(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)

(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN HỮU DŨNG NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NUÔI TRỒNG NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris) TRÊN GIÁ THỂ TẰM DÂU (Bombyx mori L.)” CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS BÙI VĂN THẮNG, Hà Nội, 2020 i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập trƣờng Đại học Lâm nghiệp, đƣợc đồng ý nhà trƣờng, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, thực luận văn tốt nghiệp với đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)” Để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp, cố gắng nỗ lực thân, nhận đƣợc nhiều giúp đỡ tận tình cá nhân tập thể Trƣớc tiên xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Bùi Văn Thắng, giảng viên trƣờng Đại học Lâm nghiệp, ngƣời hƣớng dẫn, bảo chu đáo, tận tình suốt q trình tơi thực nghiên cứu đề tài khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn ban lãnh đạo thầy cô giáo giảng dạy Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp dạy bảo, trang bị cho kiến thức quý báu suốt năm học vừa qua Bài luận văn tốt nghiệp dấu mốc quan trọng đánh dấu trƣởng thành kết tổng kết đào tạo học viên Sau học chuyên ngành Công nghệ sinh học trƣờng Đại học Lâm nghiệp Với nội dung nghiên cứu nỗ lực cố gắng áp dụng đƣợc học đƣa vào thực đề tài Mặc dù cố gắng nhƣng trình độ thời gian có hạn nên luận văn khơng tránh khỏi thiếu sót, kính mong thầy bạn đọc đóng góp ý kiến để luận văn tơi đƣợc hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2020 Sinh viên thực Nguyễn Hữu Dũng ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v Chƣơng TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.1.Giới thiệu nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.2 Sự phân bố nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.3 Vòng đời chế lây nhiễm Đông trùng hạ thảo vào thể côn trùng 1.1.4 Sự lây nhiễm nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps vào thể côn trùng 1.1.5 Phân loại nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.6 Thành phần hóa học nấm Đơng trùng hạ thảo 1.1.7 Giá trị dƣợc liệu nấm Cordyceps militaris 11 1.1.8 Tình hình nghiên cứu ni trồng nấm Đơng trùng hạ thảo 13 1.1.9 Các yếu tố ảnh hƣởng đến q trình ni trồng nấm Cordyceps militari 21 1.2 Giới thiệu tằm dâu 23 Chƣơng MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU27 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 27 2.1.1 Mục tiêu tổng quát 27 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 27 2.2 Vật liệu nghiên cứu 27 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 27 2.2.2 Hoá chất thiết bị 27 iii 2.3 Nội dung nghiên cứu 28 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.4.1 Phƣơng pháp gây nhiễm nấm vào giá thể tằm 28 2.4.2 Nghiên cứu thời gian nuôi tối phù hợp cho phát triển hệ sợi tằm 30 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kết gây nhiễm nấm vào tằm 34 3.1.1 Gây nhiễm phƣơng pháp tiêm 34 3.1.2 Gây nhiễm phƣơng pháp phun bề mặt 36 3.2 Ảnh hƣởng thời gian nuôi tối đến phát triển mầm thể nấm 38 3.3 Ảnh hƣởng điều kiện nuôi trồng đến phát triển thể nấm 42 3.3.1 Ảnh hƣởng độ ẩm phịng ni đến phát triển thể nấm 42 3.3.