1219 Phân lập tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng tạo lovastatin từ rừng ngập mặn Cần Giờ.docx

Nguyễn Thiện Phú tgk TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHSP TPHCM _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG TẠO LOVASTATIN TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ NGUYỄN THIỆN PHÚ*, VŨ THỊ THƯƠNG** TÓM TẮT Lovastatin (mevinolin) chất ức chế sinh tổng hợp cholesterol làm giảm lượng cholesterol huyết tương người động vật Từ mẫu đất thu nhận rừng ngập mặn (RNM) Cần Giờ, tiến hành phân lập tuyển chọn chủng nấm sợi (NS) có khả tạo lovastatin Khả ức chế sinh trưởng nấm men xung quanh lỗ thạch dấu hiệu liên quan đến khả tạo lovastatin Các chủng nấm ni cấy chìm ngày thể khả kháng Saccharomyces cerevisiae thử nghiệm Chủng NS có hoạt tính mạnh định danh cách giải trình tự 28S rRNA Kết cho thấy chủng thuộc lồi Aspergillus terreus Từ khóa: Aspergillus terreus, lovastatin, rừng ngập mặn ABSTRACT Isolating and selecting filamentous fungi strains capable of producing lovastatin in Can Gio mangrove Lovastatin (mevinolin) is a competitive inhibitor of cholesterol biosynthesis that reduces cholesterol in the plasma of humans and animals From soil samples collected in Can Gio mangrove, filamentous fungi strains capable of producing lovastatin were isolated and selected The inhibition of growth of yeast surrounding the wells loaded with fungal filtrate was an indication of inhibition activiti of fungal extracts proportionately related to lovastatin producing abiliti Filamentous fungi strains for lovastatin production in submerged fermentation after days of fermentation showed positive results when screened through bioassay method by the zone of inhibition exhibited by the fungus against Sacchromyces cerevisae Based on 28S rRNA, a strain which has the best activiti has been classified to Aspergillus terreus Keywords: Aspergillus terreus, lovastatin, mangrove Mở đầu Theo thống kê tổ chức Y tế Thế giới, năm có khoảng 17 triệu người hành tinh chết bệnh tim mạch, số dự đoán tăng lên 25 triệu vào năm 2020 Nguyên nhân gây bệnh tim mạch xác định tăng nồng độ cholesterol máu Chính vậy, việc trì nồng độ cholesterol máu mức ổn định quan trọng [7], [9] * ** ThS, Trường Đại học Sư phạm TPHCM; Email: thienphu48@gmail.com CN, Trường Đại học Sư phạm TPHCM Hiện nay, có nhiều biện pháp để giúp cải thiện nồng độ cholesterol máu thay đổi chế độ ăn, luyện tập thể dục thường xuyên, không hút thuốc… Bên cạnh đó, người ta cịn sử dụng số thuốc resin, statin làm giảm tới 40% nồng độ cholesterol máu Các statin bao gồm lovastatin, fluvastatin, simvastatin, pravastatin, atorvastatin rosuvastatin, lovastatin ý [11] Lovastatin số hợp chất statin thương mại có nguồn gốc từ số loài nấm Aspergillus terreus, Penicillium, Monascus, Paecilomyces, Trichoderma, Scopolariopsis, Doratomyces, Phoma, Phythium, Gymoaseus, Hypomyces, Pleurotus… thơng qua q trình lên men Hiện nay, nhà khoa học tập trung vào việc phân lập chủng nấm có khả sinh lovastatin, đem lại suất cao từ nguồn nguyên liệu tự nhiên có giới Theo kết