Trịnh Thới An Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG NẤM PYTHIUM SP TRỊNH THỚI AN* TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, tiến hành phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh chất kháng nấm Pythium sp đất trồng rau xã Phước Hậu, huyện Cần Giuộc, tỉnh Long An Đồng thời, chúng tơi tiến hành tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu nhận chất kháng nấm chủng xạ khuẩn bước đầu tìm hiểu ảnh hưởng chất kháng nấm đến nảy mầm hạt sinh trưởng phát triển cải xanh Từ khóa: xạ khuẩn, Pythium sp., chất kháng nấm ABSTRACT Isolating and selecting of actinomycetes strains capable of producing antifungal Pythium sp In this study, we isolated and selected strains of actinomycetes that are capable of producing antifungal Pythium sp on vegetables planting soil in Phuoc Hau, Can Giuoc district, Long An province At the same time, we carried out the optimization of culture conditions to obtain antifungal strains of actinomycetes and initialli investigated the effects of antifungal substances to the germination and the growth and development of mustard plants Keywords: Actinomyces, Pythium sp., antifungal Mở đầu Việt Nam nước nơng nghiệp, có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, mưa nhiều thuận lợi cho vi sinh vật (VSV) phát triển, có VSV gây hại nơng phẩm nói chung rau màu nói riêng Huyện Cần Giuộc - tỉnh Long An - huyện trồng nhiều loại rau màu cung cấp cho chợ đầu mối Thành phố Hồ Chí Minh chợ nhỏ lân cận Để phòng trừ bệnh VSV gây nên, người nông dân thường sử dụng thuốc hóa học với liều lượng cao Điều mặt dẫn đến việc nhờn thuốc loài VSV gây bệnh, mặt khác dẫn đến việc ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người động vật khác, làm cân sinh thái Hiện nay, giới Việt Nam, hướng tới nông nghiệp cách sử dụng biện pháp sinh học Biện pháp sử dụng tác nhân sinh học thay tác nhân hóa học xem chiến lược tổ chức lương nông FAO (1992) an tồn cho người cho mơi trường Một biện pháp thực việc sử dụng VSV đối kháng với VSV gây bệnh Trong nhóm VSV có khả sinh chất đối kháng, xạ khuẩn nhóm * HVCH, Trường Đại học Sư phạm TPHCM quan tâm nghiên cứu nhiều xạ khuẩn có khả sinh chất đối kháng với tỉ lệ cao, có nhiều chất kháng mạnh nấm gây bệnh thực vật Từ lí trên, chúng tơi tiến hành nghiên cứu: “Phân lập, tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh chất kháng nấm Pythium sp.” Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng Nghiên cứu thực đối tượng: - Các chủng xạ khuẩn phân lập đất trồng rau màu xã Phước Hậu, huyện Cần Giuộc, tỉnh Long An - Vi sinh vật kiểm định: nấm Pythium sp nhận từ sưu tập giống Viện Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh - Hạt cải xanh ông Đặng Văn Đởm (ấp Long Giêng, xã Phước Hậu, huyện Cần Giuộc, tỉnh Long An) cung cấp 2.1.2 Môi trường nuôi cấy Môi trường