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ phịng ni đến phát triển thể nấm 43 3.3.3 Ảnh hƣởng cƣờng độ ánh sáng thời gian chiếu sáng đến phát triển thể nấm 45 3.4 Ảnh hƣởng phƣơng thức nuôi trồng đến phát triển thể nấm 48 3.5 Kết phân tích hoạt chất Adenosine Cordycepin giá thể tằm 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………… ……….53 PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại nấm Đông trùng hạ thảo Bảng 3.1: Ảnh hƣởng thể tích dịch giống nấm đến tỷ lệ nhiễm ăn lan hệ sợi tằm phƣơng pháp tiêm 35 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng thể tích dịch giống nấm đến tỷ lệ nhiễm ăn lan hệ sợi tằm phƣơng pháp phun bề mặt 37 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng thời gian nuôi tối đến phát triển mầm thể nấm 40 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng độ ẩm đến phát triển thể nấm 43 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển thể nấm 44 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng cƣờng độ ánh sáng thời gian chiếu sáng đến phát triển thể nấm 47 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng cách gây nhiễm phƣơng thức nuôi đến phát triển thể nấm 49 Bảng 3.8 Kết phân tích hàm lƣợng Adenosine Cordycepin nấm đông trùng hạ thảo nuôi trồng giá thể tằm nguyên 51 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Đơng trùng hạ thảo C militaris ngồi tự nhiên (Nguồn: Biological Resource Center, NITE – NBRC) Hình 1.2 Cơng thức số nucleotid Đông trùng hạ thảo 10 Hình 1.3 Vịng đời tằm dâu 25 Hình 2.1: Lây nhiễm nấm vào tằm phƣơng pháp tiêm A - tiêm dung dịch giống nấm vào phần đầu; B- đặt tằm sau tiêm nằm ngang giấy thấm; Cđặt tằm sau tiêm vào ống nhựa đen 29 Hình 2.2: Lây nhiễm nấm vào tằm phƣơng pháp phun dịch giống nấm lên thân tằm 30 Hình 3.1 Con tằm bị nhiễm với 150 µl dung dịch giống nấm sau 10 ngày gây nhiễm, ni tối, nhiệt độ phịng ni 22OC, độ ẩm 60% A: Con tằm sau gây nhiễm đặt đứng ống nhựa đen; B: Con tằm sau gây nhiễm đặt nằm ngang giấy thấm vô trùng 35 Hình 3.2 Con tằm bị nhiễm với thể tích dung dịch giống nấm khác sau 10 ngày gây nhiễm, ni tối, nhiệt độ phịng ni 22OC, độ ẩm 60% 38 Hình 3.3 Con tằm bị nhiễm nấm nuôi tối ngày chuyển sang nuôi sáng A: nuôi tối ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày 40 Hình 3.4 Con tằm bị nhiễm nấm ni tối ngày chuyển sang nuôi sáng A: nuôi tối ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày 41 Hình 3.5 Con tằm bị nhiễm nấm nuôi tối 12 ngày chuyển sang nuôi sáng A: nuôi tối 12 ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày 41 Hình 3.6 Con tằm bị nhiễm nấm ni tối 15 ngày chuyển sang nuôi sáng A: nuôi tối 15 ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày 41 Hình 3.7 Quả thể nấm phát triển tằm nuôi điều kiện nuôi độ ẩm khác A- độ ẩm 80%; B- độ ẩm 85%; C- độ ẩm 90% D- độ ẩm 95% 43 vi Hình 3.8 Quả thể nấm phát triển tằm nuôi điều