NGHIÊN cứu sử DỤNG VI SINH vật PHÂN hủy NHỰA cây

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Đồ thị đƣờng chuẩn Glucose 28 Hình Hình ảnh vi sinh vật phát triển mơi trƣờng phân lập 31 Hình 3.2 Khả sinh trƣởng chủng vi khuẩn xạ khuẩn môi trƣờng phân lập lỏng 33 Hình 3.3 Khả sinh enzym lipase ngoại bào số chủng phân lập34 Hình 3.4 Khả sinh cellulase ngoại bào số chủng phân lập 34 Hình 3.5 Dăm mảnh gỗ keo đƣợc ngâm ngập dịch lên men chủng tuyển chọn 44 Hình 3.6 Quá trình chiết nhựa 45 Hình 3.7 Hình thái khuẩn lạc (A) tế bào vi khuẩn CVSVC1-1 dƣới kính hiển vi quang học (100x) (B) kính hiển vi điện tử độ phóng đại (50000X) (C) (10000X) (D) 46 Hình 3.8 Khả sinh bảo tử chủng vi khuẩn CVSVC1-1 47 Hình 3.9 Khả phân hủy số chất vi khuẩn CVSVC1-1 49 Hình 3.10 Điện di đồ DNA tổng số (A), sản phẩm PCR (B) gel agarose 1,0 % phát sinh chủng loài vi khuẩn CVSVC1-1 50 Hình 3.11 Khả sinh trƣởng chủng CVSVC1-1 môi trƣờng khảo sát 51 Hình 3.12 Ảnh hƣởng nhiệt độ (A) pH (B) đến khả sinh trƣởng chủng CVSVC1-1 môi trƣờng MPA bổ sung 0,5g/L 53 Hình 13 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính enzyme sterol esterase laccase chủng CVSVC1-1 53 Hình 14 Ảnh hƣởng pH ni cấy đến hoạt tính enzyme sterol esterase laccase chủng CVSVC1-1 54 Hình 3.15 Nguyên liệu dăm mảnh gỗ keo đƣợc xử lý với chủng CVSVC1-1 tỷ lệ giống bổ sung khác 57 Hình 3.16 Nguyên liệu dăm mảnh gỗ keo đƣợc xử lý với chủng CVSVC1-1 sau rửa sấy 57 Hình 3.17 Mật độ vi sinh mẫu có khơng bổ sung chủng CVSVC1-1 nồng độ 105 57 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 PHƢƠNG PHÁP SẢN XUẤT BỘT GIẤY 1.2 NHỰA CÂY VÀ NHỮNG TÁC ĐỘNG CỦA CHÚNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT GIẤY 1.2.1 Nhựa 1.2.2 Tác động nhựa đến trình sản xuất bột giấy 1.3 VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY 1.3.1 Nấm phân hủy nhựa 1.3.2 Vi khuẩn, xạ khuẩn phân hủy nhựa 12 1.3.3 Hệ enzym phân hủy nhựa 14 1.3.2.1 Esterase 14 1.3.2.2 Lipase 15 1.3.2.3 Laccase 16 1.3.4 Cơ chế phân hủy lignin chất chiết gỗ 17 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 22 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 22 2.1.2 Thiết bị 22 2.1.3 Hóa chất 22 2.1.4 Môi trƣờng 23 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.2.1 Chuẩn bị chất chiết nhựa 23 2.2.2 Phƣơng pháp sàng lọc vi sinh vật phân hủy nhựa 23 2.2.3 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật đƣợc tuyển trọn 24 2.2.4 Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzym 25 2.2.5 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzym 26 2.2.6 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nhựa chiết aceton 29 2.2.7 Phƣơng pháp nấu bột giấy sunfate 29 2.2.8 Phƣơng pháp xác định số Kappa (đánh giá hàm lƣợng lignin) 30 2.2.9 Phƣơng pháp phân tích thống kê 30 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN VÀ XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NHỰA CÂY 31 3.1.1 Phân lập sàng lọc chủng vi khuẩn xạ khuẩn có khả phân hủy nhựa 31 3.1.2 Khả sinh tổng hợp sterol esterase, laccase cellulase chủng tuyển chọn 40 3.1.