nhiều nghiên cứu cho thấy, chủng vi sinh vật (VSV) phân lập từ đất thường tạo chất có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt từ đất RNM [7] RNM nói chung RNM Cần Giờ nói riêng nơi có chứa nhiều nguồn gen sinh vật Đây nơi có hệ VSV vơ phong phú NS, vi khuẩn, xạ khuẩn… Trong NS chiếm số lượng vô lớn Những chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ có hoạt tính sinh học cao ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực Xuất phát từ nhu cầu thực tế đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Phân lập, tuyển chọn chủng nấm sợi có khả tạo lovastatin từ rừng ngập mặn Cần Giờ” Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng Nghiên cứu thực đối tượng: - Các chủng NS phân lập từ đất RNM Cần Giờ – TPHCM; - VSV kiểm định: Saccharomyces cerevisiae 2.1.2 Các môi trường nghiên cứu sử dụng Để thực nội dung nghiên cứu, tiến hành sử dụng loại môi trường sau: - MT1: Malt Extract Agar Cao malt: 20 g MT2: Peptone Dextrose Agar - Cao nấm men: - Peptone: 1g - Peptone: 20 g - Glucose: 20 g - Dextrose: 20 g - Agar: 20 g - Agar: 15 g - Nước cất: lít - Nước cất: lít 10 g MT3: MT Potato Dextrose Agar Khoai tây:300 g D – Glucose:30 g Agar:20 g Nước cất:1 lít MT4: MT bột đậu nành [8] Sucrose:50 g Bột đậu tương:20 g K2HPO4:1 g NaNO3:1 g -MgSO4.7H2O:0,5 g -pH:6,5 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu Mẫu đất từ địa điểm khác RNM Cần Giờ thu thập sau: Thu 100 gam đất cách bề mặt 5cm vào túi vô trùng, bảo quản 4oC không 24 2.2.2 Phương pháp phân lập Pha loãng mẫu theo dãy thập phân đến 10-6, trải 0,1ml dịch pha loãng nồng độ 10, 10 , 10-6 lên đĩa môi trường MEA, nồng độ lặp lại lần, ủ đĩa 30 oC từ - ngày Chọn đĩa có khuẩn lạc riêng rẽ để tiếp tục làm [2], [6] -5 2.2.3 Phương pháp thỏi thạch NS cấy đĩa Petri chứa môi trường MEA 30oC Sau ngày, sợi nấm mọc tốt dùng khoan nút chai đục lấy thỏi thạch chứa bề mặt, đặt chúng vào đĩa Petri chứa môi trường PDA cấy trải nấm men Để đĩa tủ lạnh – cho chất khuếch tán vào môi trường thạch sau đặt vào tủ ấm 300oC đọc kết sau 48 Hoạt tính kháng nấm men (NM) xác định theo đường kính vịng kháng nấm (D – d; đơn vị: mm): D đường kính vịng kháng nấm, d đường kính thỏi thạch [3] 2.2.4 Phương pháp lên men chìm để thử hoạt tính lovastatin Chuẩn bị môi trường bột đậu tương cho vào bình tam giác 250ml, bình chứa 100ml bột đậu tương, sau đem hấp vơ trùng nhiệt độ 121oC vịng 30 phút Để mơi trường vừa chuẩn bị nguội sau cấy chủng NS vào Đem chủng nấm vừa nuôi cấy lên máy lắc vòng ngày, với tốc độ 100 vòng/ phút Chiết xuất lovastatin: Sau nuôi lắc ngày, chủng nấm sợi đem lọc với giấy lọc để thu lấy dịch lọc có chứa lovastatin Điều chỉnh pH dịch ni 2, sau thêm vào lượng ethyl acetate tương đương với lượng dịch lọc thu Đem dung dịch vừa pha trộn lên máy lắc 100 vòng/ phút Sau đem quay để ethyl acetate bay cịn khoảng 1ml [7] 2.2.5 Phương pháp khoan lỗ thạch Sau cố định giá trị khuẩn lạc S cerevisiae, dùng khoan nút chai vô trùng khoan lỗ đĩa Petri có chứa sẵn nấm men với số lượng thích hợp Sau đó, nhỏ 0,3 ml cao ethyl acetate quay vào lỗ thạch vừa đục Ủ đĩa