kiện nhiệt độ nuôi khác A- nhiệt độ phịng ni 18OC; B- nhiệt độ phịng ni 20OC; C- nhiệt độ phịng ni 22OC D- nhiệt độ phịng ni 25OC 45 Hình 3.9 Quả thể nấm phát triển tằm nuôi điều kiện cƣờng độ ánh sáng 700 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày, nhiệt độ nuôi 22OC độ ẩm 85% 47 Hình 3.10 Quả thể nấm phát triển tằm nuôi đặt nằm ngang giấy thấm sau 40 ngày chiếu sáng điều kiện: cƣờng độ ánh sáng 700 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày, nhiệt độ nuôi 22OC độ ẩm 85% A- gây nhiễm nấm cách phun dịch giống nấm bề mặt tằm; B- gây nhiễm nấm cách tiêm dịch giống nấm vào phần đầu tằm 49 Hình 3.11 Quả thể nấm phát triển tằm nuôi đặt thẳng đứng ống nhựa đen sau 40 ngày chiếu sáng điều kiện: cƣờng độ ánh sáng 700 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày, nhiệt độ nuôi 22OC độ ẩm 85% 50 Hình 3.12 Nấm đông trùng hạ thảo tằm nguyên tƣơi thu hoạch (A) nấm đông trùng hạ thảo tằm nguyên khô đƣợc sấy phƣơng pháp sấy thăng hoa (B) 50 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, tình hình gia tăng loại bệnh hiểm nghèo mối lo ngại quốc gia trế giới Các nhà khoa học dày cơng nghiên cứu, tìm liệu pháp hữu hiệu để giải vấn đề Con ngƣời dần chuyển hƣớng từ việc sử dụng loại thuốc đƣợc tổng hợp hóa học sang ƣu tiên sử dụng loại thực phẩm chức năng, loại thuốc có nguồn gốc hữu từ thiên nhiên Và loài nấm dƣợc liệu đối tƣợng đƣợc ý nhiều đa dạng hợp chất sinh học mà chúng chứa sinh khối Từ xƣa, ngƣời biết sử dụng số loại nấm bổ sung phƣơng thuốc cổ truyền để chữa bệnh nhƣ bồi bổ sức khỏe, nhƣ nấm linh chi, nấm lim xanh, nấm tuyết (mộc nhĩ trắng), v.v, đặc biệt nấm Đông trùng hạ thảo Nấm Đông trùng hạ thảo thuộc chi Cordyceps loài nấm ký sinh sâu non, nhộng sâu trƣởng thành số lồi trùng Hơn 400 phân lồi nấm thuộc chi Cordyceps tìm thấy mơ tả, nhiên có khoảng 36 lồi đƣợc nuôi trồng điều kiện nhân tạo để sản xuất thể (Wang, 1995; Sung, 1996; Li et al., 2006) Trong số lồi này, có lồi C militaris đƣợc trồng thành công quy mô lớn có chứa nhiều chất có hoạt chất sinh học (Li et al, 2006) Loài nấm C militaris, phân bố vùng núi có độ cao từ 2.000 - 3.000 m so với mực nƣớc biển, có chứa hàm lƣợng hoạt chất có hoạt tính sinh học thể nhƣ: cordycepin, mannitol, cordypolysaccarid, superoxide dismutise nhiều thành phần hoạt chất quý khác Nhờ hợp chất sinh học giá trị nên loại nấm C militaris đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều, đặc biệt cơng trình nghiên cứu lâm sàng, nhƣ: nghiên cứu kìm hãm phát triển tế bào ung thƣ máu (Kim et al., 2006, Lee H.et al.,2006, Park C et al.,2005), ung thƣ phổi, ung thƣ vú (Ahn Y.J et al., 2001) Nhiều nghiên cứu chứng minh nấm có hiệu chữa trị rối loạn chức gan (Nan J.X et al., 2001), lão hoá, chứng viêm tấy (Won S.Y and Park E.H., 2005) Ngồi cịn có tác dụng kìm hãm oxy hoá lipid, lipoprotein lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J.E and Kamendulis L.M., 2004, Balaban R.S et al., 2005), Nấm có khả trì tốt chức thận, phổi, chống lão hóa, điều hịa giấc ngủ, viêm phế quản mãn tính (Das et al., 2010) Hai loài C