nghiệm quy trình phân tích số mẫu thử huyết tương cho kết tốt Bên cạnh đó, đề tài xây dựng thành cơng quy trình định lượng đồng thời FQL (norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin), đại diện cho hệ FQL 2, 4, mẫu huyết tương nước tiểu Các FQL sử dụng phổ biến phác đồ điều trị y bác sỹ cho bệnh nhiễm khuẩn nặng Các quy trình áp dụng trường hợp nhiều bệnh nhân sử dụng kháng sinh khác kháng sinh trên, cần quy trình xử lý mẫu, điều kiện sắc ký định lượng đồng thời giúp rút ngắn thời gian mà cho kết xác Từ gợi ý cho việc nghiên cứu ứng phương pháp phân tích hỗ trợ giám sát nồng độ thuốc, điều chỉnh phác đồ điều trị nghiên cứu dược động học thuốc kháng sinh - Các quy trình phân tích xây dựng luận án tương đối đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp với điều kiện thực tiễn phịng thí nghiệm Việt Nam, máy móc thiết bị, dung mơi, hóa chất tương đối phổ biến CẤU TRÚC LUẬN ÁN Luận án gồm : phần mở đầu (3 trang), tổng quan (39 trang) , thực nghiệm (19 trang), kết thảo luận (55 trang), kết luận (2 trang) danh mục cơng trình cơng bố luận án (1 trang), tài liệu tham khảo (7 trang), phụ lục (42 trang) B NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƢƠNG TỔNG QUAN Chƣơng đề cập đến nội dung sau: Tổng quan kháng sinh fluoroquinolon đối tượng nghiên cứu đề tài, gồm nguồn gốc, chế tác dụng, dược động học tính chất quang Tổng quan phương pháp nghiên cứu: phương pháp phân tích HPLC phương pháp quang phổ huỳnh quang Xử lý mẫu dịch sinh học phân tích HPLC vấn đề gặp phải phân tích mẫu chứa fluoroquinolon Một số cơng trình nghiên cứu cơng bố nước liên quan đến đối tượng phương pháp nghiên cứu luận án CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Kháng sinh fluoroquinolon Đối tượng nghiên cứu gồm bốn kháng sinh nhóm fluoroquinolon: norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin 2.1.2 Đối tƣợng phân tích Mẫu huyết tương, nước tiểu: Là mẫu lưu thu thập bệnh viện Bạch Mai – Hà Nội bệnh viện Quân Y 108 Hà Nội Mẫu trắng không chứa FQL thu thập từ người khỏe mạnh, không bị bệnh suy thận, không sử dụng thuốc kháng sinh thời gian lấy mẫu 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 2.2.1 Hóa chất, thuốc thử Các hóa chất dùng nghiên cứu đạt mức độ yêu cầu, cung cấp hãng Merk, Fisher, Sigma 2.2.2 Chất chuẩn Norfloxacin (99,54%), ciprofloxacin (98,3%), levofloxacin (98,2%), moxifloxacin hydrochlorid (97,0%) cung cấp Viện Kiểm Nghiệm thuốc Thành Phố Hồ Chí Minh Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn gốc MOXI 500 µg/ml Hỗn hợp dung dịch FQL chuẩn 1000 µg/ml Các dung dịch pha lỗng MeOH thành dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ 100, 10, 1,0 µg/ml thích hợp trước sử dụng 2.2.3 Thiết bị Hệ thống HPLC Shimadzu 10Avp với detector PDA Shimadzu SPD-M10vp (Shimadzu, Nhật Bản ) Cột sắc ký MRC-ODS C18 250× 4,6 mm, μm Thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)- Auto sample Sil-20AC XR, detector huỳnh quang RF-20A, lò cột CTO10AS.VP, CBM-20A (Shimazu Nht Bn) Ct C18 YMC-pack ODS-A (150ì4,6mm, 5àm), SUPELCO (250ì4,6mm, 5àm) Mỏy o quang ph Nanolog (Horiba, Hoa Kỳ) trang bị đèn hồ quang Xe 450 W đơn sắc kích thích/phát xạ kép Máy quang phổ huỳnh quang Brolight 6102 Máy li tâm Mrc Scientific Instrument (Israel); Máy đo pH hãng HANNA Instruments (Romani); Cân phân tích Shimadzu AUW220D – 0,00001g (Nhật Bản); Cân phân tích Precia XB 220 A, độ xác 0,0001g; Máy lắc Vortex ZX-Classic (Velp – Italy); Máy rung siêu âm, có gia nhiệt hãng BRANSONIC (Mỹ); Máy trộn Vortex Mixer hãng Labnet (Mỹ); Máy đo quang UV-Vis Agilent 8453 (Mỹ); Thiết bị cô quay chân không (B.U.CHI –Thụy Sỹ); Tủ sấy chân không (Alab Tech – Hàn Quốc) 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Thu thập, xử lý sơ bảo quản mẫu Mẫu huyết tương phần chất lỏng máu toàn phần sau tiến hành làm đông tụ EDTA Cục máu đông loại bỏ cách ly tâm, thu lấy dịch phía micropipet, chuyển vào ống polypropylen Các mẫu trì 2-8°C xử lý Nếu mẫu huyết tương khơng phân tích lập tức, phải bảo quản cách cấp đông -20°C Trước xử lý thử nghiệm, mẫu rã đơng đến nhiệt độ phịng Mẫu thử: Mẫu huyết tương bệnh nhân sau 1, sử dụng thuốc có chứa kháng sinh MOXI Mẫu trắng: Mẫu thu thập từ người khỏe mạnh, không sử dụng thuốc chứa kháng sinh FQL thời gian lấy mẫu Mẫu thử tự tạo: Lấy thể tích dung dịch gốc FQL biết nồng độ, làm bay dung mơi thu cặn (nhiệt độ 40oC, khí N2) Hịa tan cặn thể tích xác mẫu trắng (huyết tương, nước tiểu), lắc xoáy phút để thu mẫu thử tự tạo có nồng độ FQL biết trước 2.3.2 Xây dựng quy trình phân tích 2.3.2.1 Xây dựng quy trình phân tích MOXI huyết tương phương pháp HPLC-PDA - Khảo sát bước sóng hấp thụ, sau tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký: thành phần tỷ lệ pha động, pH đệm - Khảo sát phương pháp xử lý mẫu huyết tương tác nhân kết tủa dung dịch TCA (trichloroacetic acid): nồng độ, thể tích dung dịch TCA, tốc độ ly tâm, thời gian ly tâm - Đánh giá độ tin cậy phương pháp: độ đặc hiệu, LOD, LOQ, khoảng tuyến tính, đường chuẩn, độ đúng, độ xác 2.3.2.2 Xây dựng quy trình phân tích MOXI huyết tương phương pháp quang phổ huỳnh quang - Khảo sát điều kiện phân tích: tạo phức MOXI với 3+ Eu , thời gian ổn định phức, pH, lượng Eu(III), lượng chất hoạt đồng bề mặt SBDS tới cường độ phát xạ huỳnh quang, xây dựng đường chuẩn - Quy trình xử lý huyết tương: Lấy 1,0 ml mẫu huyết tương, kết tủa protein cách thêm ml methanol, lắc xốy 2500 vịng/phút vòng 10 phút, ly tâm 15 phút 8000 vòng/phút Lấy ml dịch nổi, bốc dung mơi, hịa tan cắn thu ml nước cất lần Lọc mẫu qua màng 0,45µm - Đánh giá độ tin cậy phương pháp: Độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, đường chuẩn, LOD, LOQ, độ lặp lại, độ đúng, độ xác 2.3.2.3 Xây dựng quy trình tách định lượng đồng thời bốn FQL huyết tương nước tiểu phương pháp HPLCFLD - Khảo sát điều kiện sắc ký: xác định cặp bước sóng kích thíchphát xạ, dung mơi pha động, pH pha động, tốc độ dòng, nhiệt độ lò cột - Xử lý mẫu phân tích: + Đối với mẫu huyết tương: khảo sát tác nhân kết tủa protein MeOH TCA, tỷ lệ thể tích mẫu/tác nhân kết tủa, thời gian ly tâm, nồng độ tác nhân, hiệu suất thu hồi + Đối với mẫu nước tiểu: o Xử lý mẫu chiết lỏng-lỏng: khảo sát dung môi chiết, thể tích, thời gian lắc, hiệu suất thu hồi o Xử lý mẫu chiết pha rắn: cột chiết, thành phần dung môi rửa tạp, thành phần dung môi rửa giải, thể tích rửa giải - Đánh giá độ tin cậy phương pháp phân tích: Độ đặc hiệu, LOD, LOQ, khoảng tuyến tính, đường chuẩn, độ lặp lại, độ 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu Các kết phân tích định lượng xử lý theo phần mềm thiết bị phân tích: phần mềm Analyst thiết bị LC-UV LCFLD Xử lý số liệu phần mềm Origin® Microsolf Excel® CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG MOXICFLOXACIN TRONG HUYẾT TƢƠNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC-PDA 3.1.1 Điều kiện phân tích 3.1.1.1 Bước sóng hấp thụ Bước sóng hấp thụ cực đại 295 nm, tránh hấp thụ quang dung môi tạp khác nên lựa chọn 3.1.1.2 Điều kiện sắc ký Khảo sát yếu tố ảnh hưởng gồm thành phần pha động, tỷ lệ pha động pH dung dịch đệm phosphat, tốc độ dòng Điều kiến sắc ký: cột C18 MRC-ODS (25 cm ì 4,6 mm, 5àm); detector PDA; bc sóng λmax = 295 nm; pha động ACN– đệm phosphat pH 4,0; nồng độ đệm 20 mM (60:40); rửa giải đẳng dòng tốc độ 0,8 ml/phút; thời gian lưu (7,40 ± 0,05) phút; thể tích tiêm 10 µl 3.1.2 Xử lý mẫu huyết tƣơng Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương mẫu thử tự tạo Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu dựa điều kiện khảo sát Quy trình thu sau: mẫu huyết tương (1,0 mL), kết tủa protein cách thêm 1,0 mL dung dịch TCA 20%, sau lắc votex 2000 vịng/phút, 15 phút Tiếp theo thu tồn dịch nổi, lọc qua màng lọc 0,45 µm tiêm vào hệ thống HPLC 3.1.3 Đánh giá độ tin cậy phƣơng pháp phân tích pháp luận án thu nồng độ MOXI từ 1,52-2,61 µg/mL Giá trị nồng độ MOXI có khác biệt định, có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới nồng độ MOXI huyết tương cân nặng, độ tuổi, sức khỏe, chức gan, chức thận Tuy nhiên, kết thu tương đối phù hợp với nghiên cứu trước công bố Phương pháp phân tích định lượng MOXI huyết tương xây dựng ứng dụng đánh giá điều trị sử dụng thuốc lâm sàng nghiên cứu dược động học thuốc 3.2 QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG MOXIFLOXACIN TRONG HUYẾT TƢƠNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ HUỲNH QUANG 3.2.1 Khảo sát xây dựng phƣơng pháp phân tích Phương pháp thiết lập dựa phản ứng tạo thành phức chất MOXI với ion Eu(III) với có mặt chất hoạt động bề mặt SDBS Kết cường độ tín hiệu phát xạ phức Eu(III)MOX-SBDS tăng gấp xấp xỉ lần so phức Eu(III)-MOXI (Hình 3.12) Như vậy, có mặt SBDS có vai trị làm tăng độ nhạy xác định MOXI phương pháp quang phổ huỳnh quang 2500 EuEu Eu Eu MOXI MOX 2000 0.8 MOXI MOX A SBDS SDBS Eu-MOXI Eu-MOX 1500 I Eu-MOX Eu-MOXI 0.6 Eu-MOX-SBDS Eu-MOXI - SDBS Eu-MOXI-SDBS Eu-MOX-SBDS 0.4 1000 0.2 500 200 250 300 350 400 450 500 500 Bước sóng / nm 550 600 650 700 750 Bước sóng / nm Hình 3.12 Phổ -VIS (a) phổ phát xạ (b) dung dịch 3+ Eu , MOXI, Eu3+-MOXI, Eu3+-MOXI-SBDS Khảo sát điều kiện phân tích gồm thời gian phản ứng tạo phức, ảnh hưởng pH, ảnh hưởng pH, ảnh hưởng nồng độ Eu(III), ảnh hưởng nồng độ Eu(III), ảnh hưởng nồng độ 11 SBDS Kết thu điều kiện phân tích để định lượng MOXI huyết tương sau (Bảng 3.5) Bảng 3.5 Điều kiện phân tích MOXI phương pháp phổ huỳnh quang T Điều kiện phản ứng Giá trị T Bước sóng kích thích 405 nm Bước sóng phát xạ huỳnh quang 616 nm Thời gian ổn định phức 30 phút Đệm Tris-HCl pH 9,3 Nồng độ Eu(III) 3,0×10-5M Nồng độ SBDS 3,5×10-5M 3.2.2 Đánh giá độ tin cậy phƣơng pháp phân tích 3.2.2.1 Độ đặc hiệu Tiến hành với mẫu trắng mẫu thêm chuẩn MOXI Kết cho thấy mẫu trắng khơng chứa chất phân tích khơng có tín hiệu huỳnh quang đặc trưng vị trí tương ứng mẫu thêm chuẩn MOXI Như khẳng định phương pháp có tính đặc hiệu cao 3.2.2.2 Khảo sát khoảng tuyến tính Pha dãy mười nồng độ MOXI có giá trị từ – 2,8×10-5 M, sau tiến hành đo cường độ huỳnh quang Kết cho thấy cường độ tín hiệu huỳnh quang phức Eu(III)-MOXI-SBDS tăng tăng dần nồng độ MOXI Khoảng tuyến tính phân tích MOXI xác định nằm khoảng từ 5,010-7 2,210-5 M 3.2.2.3 Đường chuẩn Tiến hành đo cường độ huỳnh quang mẫu chuẩn ứng với nồng độ MOXI mẫu từ 0,05×10-5 - 1,6 ×10-5M Thiết lập đường chuẩn tương quan nồng độ cường độ huỳnh quang mẫu, phương trình hồi quy xác định y = 8020,5x + 150,35 với hệ số tương quan R2 = 0,9950 3.2.2.3 Giá trị LOD, LOQ độ lặp lại Tiến hành lặp lại 10 thí nghiệm mẫu, tính giá trị trung bình nồng độ MOXI : 0,155310-5M Giá trị độ lệch chuẩn SD 0,0068 ×10-5M LOD, LOQ phương pháp xác định là: 12 LOD = 3SD = 0,02.10-5M; LOQ = 10SD = 0,06810-5M Độ lặp lại phương pháp phân tích với RSD% = 4,38% Như phương pháp có LOD, LOQ thấp độ lặp lại cao, đáp ứng theo tiêu chuẩn AOAC, ICH 3.2.2.5 Độ thu hồi Mẫu huyết tương xử lý theo quy trình Mục 2.3.1 Sau tiến hành phân tích theo điều kiện khảo sát, độ thu hồi thu nằm khoảng 94,83-101,34% với độ lệch chuẩn tương đối từ 1,48-4,27% đạt yêu cầu theo hướng dẫn 3.2.3 Ứng dụng phƣơng pháp để phân tích MOXI mẫu thực Mẫu phân tích mẫu huyết tương người bệnh truyền dịch Avelox 450mg/250ml; mẫu lấy sau giờ, truyền, thí nghiệm lặp lại (n=5) Kết xác định MOXI huyết tương xác định có độ lặp lại tốt với RSD < 7% Tùy thuộc vào thời gian lấy mẫu sau truyền, hàm lượng MOXI huyết tương bệnh nhân khác nhau, dao động từ 1,773 – 2,884 g/ml sau đến truyền So sánh kết với hàm lượng MOXI (1,522,07 g/ml) mẫu huyết tương bệnh nhân xác định phương pháp HPLC-PDA xây dựng mục 3.1 cho thấy hai phương pháp phân tích cho kết tương đối tương đồng 3.3 QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI BỐN FLUOROQUINOLON TRONG HUYẾT TƢƠNG VÀ NƢỚC TIỂU BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC-FLD 3.3.1 Quy trình định lƣợng NOR, CIP, LEVO, MOXI huyết tƣơng phƣơng pháp HPLC-FLD 3.3.1.1 Điều kiện sắc ký: Qua khảo sát điều kiện sắc ký Mục 2.3.2.3 Kết quả, điều kiện tối ưu cho phương pháp sau: cột Supelco - C18, 25cmì4,6mm, 5àm, detector hunh quang - cp bước sóng kích thích/phát xạ λEx /λEm 290/500nm (LEVO MOXI), λEx /λEm 280/445nm (NOR CIP) Dung môi pha động: MeOH:H3PO4 0,025M, pH 3, gradient nồng độ Nồng độ MeOH từ 15% (0-2 phút), 15-35% (2-17 phút), 15-80 % (17-22 phút), 80 % (22-27 phút) Thể tích tiêm 10µl, nhiệt độ lị cột 30oC 13 3.3.1.2 Xử lý mẫu huyết tương Trong mục 3.1 đề tài sử dụng dung dịch TCA 20% làm tác nhân kết tủa protein, phương pháp kết tủa đẳng điện nàyđạt hiệu suất thu hồi MOXI từ 89,20 % đến 97,32% Tuy nhiên phần nghiên cứu đề tài tiến hành khảo sát tác nhân kết tủa protein khác MeOH Mục đích để phát triển, mở rộng thêm phương pháp, mặt khác để so sánh khả kết tủa hai tác nhân dựa hiệu suất thu hồi phương pháp sau tối ưu hóa điều kiện xử lý mẫu: thể tích, nồng độ dung dịch/dung môi kết tủa, thời gian kết tủa, thời gian ly tâm, tốc độ ly tâm Kết hai tác nhân cho hiệu suất thu hồi cao, nhiên với việc sử dụng MeOH cho kết hiệu suất cao so (92,6-102,0%) với TCA (83,2-89,8%) Điều giải thích MeOH làm giảm phân hủy thuốc, kết độ thu hồi cao Trong sử dụng tác nhân kết tủa acid mạnh TCA làm kết tủa đồng thời phân hủy phần chất phân tích Như vậy, quy trình phân tích đồng thời bốn FQL huyết tương phương pháp HPLC-FLD kết hợp kỹ thuật xử lý mẫu lựa chọn dung môi MeOH làm tác nhân kết tủa protein Quy trình phân tích sau: mẫu huyết tương kết tủa protein MeOH với tỷ lệ thể tích 1:4, tiến hành lắc xốy votex 2500 vịng/phút phút Sau ly tâm 6000 vòng/phút 20 phút Hút dịch nổi, lọc qua màng lọc 0,45 µm, tiêm vào hệ thống HPLC 3.3.1.3 Đánh giá độ tin cậy phương pháp phân tích Độ đặc hiệu: Kết sắc ký đồ Hình 3.32 cho thấy mẫu trắng khơng có pic tạp xuất vị trí thời gian lưu FQL chuẩn Đối với mẫu thử tự tạo, sắc ký đồ cho pic tương ứng vị trí thời gian lưu FQL chuẩn (± 0,05 phút) dung mơi pha động, pic tách hồn tồn, sắc nhọn khơng trùng vào vị trí pic tạp mẫu huyết tương Như vậy, kết luận phương pháp phân tích xây dựng đạt yêu cầu độ đặc hiệu 14 mV 500 450 a) 400 350 300 250 200 150 100 50 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 mV 18 1500 19.4 b) 1250 17.3 22.4 1000 750 500 250 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 Hình 3.32 Sắc ký đồ mẫu trắng (a) mẫu huyết tương tự tạo chứa FQL nồng độ 1,0 µg/ml kết tủa MeOH (b) Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Tiến hành mẫu dịch thu sau xử lý mẫu, thêm chuẩn FQL có nồng độ bắt đầu 0,02 µg/ml, tiêm vào hệ thống HPLC Từ sắc ký đồ thu được, lấy chiều cao pic chất trung bình lần đo FQL (S) chiều cao trung bình vị trí nhiễu (N) Nồng độ giảm dần đạt kết S/N = Xác định giá trị MDL = 5×LOD; MQL = 5×LOQ Kết Bảng 3.24 Khoảng tuyến tính Mẫu huyết tương khơng chứa FQL, xử lý mẫu theo quy trình khảo sát Dung dịch thu sau xử lý mẫu thêm vào thể tích dung dịch FQL chuẩn nồng độ 100,0 µg/ml 1,0 µg/ml tính tốn pha lỗng tới nồng độ thích hợp MeOH cho tạo thành dãy nồng độ sau: 0,02; 0,05; 0,1; 0,5; 1,0; 2.5; 5,0; 10,0; 