vừa nhỏ cao ethyl acetate nhiệt độ phòng vòng 24 đo đường kính vịng kháng NM để xác định khả sinh lovastatin 2.2.6 Nghiên cứu số đặc điểm đại thể, vi thể chủng nấm nội sinh có khả sinh lovastatin NS cấy truyền sang thạch nghiêng, tiến hành tạo khuẩn lạc khổng lồ cách sử dụng que cấy đầu vuông vơ trùng lấy bào tử từ ống giống cấy chấm điểm vào mặt thạch đĩa Petri chứa môi trường PDA ủ tủ ấm tuần để tạo KL Hằng ngày, lấy quan sát đặc điểm hình thái KL (kích thước, hình dạng, màu sắc mặt trên, mặt thay đổi màu sắc, màu sắc môi trường sắc tố nấm tạo ra, dạng sợi nấm mọc mặt môi trường, đặc điểm mép khuẩn lạc, giọt nước đọng, chất hữu kết tinh bề mặt khuẩn lạc Quan sát vi thể nấm: Chuẩn bị môi trường PDA, đổ lớp mỏng (khoảng 1mm) lên đĩa Petri Sau đó, dùng khoan nút chai vơ trùng có d = 8mm, khoan khối thạch Đặt hai khối thạch lam kính, cấy bào tử lên bề mặt xung quanh khối thạch đặt lamen vô trùng lên bề mặt khối thạch Các phiến kính có khối thạch cấy nấm sợi nghiên cứu đặt đĩa Petri có sẵn bơng thấm nước làm ẩm nước cất vô trùng Giữ đĩa Petri tủ ấm – ngày Lúc quan sát nhỏ vài giọt xanh methylen Loffler gần lammel đặt giấy thấm phía đối diện để thuốc nhuộm thấm vào tiêu Dùng kính hiển vi quan sát mơ tả đặc điểm: Hình dạng cuống sinh bào tử, hình dạng thể bình, hình dạng thể bọng, sợi nấm có hay khơng có phân nhánh vách ngăn, đặc điểm bào tử đính, màu sắc, kích thước bào tử Chụp hình kính hiển vi quang học độ phóng đại 40 – 100 lần [5] 2.2.7 Phương pháp phân tích lovastatin Dịch chiết có chứa lovastatin sau quay hịa tan 200μl hỗn hợp acetonitril: H3PO4 0,1% (60:40, v/v) Hỗn hợp sau li tâm 13.000vịng/phút sử dụng 5μl để phân tích HPLC với cột C18, pha động acetonitril: H 3PO4 0,1% (60:40) Tín hiệu ghi nhận detector UV bước sóng 238nm Kết bàn luận 3.1 Phân lập chủng nấm sợi từ đất RNM Cần Giờ Kết phân lập cho thấy địa điểm lấy mẫu, thu số lượng NS tương đối lớn Điều cho thấy NS RNM Cần Giờ có số lượng phong phú, chúng phân bố hầu hết vùng đất RNM Chúng tiến hành phân nhóm chủng NS dựa vào đặc điểm hình thái KL sau ngày 120 chủng NS phân thành nhóm sau: Bảng 3.1 Kết phân lập chủng NS đất RNM Cần Giờ Nhóm Đặc điểm hình thái KL Số lượng Tỉ lệ % KL có màu trắng, dạng xốp bơng, mép nhẵn cưa 76 63,3 KL có màu xanh, viền màu trắng vàng, mép nhẵn cưa 11 9,2 KL có màu vàng, vàng nâu, viền trắng, có tiết sắc tố 4,2 KL có màu xám, viền trắng, mép nhẵn cưa 21 17,5 KL có màu đen, màu nâu, viền trắng, mép nhẵn cưa 3,3 KL có màu cam hồng, mép nhẵn có cưa 2,5 120 100 Tổng Sau phân lập, tiến hành khảo sát khả kháng nấm men 120 chủng NS để tạo tiền đề cho nghiên cứu 3.2 Khảo sát khả kháng nấm men chủng nấm sợi phân lập Saccharomyces cerevisiae có chứa lớp lipid kép màng tế bào, có cấu trúc tương tự cholesterol Thành phần thành tế bào NM bao gồm sterol, mục tiêu hoạt tính kháng nấm, cản trở tham gia enzyme vào trình tổng hợp vách tế bào [7] Do số lượng chủng tương đối nhiều, thời gian nghiên cứu tương đối ngắn nên tiến hành tuyển chọn sơ chủng NS có khả kháng NM để làm tiền đề cho nghiên cứu phía sau Kết thể Bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết khảo sát khả kháng NM chủng NS phân lập STT Chủng T8 Đường kính vịng kháng nấm men D – d (cm) 0,63a ± 0,06 T22 T25 T26 T34 T35 2,11f ± 0,08 1,50d ± 0,10 1,70e ± 0,10 0,97b ± 0,12 1,45d ± 0,09 T51 T70 1,47d ± 0,06 0,67a ± 0,06 10 T73 T76 1,00b ± 0,17 1,80e ± 0,10 11 T80 Ghi chú: a, b, c, d, e, f: khác biệt có ý nghĩa thống kê 1,17c ± 0,06 Kết cho thấy 120 chủng NS phân lập có 11 chủng có khả kháng nấm Saccharomyces cerevisiae (chiếm 9,17%) 3.3 Khảo sát khả sinh lovastatin chủng NS tuyển chọn Từ 11 chủng NS có khả kháng NM, tiến hành khảo sát khả sinh lovastatin Kết thể Bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết khảo sát khả sinh lovastatin chủng NS STT Chủng Đường kính vịng kháng nấm men D – d (cm) T8 T22 T25 0,00 2,15e ± 0,05 1,43b ± 0,06 T26 T34 T35 T51 1,60c ± 0,10 0,00 1,93d ± 0,06 0,00 10 11 T70 T73 T76 T80 0,00 1,83d ± 0,06 1,13a ± 0,06 0,00 Ghi chú: a, b, c, d, e: khác biệt có ý nghĩa thống kê Kết cho thấy 11 chủng có khả kháng nấm men có chủng có khả sinh lovastatin (chiếm 54,55%) Chủng T22 cho hoạt tính sinh lovastatin mạnh nhất, đường kính vịng kháng nấm men D – d = 2,15cm Sự khác biệt chủng có ý nghĩa mặt thống kê Vì vậy, chúng tơi định chọn chủng T22 để tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học định danh đến lồi sinh học phân tử Hình 3.1 Khả kháng S cerevisiae dịch lên men chủng T22 Hình 3.2 Khả kháng S cerevisiae dịch lên men chủng T25 Hình 3.3 Khả kháng S cerevisiae dịch lên men chủng T26 Hình 3.4 Khả kháng S cerevisiae dịch lên men chủng T35 Hình 3.5 Khả kháng S cerevisiae dịch lên men chủng T73 Hình 3.6 Khả kháng S cerevisiae dịch lên men chủng T76 3.4 Đặc điểm đại thể vi thể chủng T22 Đặc điểm đại thể: KL thường phát triển nhanh Ban đầu KL có màu trắng, sau chuyển thành vàng nâu, cuối chuyển thành màu nâu Nấm không tiết sắc tố vào MT Hình 3.7 Hình dạng KL chủng T22 sau ngày quan sát Đặc điểm vi thể: Sợi nấm phân nhánh, khơng màu, có vách ngăn Giá bào tử trần khơng phân nhánh, có phần đỉnh phình thành bọng hình nửa cầu Khối bào tử đính bên ngồi thành dạng hình tia tỏa trịn Hình 3.8 Hình thái vi thể chủng T22 3.5 Định danh đến loài sinh học phân tử Để định danh, gửi mẫu chủng T22 đến Công ti xét nghiệm Nam Khoa để giải trình tự gen 28S rRNA Kết sau: Hình 3.9 Kết giải trình tự 28S rRNA chủng T22 So sánh với ngân hàng gen NCBI, trình tự gen 28S rRNA chủng T22 có độ tương đồng 100% với loài Aspergillus terreus Kết luận chủng T22 thuộc lồi Aspergillus terreus Nhiều cơng trình giới cho thấy, Aspergillus terreus chủng sinh lovastatin cao ứng dụng nhiều sản xuất [1], [6], [10] 3.6 Kết phân tích lovastatin Kết phân tích cho thấy, có tương đồng thời gian lưu (RT) sắc kí đồ lovastatin chuẩn (RT = 4,766) lovastatin mẫu (RT = 4,766) chiết từ chủng T22 Điều khẳng định có diện lovastatin mẫu Hình 3.10 Kết phân tích HPLC phát lovastatin (a): Chất chuẩn; (b): Mẫu tách chiết từ chủng T22 Kết luận kiến nghị 4.1 Kết luận - - Qua kết thí nghiệm, đưa số kết luận sau: Đã phân lập 120 chủng NS từ mẫu đất tương ứng với địa điểm RNM Cần Giờ Đã xác định chủng NS khả sinh