Gause I: tinh bột tan 20g, MgSO4.7H2O 0,5g, KNO3 1g, NaCl 0,5g, FeSO4.7H2O 0,01g, K2HPO4 0,5g, agar 20g, nước cất đủ 1000ml pH = 7,2 - 7,4 Môi trường Gause II: cao thịt 4g, peptone 5g, glucose 10g, agar 20g, nước cất đủ 1000ml pH = 7,2 - 7,4 Môi trường A-H4: glucose 15g, bột đậu tương 15g, NaCl 5g, CaCO3 1g, nước cất đủ 1000ml pH = 7,0 Môi trường ISP4: tinh bột tan 10g, K2HPO4 1g, MgSO4.7H2O 1g, CaCO3 2g, NaCl 1g, (NH4)2SO4 2g, agar 20g, nước cất đủ 1000ml pH = 7,2 - 7,4 Môi trường PGA: khoai tây 300g, glucose 50g, agar 20g, nước cất đủ 1000ml Cách chế dịch khoai tây: khoai tây gọt vỏ, rửa Cân 300g, thái nhỏ, thêm 1000ml nước, đun sôi, nhỏ lửa 30 phút, lọc lấy dịch 2.2 Phương pháp nghiên cứu Thu mẫu đất tiến hành phân lập xạ khuẩn mơi trường Gause I Sau đó, tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm Pythium sp phương pháp cấy chấm điểm Mô tả đặc điểm chủng xạ khuẩn tuyển chọn quan sát đại thể quan sát vi thể [2], [5] Khảo sát điều kiện lên men: chủng xạ khuẩn tuyển chọn ni cấy bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường bổ sung 2% giống, thay đổi điều kiện như: loại môi trường (Gause I, Gause II, A-H4, ISP4), nguồn carbon (tinh bột tan, glucose, maltose, sucrose, rỉ đường), nguồn nitrogen (bột đậu tương, pepton, cao thịt, cao nấm men, NH 4NO3), pH (6, 6.5, 7, 7.5, 8), nhiệt độ (25 oC, 30oC, 35oC, 40oC), nuôi máy lắc với tốc độ 180 vịng /phút vịng 72 Sau đó, thử hoạt tính kháng nấm phương pháp khoan lỗ thạch [3] Định danh đến lồi phương pháp giải trình tự r-RNA 16S [3] Tách chiết thu nhận dịch kháng nấm bước đầu xác định khả ảnh hưởng chất đến khả nảy mầm hạt sinh trưởng, phát triển [3] Kết biện luận 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh chất kháng mạnh nấm Pythium sp Từ mẫu đất thu nhận được, phân lập 30 kiểu khuẩn lạc xạ khuẩn (tạm gọi chủng) khác kí hiệu từ A1 đến A30 Chúng tơi tiến hành phân nhóm chủng xạ khuẩn dựa vào đặc điểm sau: màu sắc khuẩn lạc, màu sắc mép khuẩn lạc, hình dạng mép khuẩn lạc sắc tố tan 30 chủng xạ khuẩn phân lập phân chia thành nhóm sau (hình 3.1): - Nhóm 1: trắng, gồm 14 chủng (46,7%) - Nhóm 2: xám- đen, gồm chủng (26,7%) - Nhóm 3: đỏ - hồng – nâu, gồm chủng (26,6%) Nhóm Nhóm Nhóm Hình 3.1 Ảnh đại diện nhóm xạ khuẩn phân lập Khảo sát sơ khả kháng nấm Pythium sp chủng xạ khuẩn phân lập phương pháp cấy chấm điểm Kết cho thấy, 30 chủng phân lập có chủng có khả tổng hợp chất kháng nấm Pythium sp Trong có chủng kháng nấm mạnh, chủng kháng nấm trung bình chủng kháng nấm yếu (bảng 3.1) Chủng A25 có khả sinh chất kháng nấm Pythium sp mạnh nên lựa chọn sử dụng cho nghiên cứu Bảng 3.1 Các chủng xạ khuẩn có khả kháng nấm Pythium sp TT Chủng xạ khuẩn A5 A7 A10 A19 A25 A26 Hoạt tính kháng nấm Pythium sp (D - d, cm) 0,6 1,6 0,8 1,2 2,1 1,6 3.2 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn A25 