15,0 20,0 µg/ml Kết thu Bảng 3.24 Bảng 3.24 Phương trình đường chuẩn, hệ số hồi quy, khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, MDL MQL FQL 15 Hệ số FQL NOR CIP LEVO MOXI Phƣơng trình tƣơng đƣờng chuẩn quan (R2) y = 1,09ì107x 0,9991 + 1,50ì10 MDL (àg/ml) MQL (µg/ml) 0,05-15 0,0071 0,0234 0,0355 0,1170 0,9992 0,05-10 0,0080 0,0264 0,0400 0,1320 0,9990 0,05-15 0,0074 0,0244 0,0370 0,1220 0,9995 0,10-10 0,0171 0,0564 0,0855 0,2820 y = 7,30×106x + 1,25ì10 LOQ (àg/ml) y = 7,62ì106x + 9,70ì10 LOD (àg/ml) tuyn tớnh (àg/ml) y = 1,13ì107x + 1,40ì10 Khoảng Chú thích: y diện tích pic; x nồng độ FQL huyết tương; R2: hệ số hồi quy tuyến tính Độ lặp lại độ thu hồi Các thử nghiệm tiến hành mẫu thử tự tạo, nồng độ: 1,0; 5,0; 10,0 µg/ml, nồng độ lặp lại lần, mẫu bơm lần, lấy diện tích trung bình lần bơm trung bình lần lặp lại nồng độ Kết thu giá trị RSD% FQL nằm khoảng từ 0,7 đến 5,43%, độ thu hồi đạt từ 98,8–103,5% NOR 95,0–105,4% với CIP, 99,6–105,4 % với LEVO 92,5–99,8 % MOXI, giá trị chấp nhận theo hướng dẫn AOAC Phương pháp phát triển phù hợp để xác định đồng thời bốn FQL huyết tương nồng độ pic khoảng từ 1,60–2,87 µg/ml cho liều uống norfloxacin 400 mg, 1,3–2,0 µg/ml cho liều uống ciprofloxacin (10 mg/kg thể trọng), sau 12 h trẻ suy dinh dưỡng nặng, 2,8 5,2 µg/ml cho 250 500 mg levofloxacin uống 2,60–3,79 µg/ml uống moxifloxacin 400 mg 3.3.2 Quy trình định lƣợng NOR, CIP, LEVO, MOXI nƣớc tiểu phƣơng pháp HPLC-FLD 3.3.2.1 Điều kiện sắc ký Trong nghiên cứu định lượng đồng thời FQL mẫu huyết tương sử dụng cột sắc ký C18 MRC-ODS (250×4,6 mm, μm), phương pháp xây dựng có nhiều ưu điểm trình bày 16 mục 3.3.1 Tuy nhiên thời gian cho mẫu sắc ký cịn dài 22 phút cho chất phân tích cuối khỏi cột Trong phần nghiên cứu này, ti s dng ct C18 (YMC-pack ODS-A, 150ì4,6mm, 5àm) có kích thước chiều dài cột ngắn tăng đa dạng, phù hợp với nhiều điều kiện thực tế rút ngắn thời gian sắc ký Đặc biệt điều kiện sắc ký khảo sát Mục 3.3.1.1 giữ nguyên Pha động gồm MeOH, H3PO4 0,025 M, pH (điều chỉnh trietyl amin), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, nhiệt độ lị cột 30oC Cặp bước sóng kích thích phát xạ (λex/λem) tương ứng: 280/445 nm NOR, CIP; 290/500 nm LEV, MOXI 3.3.1.2 Xử lý mẫu nước tiểu Dựa vào diện tích píc thu với yếu tố khảo sát, lựa chọn điều kiện tối ưu cho quy trình xử lý mẫu, khảo sát phương pháp đơn biến Từ kết khảo sát, xác định quy trình phân tích mẫu nước tiểu xác định FQL hai phương pháp có sơ đồ tiến hành sau: a)Phương pháp chiết lỏng – lỏng Lấy xác 0,5 ml mẫu nước tiểu ↓ Thêm 5,0 ml dung môi diclometan/MeOH (8:2) ↓ Lắc xốy votex 2000 vịng/phút, phút ↓ Ly tâm 15 phút ↓ Hút xác 2,0 ml dịch ↓ Cô đuổi thiết bị cô quay chân khơng, 45oC ↓ Hịa tan 2,0 ml dung mơi MeOH:HCl 0,1M (1:1) ↓ HPLC Hình 3.39 Sơ đồ quy trình định lượng FQL nước tiểu – xử lý mẫu phương pháp chiết lỏng – lỏng 17 b) Phương pháp chiết pha rắn Cột Oasis HLB, 500mg 6mL Hoạt hóa cột: 3,0 mL MeOH, 3,0 mL nước, 6,0 mL đệm phosphat pH 1,0 mL nước tiểu 5,0 mL nước Rửa giải 5,0 mL Diclometan Làm bay dung môi dung dịch thu 40 - 45 oC Hịa tan 2,0 ml dung mơi MeOH :HCl 0.1M (1 :1), lọc qua màng lọc 0.45µm HPLC Hình 3.40 Sơ đồ quy trình định lượng FQL nước tiểu – xử lý mẫu phương pháp chiết pha rắn 3.3.2.3 Đánh giá độ tin cậy phƣơng pháp phân tích a) Phương pháp chiết lỏng –lỏng Độ đặc hiệu: Kết sắc ký đồ mẫu nước tiểu trắng Hình 3.39 khơng xuất pic lạ trùng vào vị trí thời gian lưu mẫu thử có nồng độ FQL 1,0 µg/ml (b) 18 mV 3500 Detector A Ch1:Ex:280nm,Em:445nm Detector A Ch2:Ex:290nm,Em:500nm 3000 2500 2000 1500 1000 500 (a) 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 mV Detector A Ch1:Ex:280nm,Em:445nm 2500 Detector A Ch2:Ex:290nm,Em:500nm 11.0 12.0 13.0 LEVO 15.0 