militaris C sinensis đƣợc nghiên cứu nhiều nuôi trồng, lên men, chiết xuất sản xuất dƣợc chất; có giá tri dƣợc liệu giá tri kinh tế cao (Liu et al., 2001; Li et al., 2006) Loài C sinensis loại nấm dƣợc liệu có phân bố hạn chế tƣ nhiên đến chƣa có cơng trình báo cáo ni cấy thành cơng nên khan Loài C militaris chứa hợp chất sinh học tƣơng tự nhƣ loài C.sinensis, nhƣng dễ dàng nuôi trồng môi trƣờng nhân tạo (Li et al 1995; Dong et al., 2012) Do giá tri dƣợc liệu, giá trị kinh tế cao nên có nhiều cơng trình nghiên cứu ni trồng lồi nấm C militaris đƣợc công bố áp dụng vào sản xuất Tuy nhiên, hầu hết cơng trình công bố nuôi trồng nấm C militaris môi trƣờng tổng hợp bổ sung bột nhộng tằm, pepton, cao nấm men nuôi cấy ký chủ nhộng tằm Với mong muốn, tạo sản phẩm nấm Đông trùng hạ thảo C militaris có chất lƣợng tốt, gần giống với tự nhiên; tiến hành đề tài hiên cứu: “Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)” Chƣơng TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.1 Giới thiệu nấm Đông trùng hạ thảo Trong lịch sử phát triển Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo (nấm ĐTHT) loại thuốc quý đƣợc sử dụng từ hàng ngàn năm trƣớc dùng cho bậc vua chúa Theo đông y Trung Quốc, loại nấm có tác dụng hỗ trợ chữa nhiều bệnh nhƣ bệnh phổi, thận, đổ mồ trộm, đau lƣng, yếu sinh lý v.v Chính vậy, nấm Đơng trùng hạ thảo đƣợc ngƣời Trung Quốc xem nhƣ nhân sâm (Theo Sách y học cổ truyền Trung Quốc) Nấm Đơng trùng hạ thảo (cịn gọi Đông trùng thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo đông trùng) loài nấm ký sinh sâu non, nhộng sâu trƣởng thành số loài côn trùng Vào mùa đông, sâu non, sâu trƣởng thành số loài nằm dƣới đất mặt đất, bị nấm ký sinh côn trùng xâm nhiễm sử dụng chất thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng chết Giai đoạn nhiệt độ ẩm độ khơng khí thấp, nấm ký sinh phát triển dạng hệ sợi Đến mùa hè, nhiệt độ ẩm độ khơng khí cao, nấm chuyển giai đoạn, hình thành thể nhú lên khỏi mặt đất nhƣng gốc dính liền vào thân sâu Vì mùa đơng nấm ký sinh trùng, mùa hạ mọc thành thể nấm nên có tên Đông trùng hạ thảo Để thu hoạch nấm ngƣời ta thƣờng đào lấy xác sâu nấm để làm thuốc Ngày nay, hiệu sử dụng chất dinh dƣỡng nấm Đông trùng hạ thảo đƣợc khoa học chứng minh Nhiều nhóm nghiên cứu giới nghiên cứu, điều tra thu thập nấm Đơng trùng hạ thảo ngồi tự nhiên, ni trồng để làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức phục vụ cho ngƣời Cordyceps militaris loài nấm thuộc họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps Loài đƣợc Carl Linnaeus mô tả vào năm 1753 với tên gọi Clavaria militaris (Kobayasi, 1982) 47 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng cƣờng độ ánh sáng thời gian chiếu s ng đến phát triển thể nấm Cƣờng độ ánh sáng (lux) 700 1400 2100 2800 700 1400 2100 2800 700 1400 2100 2800 Thời Số tằm Số gian thí tằm chiếu nghiệm bật sáng (con) mầm (h/ngày) thể 256 252 210 185 12h/ngày 240 85 240 25 265 258 243 168 14h/ngày 325 127 215 18 255 233 274 120 16h/ngày 210 32 287 17 Tỷ lệ bật mầm thể (%) 98,4 88,1 35,4 10,4 97,4 69,1 