Chủng xạ khuẩn A25 cấy chấm điểm môi trường Gause I nuôi ngày tạo thành khuẩn lạc có đường kính khoảng 7mm Mặt khuẩn lạc sần sùi, màu nâu đỏ Mép khuẩn lạc màu nâu đỏ hình cưa Mặt khuẩn lạc nhẵn (hình 3.2.) Hình 3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng xạ khuẩn A25 3.3 Khảo sát điều kiện lên men ảnh hưởng đến khả tổng hợp chất kháng nấm Pythium sp chủng xạ khuẩn A25 3.3.1 Lựa chọn mơi trường lên men thích hợp Chủng A25 khảo sát loại môi trường khác nhau: Gause I, Gause II, AH4, ISP4 thử hoạt tính kháng nấm phương pháp khoan lỗ thạch Kết thể bảng 3.2 Bảng 3.2 Hoạt tính kháng nấm Pythium sp chủng xạ khuẩn A25 môi trường lên men khác STT Môi trường Gause I Gause II A-H4 ISP4 Hoạt tính kháng nấm Pythium sp (D - d, cm) 2,0 ± 0,23 2,1 ± 0,29 2,2 ± 0,15 1,9 ± 0,20 Từ kết cho thấy, chủng xạ khuẩn A25 sinh trưởng tổng hợp chất kháng nấm Pythium sp loại môi trường Trong đó, ni cấy AH4 chủng xạ khuẩn A25 thể hoạt tính cao môi trường tương đối đơn giản nên chúng tơi sử dụng để tiến hành thí nghiệm MT A-H4 MT Gause I MT Gause II MT ISP4 Hình 3.3 Hoạt tính kháng nấm Pythium sp chủng A25 bốn loại môi trường 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitrogen đến khả tổng hợp chất kháng nấm Pythium sp chủng xạ khuẩn A25 Chúng tiến hành nuôi chủng xạ khuẩn A25 môi trường A-H4 thay N tổng số peptone, cao thịt, cao nấm men, NH 4NO3, bột đậu tương với lượng tương đương Kết thể hình 3.4 3.5 D – d, (c m) 2.5 1.5 2.0 2.3 2.7 3.2 3.3 0.5 Pepton Cao thịt Cao nấm NH4NO3 Bột đậu men tương Nguồn Nitrogen Hình 3.4 Biểu đồ ảnh hưởng nguồn nitrogen lên khả tổng hợp chất kháng nấm Pythium sp chủng xạ khuẩn A25 Từ kết cho thấy, chủng xạ khuẩn A25 có khả tổng hợp chất kháng nấm mạnh nhiều nguồn nitrogen khác Tuy nhiên, nguồn đạm thực vật lại sử dụng tốt cho tổng hợp chất kháng nấm chủng A25 Từ kết trên, sử dụng môi trường A-H4 với nguồn nitrogen bột đậu tương cho nghiên cứu 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon đến khả tổng hợp chất kháng nấm Pythium sp chủng xạ khuẩn A25 Chúng tiến hành nuôi chủng xạ khuẩn A25 môi trường A-H4 với nguồn nitrogen bột đậu tương thay C tổng số tinh bột tan, sucrose, maltose, glucose, rỉ đường với lượng tương đương Kết thể hình 3.5 D – d, (c m) 3.2 3.1 2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 2.4 2.3 3.1 2.6 Tinh bột tan 2.7 2.6 2.6 Sucrose Manltose Glucose Rỉ đường Nguồn Carbon Hình 3.5 Biểu đồ ảnh hưởng nguồn carbon lên khả tổng hợp chất kháng nấm Pythium sp chủng xạ khuẩn A25 Từ kết cho thấy, chủng xạ khuẩn A25 có khả sinh trưởng, phát triển tổng hợp chất kháng nấm mạnh nguồn carbon khác Điều giải thích xạ khuẩn có khả tồn nhiều mơi trường khác Trong đó, nguồn carbon chủng xạ khuẩn A25 sử dụng cho việc tổng hợp chất kháng nấm tốt glucose Đó nguồn carbon lựa chọn cho nghiên cứu 3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu đến khả tổng hợp chất kháng nấm Pythium sp chủng xạ khuẩn A25 Kết thể hình 3.6 D – d, (c m) 3.5 2.5 1.5 0.5 2,6 2,9 2,6 2,5 2,0 6.5 7.5 pH Hình 3.6 Đồ thị ảnh hưởng pH ban đầu môi trường lên khả tổng hợp chất kháng nấm Pythium sp chủng xạ khuẩn A25 Từ đồ thị cho thấy, chủng xạ khuẩn A25 sinh trưởng, phát triển tổng hợp chất kháng nấm tốt tất pH thí nghiệm Tuy nhiên, pH để chủng xạ khuẩn A25 sinh chất kháng nấm tốt 6,5 3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả tổng hợp chất kháng nấm Pythium sp chủng xạ khuẩn A25 Để tìm nhiệt độ tối ưu cho việc tổng hợp chất kháng nấm chủng xạ khuẩn A25, tiến hành khảo sát nhiệt độ: 25 oC, 30oC, 35 oC, 40 oC Kết thể hình 3.7 D – d, (c m) 2.5 2.9 1.5 1.8 2.2 1.9 0.5 25 30 35 40 Nhiệt độ Hình 3.7 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ lên khả tổng hợp chất kháng nấm Pythium sp chủng xạ khuẩn A25 Từ biểu đồ ta thấy, chủng xạ khuẩn A25 sinh tổng hợp chất kháng nấm mạnh 30-35oC nhiệt độ tối ưu 35oC, thích hợp cho việc ứng dụng đồng ruộng 3.3 Định danh đến loài chủng xạ khuẩn A25 sinh học phân tử Trình tự DNA r-RNA 16S thu nhận PCR với cặp mồi 27F 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 1492R 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT’-3’ Sản phẩm gen mã hóa r-RNA phân tích điện di agarose 1% Kết điện di thể hình 3.8 M r-RNA16S Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm gen chủng xạ khuẩn A25 Trình tự DNA phân tích giống, giống cột với trình tự công bố NCBI Kết so sánh cho thấy chủng xạ khuẩn A25 có trình tự tương đồng 100% với trình tự gen chủng xạ khuẩn Streptomyces pseudogriseolus trình tự vùng 16S-rRNA Kết cho phép kết luận chủng xạ khuẩn A25 chủng xạ khuẩn Streptomyces pseudogriseolus gọi chủng S pseudogriseolus A25 3.4 Tách chiết thu nhận chất kháng nấm Sau nuôi sinh khối, dịch nuôi cấy thu nhận cách li tâm Dịch nuôi cấy sau loại bỏ sinh khối tách chiết etyl acetate, tỉ lệ dịch nuôi cấy dung môi 1:1 Hỗn hợp dịch nuôi cấy dung môi lắc với 30 phút nhiệt độ phịng Sau đó, sử dụng dịch thu nhận thử hoạt tính kháng nấm Pythium sp phương pháp khoan lỗ thạch 3.5 Xác định khả ảnh hưởng dịch kháng nấm đến khả nảy mầm hạt sinh trưởng, phát triển Dịch kháng nấm sau kiểm tra tính kháng nấm pha loãng đến nồng độ 1%, 10%, 20%, 50%, 100% Ngâm hạt cải xanh vào vòng 20 phút Sau đó, lấy hạt để vào đĩa Petri có lót bơng thấm nước tẩm ướt dịch có nồng độ tương ứng, hàng ngày bổ sung dịch pha lỗng có nồng độ tương ứng Quan sát nảy mầm hạt sau ngày sinh trưởng sau ngày Kết thể hình 3.9 Nồng độ 100% Nồng độ 50% Nồng độ 20% Nồng độ 10% Nồng độ 1% Hình 3.9 Ảnh hưởng nồng độ dịch kháng nấm lên khả nảy mầm hạt cải xanh Sau ngày gieo hạt, quan sát thấy dịch kháng nấm pha lỗng có tác dụng kích thích nảy mầm hạt, nồng độ dịch kháng nấm cao nảy mầm hạt Trong đó, dịch kháng