16.0 17.0 MOXI CIP 2000 14.0 NOR 1500 1000 500 (b) 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 Hình 3.41 Sắc ký đồ mẫu nước tiểu (a) không chứa FQL, (b) mẫu nước tiểu chứa FQL nồng độ 1,0 µg/ml - xử lý mẫu phương pháp chiết lỏng- lỏng Khoảng tuyến tính Sau tiến hành theo quy trình xây dựng (Hình 3.40) mẫu thử tự tạo có nồng độ FQL từ 0,02 – 20,0 µg/ml khảo sát để xác định khoảng tuyến tính thiết lập phương trình đường chuẩn Kết thu hệ số tương quan R2 bốn FQL > 0,999; khoảng tuyến tính FQL nằm khoảng 0,02-10,0 µg/ml Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Thí nghiệm thực với nồng độ FQL mẫu thử tự tạo 0,02 µg/ml xác định LOD NOR, CIP, LEVO, MOXI tương ứng 0,008; 0,010; 0,007; 0,006 µg/ml LOQ tương ứng 0,027; 0,034; 0,024; 0,020 µg/ml MDL MQL NOR, CIP, LEVO, MOXI là: 0,032; 0,041; 0,029; 0,024 0,108; 0,136; 0,096; 0,080 Đường chuẩn: Kết đường chuẩn xác lập tương quan nồng độ diện tích, phương trình đường chuẩn NOR, CIP, LEVO, MOXI sau: y = 15313397x – 332379; y = 10452676x – 82095; y = 14307738x – 356669; y = 7752335x + 25104, hệ số tương quan R2 nằm khoảng 0,9997-0,9999 độ tính lại từ đường chuẩn đánh giá 19 mV Detector A Ch1:Ex:280nm,Em:445nm 900 Detector A Ch2:Ex:290nm,Em:500nm 800 Độ độ lặp lại: Kết độ thu hồi nằm khoảng yêu cầu từ 97,7-102,0%, giá trị độ lặp lại từ 1,3 – 1,9 % chấp nhận 500 theo hướng dẫn AOAC 400 300 b) Phƣơng pháp chiết pha rắn 200 Độ đặc hiệu: Tiến hành phân tích mẫu trắng mẫu trắng thêm 100 chuẩn FQL nồng độ 1,0 µg/mL theo quy trình xây dựng sơ đồ hình thu sắc10.0ký đồ 5.0 3.40 6.0 kết 7.0 8.0 9.0 11.0 Hình 12.0 3.43 13.0 14.0 15.0 16.0 700 600 mV Detector A Ch1:Ex:280nm,Em:445nm 900 Detector A Ch2:Ex:290nm,Em:500nm 800 700 600 500 400 300 200 (a) 100 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 mV Detector A Ch1:Ex:280nm,Em:445nm Detector A Ch2:Ex:290nm,Em:500nm 11.0 12.0 Nor Levo Cip 6000 5000 13.0 14.0 15.0 16.0 Moxi 4000 3000 2000 (b) 1000 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 Hình 3.43 Mẫu nước tiểu không chứa FQL (a), mẫu nước tiểu chứa FQL nồng độ 1,0 µg/ml (b)- xử lý mẫu phương pháp chiết pha rắn Từ sắc ký đồ cho thấy mẫu trắng không thấy xuất pic tạp trùng với vị trí chất phân tích Đường vị trí pic FQL cho tín hiệu thấp Như vậy, phương pháp nghiên cứu có độ đặc hiệu đáp ứng yêu cầu Khoảng tuyến tính: Kết diện tích pic thu tương ứng với nồng độ FQL khảo sát (0,02, 0,025, 0,10, 0,50, 1,0, 2,50, 5,0, 10,0, 20,0 25,0 µg/mL), PL 3.16, Bảng 3.36 Giá trị LOD, LOQ, MDL MQL Tiến hành mẫu dịch thu sau xử lý mẫu, thêm chuẩn riêng lẻ FQL có nồng độ bắt đầu 0,02 µg/ml, tiêm vào 20 hệ thống HPLC Nồng độ giảm dần đạt tỷ lệ tín hiệu/nhiễu 10 Kết thu trình bày Bảng 3.36, Bảng 3.36 Giá trị LOD LOQ, MDL, MQL FQL Tên FQL Khoảng tuyến tính (µg/ml) NOR CIP LEVO MOXI 0,02-25,0 LOD (µg/ml) LOQ (µg/ml) MDL (µg/ml) MQL (µg/ml) 0,009 0,028 0,017 0,057 0,010 0,033 0,020 0,065 0,007 0,006 0,024 0,020 0,014 0,012 0,047 0,039 Các giá trị MDL phương pháp định lượng cho bốn FQL mẫu nước tiểu mà nồng độ chúng khoảng 50 µg/ml thỏa mãn, pha loãng chúng 500 đến 1000 lần Theo nghiên cứu trước, FQL thải trừ nước tiểu dạng không thay đổi 30% NOR, 40–60% CIP, 80–85% LEVO 20% MOXI Do đó, thực đánh giá dược động học FQL dựa phương pháp đề xuất Đường chuẩn Dãy nồng độ FQL nằm khoảng (0,025 -10,0) µg/ml chuẩn bị trình bày mục 2.3.5.3 luận án Từ diện tích pic thu xây dựng đường chuẩn tương quan tuyến tính nồng độ diện tích pic cho bốn FQL Phương trình đường chuẩn thiết lập NOR, CIP, LEVO MOXI : y = 11842918,06x + 853994,31; y = 11573367,29x + 354372,18; y = 12082493,02x – 255541,28; y = 10080269,14x + 680658,66 hệ số tương qua R2 FQL từ 0,996 – 0,998 Độ Tiến hành thực mẫu thử tự tạo mức nồng độ 0,1; 1,0 