39,1 8,37 91,4 43,8 15,2 5,9 Tổng Số Chiều số lƣ ng dài thể thể TB/con thể TB (cm) 355 1,39 4,4 172 0,82 3,4 74 0,31 1,5 15 0,06 0,6 378 1,43 4,6 155 0,64 3,7 65 0,20 1,1 11 0,05 0,5 285 1,12 3,8 98 0,36 2,2 21 0,10 0,7 0,02 0,5 Hình 3.9 Quả thể nấm phát triển tằm nuôi điều kiện cƣờng độ ánh sáng 700 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày, nhiệt độ nuôi 22OC độ ẩm 85% 48 3.4 Ảnh hƣởng phƣơng thức nuôi trồng đến ph t triển thể nấm Kết thí nghiệm ni cấy nấm đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris k thuật điều kiện nuôi cấy thích hợp (tằm sau gây nhiễm ni tối nhiệt độ 22OC, độ ẩm 60% 12 ngày, sau chuyển ni sáng với cƣờng độ ánh sáng 700 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày, nhiệt độ 22OC độ ẩm 85%) với phƣơng thức nuôi cấy gây nhiễm khác Sau 40 ngày nuôi sáng phát triển thể, số liệu đƣợc thống kê xử lý trình bày nhƣ bảng 3.7 Kết thu đƣợc cho thấy cách thức gây nhiễm tiêm dịch giống nấm vào phần đầu tằm cho tỷ lệ tằm bật mầm thể cao (97,4 – 100%), số lƣợng thể trung bình/con đạt (1,41 – 3,3) chiều dài thể trung bình đạt (4,52 – 4,8 cm) Ngƣợc lại, gây nhiễm phƣơng pháp phun dịch nấm bề mặt tằm cho tỷ lệ tằm bật mầm thể thấp đạt 24,8%, số lƣợng thể trung bình/con 0,31 thể phát triển chiều dài (0,65cm) Cùng cách thức gây nhiễm tiêm, so sánh phƣơng thức nuôi cấy thẳng đứng ống nhựa đen nuôi nằm ngang giấy thấm cho tỷ lệ tằm bật mầm thể cao (97,4% 100%) gần nhƣ tƣơng đƣơng nhƣng số lƣợng thể trung bình/con khác rõ rệt; nuôi đặt nằm ngang giấy thấm số lƣợng thể trung bình/con cao gấp 2,34 lần so với phƣơng thức nuôi đứng ống nhựa đen chiều dài thể dài Xét suất thể phƣơng thức ni đặt nằm ngang số lƣợng thể cao so với phƣơng thức nuôi đặt đứng ống nhựa đen Tuy nhiên, hình thức sản phẩm tằm mọc thể phần đầu dễ đóng gói sấy khơ, vận chuyển không bị gãy vụn đƣợc thị trƣờng, ngƣời tiêu dùng ƣa chuộng Vì vậy, tùy vào mục đích sản xuất, lựa chọn phƣơng thức nuôi phù hợp 49 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng cách gây nhiễm phƣơng thức nuôi đến phát triển thể nấm Phƣơng thức nuôi trồng Cách Số tằm Số gây thí tằm nhiễm nghiệm bật (con) mầm thể Tỷ lệ bật mầm thể (%) Tổng số thể Số Chiều lƣ ng dài quả thể thể TB/con TB (cm) Tiêm 500 487 97,4 705 1,41 4,52 Tiêm 500 500 100,0 1652 3,30 4,80 Phun 500 124 24,8 155 0,31 0,65 Đặt đứng ống nhựa đen Đặt nằm ngang giấy thấm A B Hình 3.10 Quả thể nấm phát triển tằm nuôi đặt nằm ngang giấy thấm sau 40 ngày chiếu sáng điều kiện: cƣờng độ ánh sáng 700 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày, nhiệt độ nuôi 22OC độ ẩm 85% A- gây nhiễm nấm cách phun dịch giống nấm bề mặt tằm; B- gây nhiễm nấm cách tiêm dịch giống nấm vào phần đầu tằm 50 Hình 3.11 Quả thể nấm phát triển tằm nuôi đặt thẳng đứng ống nhựa đen sau 40 ngày chiếu sáng điều kiện: cƣờng độ ánh sáng 700 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày, nhiệt độ nuôi 22OC độ ẩm 85% A B Hình 3.12 Nấm đơng trùng hạ thảo tằm nguyên tƣơi thu hoạch (A) nấm đông trùng hạ thảo tằm nguyên khô đƣợc sấy phƣơng pháp sấy thăng hoa (B) 51 3.5 