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn, xạ khuẩn có khả phân hủy nhựa 43 3.2 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG CVSVC1-1 46 3.2.1 Nghiên cứu số đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn CVSVC1-1 46 3.2.2 Định danh chủng vi sinh vật tuyển chọn phƣơng pháp phân tích trình tự vùng gen 16S rRNA 49 3.3 NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP STEROL ESTERASE CỦA CHỦNG CVSVC1-1 51 3.3.1 Lựa chọn mơi trƣờng thích hợp cho sinh trƣởng sinh tổng hợp số enzym chủng CVSVC1-1 51 3.3.2 Ảnh hƣởng yếu tố nhiệt độ, pH tốc độ lắc đến khả sinh trƣởng sinh tổng hợp enzym chủng CVSVC1-1 52 3.4 NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN BỔ SUNG VI SINH VẬT TUYỂN CHỌN VÀO DĂM MẢNH GỖ KEO 56 3.4.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ giống đến khả sinh trƣởng loại nhựa 56 3.4.3 Ảnh hƣởng độ ẩm đến khả giảm nhựa dăm mảnh gỗ 61 4.1 Kết luận 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 MỞ ĐẦU Sản xuất giấy đƣợc xem nhƣ ngành công nghiệp trọng điểm nhiều quốc gia giới Các sản phẩm từ giấy không đƣợc sử dụng ngành giáo dục, báo chí, in ấn, hội họa… mà cịn đƣợc sử dụng nhu cầu tiêu dùng hàng ngày khác ngƣời nhƣ khăn giấy, giấy vệ sinh, thùng chứa… Ngày nay, sản phẩm từ giấy đƣợc khuyến khích việc sử dụng làm bao bì, giấy gói, dụng cụ dùng lần v.v nhằm hạn chế rác thải nhựa Hiện nay, công nghệ sản xuất giấy đƣợc cải tiến nhiều kể trang thiết bị máy móc nhƣ quy trình sản xuất để đáp ứng nhu cầu thị hiếu khách hàng Tuy nhiên, ngành giấy gặp nhiều vấn đề liên quan tới tiêu thụ lƣợng, nƣớc ô nhiễm môi trƣờng phải sử dụng lƣợng lớn hóa chất sản xuất Một khó khăn lớn mà ngành giấy gặp phải ảnh hƣởng nhựa đến trình sản xuất chất lƣợng giấy Mặc dù hàm lƣợng nhựa chiếm 2-8%, nhƣng với thành phần đặc điểm cấu tạo chất nhựa gỗ gây vấn đề nghiêm trọng, ảnh hƣởng đến hiệu q trình cơng nghệ chất lƣợng sản phẩm Nhựa đóng cặn làm giảm chất lƣợng bột giấy gây ngừng trình nghiền bột, giảm hiệu sản xuất tăng chi phí để loại bỏ hay kiểm sốt nhựa Thành phần nhựa gỗ keo bao gồm: sáp, axit béo, alkanol, chất chiết hydroxy, rƣợu béo, trygliceride, diglyceride, sterol, steryl ester, phospholipid số thành phần khác Các thành phần axit béo không xà phịng hóa đƣợc (ví dụ alkanol, sterol, este steryl) axit béo chuỗi dài bão hòa khơng bão hịa khó xử lý q trình sản xuất giấy chúng khơng đƣợc loại bỏ trình nấu, tẩy trắng rửa bột Để hạn chế vấn đề nhựa cây, sử dụng phƣơng pháp truyền thống, hóa học sinh học Trong năm gần đây, ứng dụng công nghệ sinh học việc sản xuất bột giấy đƣợc xem nhƣ cơng nghệ sản xuất với mục đích tăng sản lƣợng chất lƣợng giấy, thân thiện với môi trƣờng Phƣơng pháp thu hút nhiều quan