5,0 µg/ml Dựa diện tích tương ứng thu phương trình đường chuẩn FQL xác lập, tính nồng độ tìm lại hiệu suất thu hồi để đánh giá độ phương pháp phân tích Kết thu độ FQL nằm khoảng từ 98101,2%, kết đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn ICH Độ lặp lại 21 Để đánh giá độ chụm phương pháp, tiến hành lặp lại lần mẫu thử tự tạo với nồng độ thêm chuẩn FQL 1,0 ; 5,0 10,0 µg/ml theo phương pháp phân tích xây dựng Kết giá trị độ lặp lại RSD% FQL mức nồng độ đạt từ 0,7 – 2,7 % Như vậy, quy trình xây dựng để phân tích đồng thời FQL nước tiểu, xử lý mẫu nước tiểu phương pháp chiết pha rắn có độ lặp lại đạt yêu cầu Trong phần nghiên cứu này, đề tài thực nghiên cứu ban đầu cho nghiên cứu lâm sàng, sử dụng huyết tương nước tiểu người Nghiên cứu lâm sàng đơn giản thẩm định theo hướng dẫn ICH Trước tiên, đề tài tham khảo nghiên cứu trước điều kiện sắc ký, bước sóng kích thích/phát xạ, phương pháp xử lý mẫu, khoảng tuyến tính Cmax trung bình người sử dụng LEVO liều 250 500 mg báo cáo 2,8 5,7 µg/ml Cmax trung bình người sử dụng CIP đường tiêm truyền liều 200, 300 400 mg báo cáo 2,5, 3,2 4,0 µg/ml đường uống liều 200, 400, 600 mg 1,21, 2,45 3,33 µg/ml Cmax MOXI NOR đường uống với liều 600 400 mg 4,1 0,7 µg/mL Do đó, khoảng tuyến tính khảo sát từ 0,02 tới 20,0 µg/ml Tỉ lệ diện tích đường cong so với nồng độ ức chế tối thiểu huyết tương thuốc (AUC/MIC Cmax/MIC) thông số dược lực học sử dụng để tối ưu hóa hiệu kháng sinh FQL Do đó, để theo dõi, đánh giá dược động học FQL cần thực liên tục để tránh thất bại điều trị, ngăn ngừa vi khuẩn kháng thuốc chọn tác nhân, liều lượng thời gian điều trị tối ưu Sử dụng phương pháp HPLC ngày Việt Nam phổ biến hầu hết phòng thí nghiệm cho phân tích định tính, định lượng thuốc Do đó, thiết lập phương pháp ghi lại dược động học FQL dịch sinh học với quy trình đơn giản, ổn định, thời gian ngắn công cụ hỗ trợ hiệu cho phác đồ điều trị bệnh Phương pháp định lượng đồng thời FQL gồm MOXI, LEVO, NOR, CIP mẫu nước tiểu huyết tương góp phần hỗ trợ sở y tế sử dụng để theo dõi dược động học kháng sinh cho bệnh nhân, giúp phác đồ điều trị hiệu Mặc dù, khơng có bất 22 kỳ phác đồ điều trị bệnh sử dụng đồng thời kháng sinh Tuy nhiên, phương pháp quy trình chung áp dụng cho phân tích kháng sinh đơn lẻ dịch sinh học nước tiểu huyết tương Ví dụ bệnh nhân sử dụng kháng sinh FQL (CIP, NOR, LEVO, MOXI) khác nhau, mẫu thu xử lý phân tích theo chung quy trình, thuận tiện, đơn giản hóa cho q trình phân tích Trong nghiên cứu này, phương pháp HPLC-FLD xây dựng thẩm định để xác định đồng thời MOXI, LEVO, NOR, CIP huyết tương nước tiểu Các quy trình xử lý mẫu sinh học huyết tương nước tiểu khảo sát đánh giá hiệu chiết, loại tạp KẾT LUẬN Đã khảo sát tối ưu hóa điều kiện sắc ký nhằm xác định moxifloxacin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao hệ thống HPLC Shimadzu 10Avp với detector PDA Shimadzu SPDM10vp (Shimadzu, Nhật Bản) gồm: cột C18 MRC-ODS (25cmì4,6mm, 5àm), bc súng hp th 295nm, pha ng ACN– đệm phosphat; pH = 4,0, nồng độ đệm 20mM (60:40), chế độ đẳng dịng, 0,8ml/phút, thể tích tiêm 20µl, thời gian lưu thu 7,4± 0,05 phút - Đã tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu xác định MOXI mẫu huyết tương Kết cho giá trị LOD, LOQ 0,15 0,5 µg/ml, độ thu hồi trung bình đạt từ 89,2-97,32% độ lặp lại 1,18–10,22% - Đã áp dụng thử nghiệm quy trình để phân tích xác định hàm lượng MOXI mẫu huyết tương bệnh nhân điều trị thuốc kháng sinh, lấy mẫu sau 1-3 tiêm truyền Đã khảo sát tối ưu hóa điều kiện xác định moxifloxacin phương pháp quang phổ huỳnh quang, dựa nguyên tắc đo cường độ huỳnh quang phức Eu(III)-MOXI-SDBS với bước sóng kích thích/bước sóng phạt xạ tương ứng 405/616nm, với nồng độ Eu3+ 3,0×10-5M, chất hoạt động bề mặt