lovastatin, chủng sinh lovastatin mạnh (chiếm 16,67%); chủng sinh lovastatin trung bình (chiếm 50%); chủng sinh lovastatin yếu (chiếm 33,33%) Kết định danh chủng T22 việc giải trình tự gen 28S rRNA cho thấy chủng thuộc lồi Aspergillus terreus Đã phân tích HPLC phát diện diện lovastatin mẫu tách chiết từ chủng T22 4.2 Kiến nghị Tiếp tục khảo sát loại dung môi tách chiết lovastatin hiệu tiến hành định lượng lovastatin sinh nuôi cấy NS 1 10 11 TÀI LIỆU THAM KHẢO Chu Thanh Bình, Nguyễn Thu Hồi (2013), “Đặc điểm sinh học chủng Aspergillus terreus VNA 05 khả sinh tổng hợp lovastatin”, Nghiên cứu khoa học công nghệ, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, (5), tr 44 - 50 Nguyễn Lân Dũng (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập III, Nxb Khoa học Kĩ thuật Hà Nội Trần Thị Như Hằng (2010), Xác định hoạt tính sinh học chất hóa học số hoạt chất từ nấm nội sinh khổ sâm (Croton tonkinensis Gagnep.) bùm bụp (Mallotus apelta Lour.), Luận án Tiến sĩ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 57 Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học – tập 2, Thí nghiệm vi sinh vật học, Nxb Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, tái lần thứ nhất, Nxb Giáo dục Casas Lópeza, J L., Sánchez Péreza, J A., Fernández Sevillaa, J M., Acién Fernándeza, F G., Molina Grimaa, E., Chistib, Y (2003), “Production of lovastatin by Aspergillus terreus: effects of the C:N ratio and the principal nutrients on growth and metabolite production”, Enzyme and Microbial Technology, Vol 33 , pp 270 277 Prakash, C., Shivakumar, S (2014), “Bioprospecting of Lovastatin Producing Fungi Isolated from Soil Samples”, International Research Journal of Biological Sciences, Vol 3(9), pp 42 – 46 Quek, R F (2007), A study on Higher Marine Fungal Interaction, A Thesis Submitted For the Degree of Master of Science, National Universiti of Singapore, pp – 18 Radhakv, L (2013), “Lovastatin production and applications”, Asian Journal of Pharmakeutical and Clinical research, Vol 6, pp 21 – 26 Rizna, T D., Nina, A., Hani, M., Puspa Dewi, N L., and Minarti (2011), “Production of lovastatin and sulochrin by Aspergillus terreus using solid state fermentation”, Makara journal of technology, Vol 15, pp – http://www.tienphong.vn/Suc-Khoe-Bac-Si-Cua-Ban/lam-gi-de-phong-ngua-tangcholesterol-mau-572746.tpo, Truy cập lúc 22h00, ngày 15/09/2015 (Ngày Tòa soạn nhận bài: 17-6-2016; ngày phản biện đánh giá: 08-9-2016; ngày chấp nhận đăng: 13-9-2016) ... KL có màu cam hồng, mép nhẵn có cưa 2,5 120 100 Tổng Sau phân lập, tiến hành khảo sát khả kháng nấm men 120 chủng NS để tạo tiền đề cho nghiên cứu 3.2 Khảo sát khả kháng nấm men chủng nấm sợi phân. .. biệt có ý nghĩa thống kê 1,17c ± 0,06 Kết cho thấy 120 chủng NS phân lập có 11 chủng có khả kháng nấm Saccharomyces cerevisiae (chiếm 9,17%) 3.3 Khảo sát khả sinh lovastatin chủng NS tuyển chọn Từ. .. phân lập chủng nấm có khả sinh lovastatin, đem lại suất cao từ nguồn nguyên liệu tự nhiên có giới Theo kết nhiều nghiên cứu cho thấy, chủng vi sinh vật (VSV) phân lập từ đất thường tạo chất có