tâm, ý không nhà nghiên cứu mà cấp quản lý nhà sản xuất giấy Trong phƣơng pháp này, chủng vi sinh vật có khả tiết hệ enzym phân hủy nhựa đƣợc sử dụng giai đoạn tiền xử lý nguyên liệu nhằm giảm hàm lƣợng nhựa nguyên liệu giúp giảm hóa chất sử dụng, bảo vệ mơi trƣờng tăng q trình chạy máy Trong tự nhiên, loài nấm mốc, nấm dát gỗ, nấm đảm, vi khuẩn, xạ khuẩn đối tƣợng đƣợc quan tâm nghiên cứu giảm nhựa nhờ hệ enzym phong phú nhƣ esterase, laccase, lipase v.v Nấm đảm nấm dát gỗ trƣớc đƣợc xem hai đối tƣợng đƣợc quan tâm nhiều nhất, nhiên sức phát triển khả chịu điều kiện khắc nghiệt môi trƣờng nhƣợc điểm chúng Xuất phát từ thực tế đó, nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật phân hủy nhựa nguyên liệu dăm mảnh keo nhằm ứng dụng sản xuất bột giấy thân thiện với môi trƣờng”, nhằm giảm ảnh hƣởng nhựa đến trình sản xuất bột giấy CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 PHƢƠNG PHÁP SẢN XUẤT BỘT GIẤY Hiện có phƣơng pháp để sản xuất bột giấy phƣơng pháp truyền thống (cơ học) phƣơng pháp hóa học Sản xuất bột giấy phƣơng pháp truyền thống phƣơng pháp đƣợc áp dụng nhiều nhà máy lớn nhỏ Trong phƣơng pháp này, nguyên liệu dăm mảnh đƣợc thu mua lƣu kho thời gian dài Trong trình bảo quản, dăm mảnh đƣợc tiến hành phun nƣớc giảm hàm lƣợng nhựa Ƣu điểm phƣơng pháp truyền thống tận dụng nguồn vi sinh vật tác nhân bên để phân hủy số thành phần nhựa nguyên liệu giúp giảm chi phí q trình sản xuất Tuy nhiên, lại khơng kiểm sốt đƣợc lồi vi sinh vật gây hại, đó, dễ gây thất Cellulose, giảm hiệu xuất thu hồi ảnh hƣởng đến chất lƣợng bột giấy Việc áp dụng phƣơng pháp truyền thống vào sản xuất bột giấy giảm tối 20% hàm hƣợng nhựa, chủ yếu hợp chất dễ phân hủy, thành phần khó phân hủy nhƣ sterol, sterol este, axit nhựa,… đƣợc giữ lại nguyên liệu gây vấn đề sản xuất bột giấy Hiệu suất thu hồi bột đạt từ 85 – 98%, chi phí thấp Bột giấy sản xuất theo phƣơng pháp thƣờng có khả thấm hút mực in tốt nên thƣờng đƣợc sử dụng số sản phẩm nhƣ: giấy in báo, giấy in tạp chí cao cấp (SC), giấy in tạp chí có tráng nhẹ (LWC), giấy dán tƣờng, giấy làm bao bì (FBB), giấy in giấy viết thông thƣờng Tuy nhiên, chất lƣợng bột giấy thƣơng phẩm sản xuất bột giấy lại có nhiều điểm hạn chế nhƣ: giấy thƣờng bị đục, không bền, dễ bị thủng… Sản xuất giấy phƣơng pháp hóa học sử dụng hóa chất để biến đổi nguyên liệu ban đầu thành bột giấy (bột hóa học) Các dăm mảnh gỗ đƣợc xử lý hóa học cách nấu Sau nấu 12 đến 15 tiếng xơ sợi đƣợc tách khỏi thành phần cứng thu đƣợc sợi cellulose Bột giấy đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp hóa học cải thiện đáng kể chất lƣợng thành phẩm Phƣơng pháp hoá học loại bỏ triệt để lignin nên bột giấy hóa học có chất lƣợng tốt so với bột giấy học Bên cạnh đó, phƣơng pháp có mặt hạn chế định đặc biệt hiệu suất thu hồi bột không cao, đạt 40 - 50% Bên cạnh việc sử dụng lƣợng lớn hóa chất gây ảnh hƣởng đến mơi