SDBS thêm vào với nồng độ 3,5×10-5 M, dung dịch đệm Tris-HCl pH 9,3, thời gian phản ứng (ổn định phức) 30 phút 23 - Đã xây dựng xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích xác định hàm lượng MOXI mẫu huyết tương phương pháp quang phổ huỳnh quang Phương pháp có giá trị LOD LOQ 2,0×10-7M 6,8×10-7 M, độ thu hồi trung bình đạt 94,8-101,34%, RSD% 1,48-4,27% - Đã áp dụng thử nghiệm quy trình để phân tích xác định hàm lượng MOXI mẫu huyết tương bệnh nhân điều trị thuốc kháng sinh, lấy mẫu sau 1-3 tiêm truyền Đã khảo sát điều kiện tách xác định đồng thời norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin moxifloxacin hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)Auto sample Sil-20AC XR, detector huỳnh quang RF-20A, lò cột CTO-10AS.VP, CBM-20A (Shimazu – Nhật Bản) Sử dụng cột sắc ký: cột C18 YMC-pack ODS-A, 150ì4,6mm, 5àm, SUPELCO C18, kớch thc: 250ì4,6mm, 5àm Hai cp bc súng kớch thớch/phỏt x Ex /λEm 290/500nm (LEVO MOXI), λEx /λEm 280/445nm (NOR CIP), pha động MeOH:H3PO4 0,025M, pH 3, chương trình gradient MeOH từ 15-80% MeOH 27 phút, thể tích tiêm 10 µl - Đã tối ưu hóa quy trình phân tích xác định đồng thời FQL mẫu huyết tương nước tiểu + Đối với mẫu huyết tương, phương pháp phân tích có giá trị LOD LOQ NOR, CIP, LEVO, MOXI 0,0071, 0,0080, 0,0074, 0,0171 (µg/ml) 0,0234, 0,0264, 0,0244, 0,0564, độ thu hồi trung bình (95,0–105,0%), độ lặp lại từ 0,7-5,46% + Đối với mẫu nước tiểu, xây dựng phương pháp xử lý mẫu chiết lỏng lỏng chiết pha rắn: Chiết lỏng – lỏng: Phương pháp phân tích có giá trị LOD LOQ NOR, CIP, LEVO, MOXI 0,009, 0,010, 0,007, 0,006 (µg/ml) 0,028, 0,034, 0,024, 0,020 (µg/ml), độ thu hồi trung bình từ 97,7-101%, độ lặp lại 1,96 – 2,37% Chiết pha rắn: Phương pháp phân tích có giá trị LOD LOQ NOR, CIP, LEVO, MOXI 0,009, 0,010, 0,007, 0,006 (µg/ml) 0,028, 0,033, 0,024, 0,020 (µg/ml), độ thu hồi trung bình 98,1–103,7 %, độ lặp lại 0,13–0,26% 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN Phạm Thị Yến, Nguyễn Thị Minh Diệp, Nguyễn Thị Ánh Hường, Nguyễn Xuân Trường (2018), Nghiên cứu xác định Moxifloxacin dược phẩm huyết tương phương pháp quang phổ huỳnh quang, Tạp chí Phân tích Hóa-Lý Sinh học, 23(3), 174-180 Luong Thi My Hanh, Nguyen Thi Minh Diep, Phạm Thị Ngọc Mai, Nguyen Xuan Truong (2019), High performance liquid chromatography assay for determination of Moxifloxacin in human plasma, Vietnam Journal of Science and Technology, 57(3), 336-343 DOI: 10.15625/2525-2518/57/3/13362 Diep Thi Minh Nguyen , Tuan Anh Vu, Dien Xuan Luong, Truong Xuan Nguyen (2022), “The development of HPLC dual wavelength fluorescence detection method for the simultaneous determination of four fluoroquinolones in human plasma”, Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering, 10.31276/VJSTE.64(2).16-20 Nguyen Thi Minh Diep, Vu Anh Tuan, Nguyen Xuan Truong (2022), “Determination of norfloxacin, cipfloxacin, levofloxacin and moxifloxacin in urine by HPLC with a two-channel fluorescence detector”, 7th Analytica Vietnam Conference, 66-74 ... tên: ? ?Nghiên cứu phân tích số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon mẫu huyết tương nước tiểu ” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN Phát triển phương pháp phân tích định lượng thuốc kháng sinh fluoroquinolon. .. pháp nghiên cứu: phương pháp phân tích HPLC phương pháp quang phổ huỳnh quang Xử lý mẫu dịch sinh học phân tích HPLC vấn đề gặp phải phân tích mẫu chứa fluoroquinolon Một số cơng trình nghiên cứu. .. TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: bốn loại kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon hệ 2, gồm norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin moxifloxacin mẫu huyết tương nước tiểu Các loại kháng