Kết phân tích hoạt chất Adenosine Cordycepin gi thể tằm Để tiến hành phân tích hàm lƣợng Adenosine Cordycepin nấm đông trùng hạ thảo nuôi trồng tằm nguyên Nấm đƣợc thu thời điểm nuôi trồng: 42 ngày nuôi trồng 52 ngày ni trồng tính từ thời gian bắt đầu gây nhiễm, sây khô nấm phƣơng pháp thăng hoa (độ ẩm dao động từ – 4%), nấm khô gồm thể thân tằm đƣợc sử dụng làm mẫu phân tích Hàm lƣợng Adenosine Cordycepin đƣợc phân tích máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Kết thu đƣợc cho thấy, với mẫu nấm thu non giai đoạn 42 ngày ni trồng có hàm lƣợng Adenosine cao đạt 17,3 mg/100g, nhƣng hàm lƣợng Cordycepin đạt 369 mg/100g Ngƣợc lại, với mẫu nấm thu hoạch giai đoạn trƣởng thành 52 ngày nuôi trồng có Adenosine đạt 4,09 mg/100g, nhƣng hàm lƣợng Cordycepin lại tăng cao 688 mg/100g Điều cho thấy hàm lƣợng Adenosine Cordycepin tỷ lệ nghịch với liên quan đến thời gian ni trồng Adenosine tiền chất để chuyển hóa thành Cordycepin Bảng 3.8 Kết phân tích hàm lƣ ng Adenosine Cordycepin nấm đông trùng hạ thảo nuôi trồng giá thể tằm nguyên Thời gian thu hoạch Tên tiêu Đơn vị tính Hàm lƣợng mg/100g 42 ngày Adenosin ni trồng Hàm lƣợng 52 ngày Adenosin nuôi trồng Hàm lƣợng Cordycepin Kết 17,3 (HPLC) mg/100g Cordycepin Hàm lƣợng Phƣơng ph p thử NIFC.05.M.163 NIFC.05.M.163 369 (HPLC) mg/100g NIFC.05.M.163 4,09 (HPLC) mg/100g NIFC.05.M.163 (HPLC) 688 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kêt luận: Từ kết nghiên cứu thu đƣợc nuôi trồng chủng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris NBRC9787 giá thể tằm nguyên con, rút số kết luận sau: 1) Gây nhiễm nấm vào giá thể tằm nguyên phƣơng pháp tiêm 150 – 200 µl dung dịch giống nấm vào phần đầu tằm hấp vô trùng nuôi tối 12 ngày, điều kiện nhiệt độ 22OC, độ ẩm 60% tốt cho phát triển hệ sợi nấm bật mầm thể đƣa nuôi sáng 2) Điều kiện nuôi trồng tốt cho việc bật mầm thể phát triển thể tằm ngun nhiệt độ phịng ni 22OC, độ ẩm 85 – 90%, cƣờng độ ánh sáng đ n Led trắng 700 lux thời gian chiếu sáng 14 giờ/ngày 3) Phƣơng thức nuôi đặt nằm ngang giấy thấm ƣớt cho tỷ lệ tằm bật thể số lƣợng thể trung bình /con đạt cao 4) Hàm lƣợng Adenosine đạt 17,3 mg/100g Cordycepin đạt 369 mg/100g nấm khô thu hoạch nấm giai đoạn nuôi trồng 42 ngày tuổi; Adenosine đạt 4,09 mg/100g Cordycepin đạt 688 mg/100g nấm khô thu hoạch nấm giai đoạn nuôi trồng 52 ngày tuổi Kiến nghị: - Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình k thuật ni trồng nấm đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris NBRC9787 giá thể tằm nguyên áp dụng vào sản xuất - Tiếp tục nghiên cứu k thuật nuôi trồng chủng giống nấm đông trùng hạ thảo khác giá thể tằm nguyên 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nƣớc Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Liên Hoa, Lê Hoàng Yến, Nguyễn Văn Bắc (2006) Chƣơng trình vi sinh vật học – Nấm sợi Nguyễn Thị Hồng, Lê Minh Sắt , Nguyễn Thị Hồng Gấm, 2019 Xác định môi trƣờng k thuật phân lập giống gốc nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) thu thập Vƣờn quốc gia Hồng Liên Sơn (Lào Cai) Tạp chí khoa