trƣờng xung quanh, tốn chi phí q trình xử lý Bột Sulfat (bột Kraft): Dịch nấu gỗ gồm (NaOH + Na2S) (có thể bổ sung xúc tác chất trợ nấu), pH từ 13 trở lên, nhiệt độ từ 155-170oC, thời gian - Nhƣợc điểm lớn phƣơng pháp sinh hợp chất lƣu huỳnh có mùi thối, gây tác động lớn đến môi trƣờng xung quanh Nấu kiềm, đặc biệt nấu sunfat, phƣơng pháp phổ biến nay, sản xuất phần lớn lƣợng bột giấy năm Hiện nấu sunfat (Kraft) phƣơng pháp đƣợc áp dụng quy mô lớn nhà máy Giấy Bãi Bằng Tổng Công ty Giấy VN Công ty cổ phần giấy An Hịa, hai nhà máy có thị phần bột giấy nấu từ nguyên liệu thô lớn Việt Nam Nguyên liệu dùng sản xuất chủ yếu gỗ keo bạch đàn Tuy nhiên lƣợng gỗ keo chiếm 70% Tại tổng Công ty Cổ phần giấy An Hịa, quy mơ sản xuất bột giấy Kraft, nấu liên tục, tƣơng đối lớn 130.000 tấn/năm, bột giấy đƣợc tẩy trắng theo quy trình tẩy tiên tiến khơng sử dụng clo nguyên tố Hiện hai nhà máy chịu ảnh hƣởng nặng nề vấn đề nhựa cây, làm giảm suất trình sản xuất bột giấy tăng giá thành sản xuất Hiện nay, hai phƣơng pháp sản xuất bột giấy nhà máy sản xuất giấy hƣớng đến phƣơng pháp sản xuất hơn, giảm thiểu tác động nhựa đến môi trƣờng Xử lý giấy phƣơng pháp sinh học không giúp loại bỏ nhựa ngun liệu, chúng cịn làm giảm lƣợng hóa chất sử sụng trình xử lý, giảm lƣợng tiêu thụ chi phí sản xuất Phƣơng pháp sinh học thƣờng đƣợc áp dụng giai đoạn tiền xử lý nguyên liệu nhằm giảm hàm lƣợng nhựa, giảm lƣợng nghiền tẩy trắng bột giấy,… Trên giới, số chế phẩn phân hủy nhựa đƣợc sử dụng xử lý gỗ mềm nhƣ Cartapip 97 đƣợc tạo thành từ chủng bạch tạng Ophiostoma piliferum Sử dụng chế phẩm Cartapip loại đƣợc đến 90% hàm lƣợng triglycerides, cao so với phƣơng pháp lƣu giữ gỗ, nhiên, hiệu loại axit nhựa, sterol este sáp tuần tƣơng tự so với bảo quản tự nhiên điều kiện Ở Việt Nam, sản xuất bột giấy phƣơng pháp sinh học chƣa đƣợc áp dụng, chúng thử nghiệm đề tài, dự án nhà máy, nhiên, kết thu đƣợc mang lại nhiều triển vọng sƣ phát triển bền vững ngành Giấy 1.2 NHỰA CÂY VÀ NHỮNG TÁC ĐỘNG CỦA CHÚNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BỘT GIẤY 1.2.1 Nhựa Nhựa chiếm lƣợng nhỏ – 8% khối lƣợng gỗ nhƣng chúng lại cần thiết cho sống Trong sống, nhựa đƣợc tạo để bảo vệ khỏi bị vi sinh vật công phá hủy mô gỗ Tƣơng tự nhƣ vai trò dịch rỉ (exdudates), đƣợc đùn chỗ bị tổn thƣơng tác động bên ngồi Nhựa nhân tố góp phần tạo màu sắc, mùi hƣơng độ bền gỗ Một số chất chiết cịn có hoạt tính sinh học nên từ lâu nhiều loại gỗ đƣợc dùng làm dƣợc liệu thuốc [1,2] Trong công nghiệp chế biến đồ dùng từ gỗ, nhựa có ảnh hƣởng tới q trình sấy khơ, khả kết dính, tính hút ẩm âm gỗ [1] Trong ngành sản xuất vật liệu composite từ chất dẻo gỗ sử dụng xây dựng cơng nghiệp tơ, gỗ đƣợc sử dụng nhƣ thành phần gia cố, nhiên, hàm lƣợng nhựa gỗ cao dẫn tới tính chất khơng mong muốn vật liệu composite [3,4] Nhựa không tan nƣớc nhƣng tan đƣợc dầu mỏ số dung mơi hữu trung tính, có