nấm khơng pha lỗng (100%) gần ức chế nảy mầm hạt (hình 3.10) Nồng độ 1% Nồng độ 10% Nồng độ 20% Nồng độ 100% Nồng độ 50% Hình 3.10 Ảnh hưởng nồng độ dịch kháng nấm lên sinh trưởng, phát triển cải xanh Quan sát sinh trưởng sau ngày gieo, nhận thấy dịch kháng nấm có tác dụng kích thích sinh trưởng, phát triển Khi nồng độ thấp, dịch kháng nấm kích thích sinh trưởng, phát triển Khi nồng độ cao, dịch kháng nấm kìm hãm phát triển hệ rễ từ kìm hãm sinh trưởng phát triển (hình 3.11) (1) (2) (3) (4) (5) (6) (1) : Nồng độ (2) : Nồng độ (3) : Nồng độ (4) : Nồng độ (5) : Nồng độ (6) Nước cất 100% 50% 20% 10% 1% Hình 3.11 So sánh ảnh hưởng dịch kháng nấm lên phát triển hệ rễ Kết luận Sau q trình nghiên cứu, chúng tơi thu kết sau: Đã phân lập 30 chủng xạ khuẩn từ đất trồng rau màu xã Phước Hậu, huyện Cần Giuộc, tỉnh Long An, có chủng sinh chất kháng nấm Pythium sp mạnh Xác định điều kiện lên men thích hợp cho việc thu nhận chất kháng nấm Pythium sp.: MT A-H4 (glucose 15g, bột đậu tương 15g, NaCl 5g, CaCO 1g, nước cất đủ 1000ml), pH=6,5, nhiệt độ 35oC, nuôi lắc 180 vòng/phút, 72 Chủng xạ khuẩn tiềm định danh Streptomyces pseudogriseolus phương pháp giải trình tự vùng 16S-rRNA Ở nồng độ pha lỗng (1%), dịch kháng nấm kích thích nảy mầm hạt sinh trưởng, phát triển - - TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2009), Vi sinh vật học, Tái lần 8, Nxb Giáo dục, tr 39-41, tr 63-71, tr 148-157 Nguyễn Thành Đạt (2007), Cơ sở sinh học vi sinh vật, tập 1, Nxb Đại học Sư phạm, tr.102-106 Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 3-48 Lester W Burgess, Timothy E Knight, Len Tesoriero, Phan Thúy Hiền (2009), Cẩm nang đoán bệnh trồng Việt Nam, Trung tâm nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nxb Giáo dục Hopwood D.A and MJ Merrick (1977), Genetics of antibiotic production, Bacteriol Rev Waksman, S.A (1961), The Actinomycetes Classsification, indentification and descriptions of genera and species, Vol 2, The William & Wilkins Co., Bantimore, USA (Ngày Tòa soạn nhận bài: 21-7-2014; ngày phản biện đánh giá: 15-82014; ngày chấp nhận đăng: 20-8-2014) Long An SĐT: 0122.88.321.88 Email: trinhthoian@gmail.com GVHD: TS Trần Thanh Thủy, Trường ĐHSP TP.HCM ... phân lập có chủng có khả tổng hợp chất kháng nấm Pythium sp Trong có chủng kháng nấm mạnh, chủng kháng nấm trung bình chủng kháng nấm yếu (bảng 3.1) Chủng A25 có khả sinh chất kháng nấm Pythium. .. nhiều xạ khuẩn có khả sinh chất đối kháng với tỉ lệ cao, có nhiều chất kháng mạnh nấm gây bệnh thực vật Từ lí trên, tiến hành nghiên cứu: ? ?Phân lập, tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh chất kháng. .. dịch kháng nấm bước đầu xác định khả ảnh hưởng chất đến khả nảy mầm hạt sinh trưởng, phát triển [3] Kết biện luận 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh chất kháng mạnh nấm Pythium