học cơng nghệ Việt Nam 61 (9) Nguyễn Thị Liên Thƣơng, Trinh Diệp Phƣơng Danh Nguyên Văn Hiệp, 2016 Nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris: Đăc điểm sinh học, giá trị dƣợc liệu yếu tố ảnh hƣởng đến q tr nh ni trồng nấm Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ 44b: 9-22 Phạm Quang Thu (2009) Điều tra phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps nutans pat phân bố khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang Tạp trí nơng nghiệp phát triển nơng thôn số - tháng 4/2009 Phạm Quang Thu (2009) Phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps gunni (Berk.)Berk vƣờn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thơn số 6 Phạm Quang Thu, Nguyễn Mạnh Hà., 2009 Phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:FR.)LINK vƣờn quốc gia Hồng Liên tỉnh Lào Cai Tạp chí nông nghiệp phát triển nông thôn số Phạm Thị Thuỳ (2010) Nghiên cứu phát triển nguồn nấm Beauveria Metarhizium để ứng dụng phòng trừ sâu hại trồng, rừng 54 phát nguồn nấm Cordyceps sp làm thực phẩm chức năngcho ngƣời Báo cáo Hội thảo Quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp Trang 224 – 231 Trần Ngọc Lân, 2008 Đa dạng sinh học nấm ký sinh côn trùng Vƣờn Quốc gia Pù Mát đánh giá khả ký sinh số loài nấm số loài sâu hại trồng, Đề tài cấp Giáo dục & Đào tạo, Mã số: B2007-27-25 Byung-Tae P., Kwang-Heum N., Eui-Cha J., Jae-Wan P., Ha-Hyung K., 2009 Antifungal and Anticancer Activities of a Protein from the Mushroom Cordyceps militaris Korean Journal of Physiol Pharmacology 13: 49 - 54 10 Chang, H L., Chao, G R., Chen, C C., Mau, J L., 2001 Non-volatile taste components of Agaricus blazei, Antrodia camphorata and Cordyceps militarismtcelia Food Chemistry 74:203-207 11 Choi J, Lee E, Lee H, Kim K, Ahn K, Shim B et al (2007) Identification of campesterol from Chrysanthemum coronarium L and its antiangiogenic activities Phytother Res 21, 954–959 12 Choi Y.S., Lee H.K., Kim S.H., 1999 Production of fruiting body using cultures of entomopathogenic fungal species Korean Journal of Mycology 27: 15–19 13 Das S.K., Masuda M., Mikio S., 2010 Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris: current state and prospects Fitoterapia 81:961–968 55 14 Dong JZ, Lei C, Ai XR et al., 2012 Selenium enrichment on Cordy- ceps militaris Link and analysis on its main active components Applied Biochemistry and Biotechnology 166:1215–1224 15 Fengyao W., Hui Y., Xiaoning M., Junqing J., Guozheng Zh., Xijie G and Zhongzheng G, 2011 Structural characterization and antioxidant activity of purified polysaccharide from cultured Cordyceps militaris African Journal of Microbiology Research 5(18): 2743-2751 16 Filipa S Reis, Lillian Barros, Ricardo C Calhelha, Ana Ćirić , Leo J.L.D van Griensven, Marina Soković , Isabel C.F.R Ferreira, 2013.The methanolic extract of Cordyceps militaris (L.) Link fruiting body shows antioxidant, antibacterial, antifungal and antihuman tumor cell lines properties Food and Chemical Toxicology Volume 62, December 2013, Pages 91–98 17 Gao X.H., Wu W., Qian