độ phân cực thấp Thành phần hóa học nhựa bao gồm axit béo tự do, axit nhựa, sáp, rƣợu béo, steryl este, sterol, glyceride, ketone hợp chất chứa oxy khác Theo Black Ekman (2000), chia hợp chất thành phần nhựa gồm nhóm nhƣ [5]: - Các chất béo (triglyxerit) axit béo; Steryl este sterol; Terpen terpenoid (các axit nhựa polyisopren); Các chất sáp (ester rƣợu béo axit béo) Nhựa đƣợc chứa chủ yếu kênh dẫn nhựa (resin canals), túi nhựa (resin pockets), tế bào nhu mô (parenchyma cells) số tế bào có số loại gỗ cứng nhiệt đới nhƣ tế bào dầu (oil cells) tế bào latex (latex cells) Nhựa kênh dẫn nhựa thơng thƣờng hỗn hợp vơ định hình terpen terpenoit mạch vịng đƣợc hình thành từ đơn vị isopren nhờ tiếp xúc enzyme tạo mạch vòng xyclaza Theo số tài liệu nghiên cứu, hàm lƣợng thành phần hóa học nhựa phụ thuộc vào loài cây, độ tuổi, yếu tố di truyền, mùa sinh trƣởng, điều kiện phát triển (ánh sáng, độ ẩm, thành phần dinh dƣỡng đất,…), khí hậu vùng miền Các trồng vùng có khí hậu ấm áp có lƣợng axit béo bão hịa cao Thậm chí phận khác có khác biệt đáng kể Nhựa thƣờng có nhiều tâm gỗ so với dát gỗ, tạo nên môi trƣờng bảo quản tự nhiên cho tâm gỗ Trong kênh dẫn nhựa tế bào biểu mơ chứa nhiều chất chiết có vai trị quan trọng q trình bảo quản gỗ, giúp trì đặc tính gỗ Nhựa gỗ mềm có chứa 90% hàm lƣợng chất xà phịng hố cao axit nhựa axit béo Các axit nhựa, axit béo, triglyceride, sterol este chúng nhóm chất béo nhựa gỗ vân sam thông Các triglyceride chiếm ƣu phần dát gỗ vân sam thông tâm gỗ thông chứa nhiều axit nhựa, gấp khoảng lần so với phần dát gỗ Nhựa gỗ cứng bạch dƣơng gỗ dƣơng có nhiều sterol chất béo khơng xà phịng hóa so với gỗ mềm chứa nhiều triglyceride Các sterol este sáp có nhựa gỗ dƣơng, nhựa gỗ bạch dƣơng có triterpenol axit béo bão hịa Thành phần nhựa có gỗ keo bao gồm: gỗ keo tuổi thành phần nhựa chủ yếu 2-pentanone, 4-hydroxy-4-methyl-với hàm lƣợng lên đến 70%, hợp chất giảm độ tuổi tăng Tuy nhiên, xuất số hợp chất với hàm lƣợng tƣơng đối nhƣ 1,2-benzenedicarboxylic acid, bis(2-ethylhexyl) ester (2,5%) gỗ keo tuổi 1,2benzenedicarboxylic acid, diisooctyl ester (5,95%), (2-hydroxyethyl)triphenylphosphonium chloride (8,06%) gỗ keo tuổi Ngồi cịn có axit béo, axit nhựa (axit n – hexadecanoic, axit octadecanoic) thành phần nhựa ... PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.2.1 Chuẩn bị chất chiết nhựa 23 2.2.2 Phƣơng pháp sàng lọc vi sinh vật phân hủy nhựa 23 2.2.3 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật đƣợc... chúng Xuất phát từ thực tế đó, nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật phân hủy nhựa nguyên liệu dăm mảnh keo nhằm ứng dụng sản xuất bột giấy thân thiện với... nhựa phƣơng lƣu kho làm kiểm soát phát triển tác động vi sinh vật gây thất thoát cellulose ảnh hƣởng đến chất lƣợng bột giấy bị giảm sút 1.3 VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY 1.3.1 Nấm phân hủy nhựa