G.C., 2000 Study on influences of abiotic factors on fruitbody differentiation of Cordyceps militaris Acta Agriculture Shanghai 16: 93–98 18 Gu Y.X., Wang Z.S., Li S.X., 2007 Effect of multiple factors on accumulation of nucleosides and bases in Cordyceps militaris Food Chemistry 102:1304–1309 19 Harada Y., Akiyama N., Yamamoto K., Shirota Y., 1995 Production of Cordyceps militaris fruit body on artificially inoculated pupae of Mamestra brassicae in the laboratory Transactions of the Mycological Society of Japan 36: 67–72 20 Hong I.P., Kang P.D., Kim K.Y., 2010 Fruit body formation on silkworm by Cordyceps militaris Mycobiology 38:128–132 56 21 Huang S.J., Tsai S.Y., Lee Y.L., 2006 Nonvolatile taste components of fruiting bodies and mycelia of Cordyceps militaris Food Science Technology 39:577–583 22 Hur H., 2008 Chemical Ingredients of Cordyceps militaris Mycobiology 36(4):233-235 23 Jae-Sung K., Kumar S., Se -Eun P., Bong-Suk C.i, Seung K., Nguyen T H., Chun-Sung K., Han-Seok C., Myung-Kon K., Hong-Sung C., Yeal P., Sung-Jun K., 2006 A Fibrinolytic Enzyme from the Medicinal Mushroom Cordyceps militaris Journal of Microbiology 44(6):622-31 24 Jiang, X.L & Sun, Y 1999 The determination of active components in various Cordyceps militaris strains Acta Edulis Fungi, 6, 47–50 25 Jin, L.Y., Du, S.T & Ma, L 2009 Optimization on mathematical model of basic medium of Cordyceps militaris cultivation J Northwest A F Univ (Nat Sci Ed) 37(11):175–179 26 Kamble V.R and Agre D.G., 2012 Reinvestigation of insect parasite fungus Cordyceps militaris from Maharashtra Bionano Frontier 5(2):224225 27 Kim, S.Y., Shrestha, B., Sung, G.H., Han, S.K & Sung J.M 2010 Optimum conditions for artificial fruiting body formation of Cordyceps cardinalis Mycobiology 38(2): 133-136 28 Kobayasi Y., 1982 Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella Transactions of the Mycological Society of Japan 23:329–364 Herbal, New York 57 29 Li C.R., Nam S.H., Geng D.G., 2006 Artificial culture of seventeen Cordyceps spp Mycosystema 25:639–645 30 Li S.P., Yang F.Q., Tsim K.W.K., 2006 Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41, 1571–84 31 Lim L., Lee C., Chang E., 2012 Optimization of solid state culture conditions for the production of adenosine, cordycepin, and Dmannitol in fruiting bodies of medicinal caterpillar fungus Cordyceps militaris (L.:Fr.) Link (Ascomycetes) International Journal of Medicinal Mushrooms 14:181– 188 32 Lin W.H., Tsai M.T., Chen Y.S., Hou R.C., Hung H.F., Li C.H., Wang H.K., Lai M.N., Jeng K.C., 2007 Improvement in sperm production in subfertile boars by Cordyceps militaris The American Journal of Chinese Medicine.35 (4):631-641 33 Liu Z.Y., Yao Y.J., Liang Z.Q., 2001 Molecular evidence for the anamorphteleomorph connection in Cordyceps sinensis Mycological Research 105: 827–32 34 Mains E.B., 1958 North American entomogenous species of Cordyceps Mycologia 50:169–222 35 Mizuno T., 1999 Medicinal Effects and Utilization of Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) and Isaria Fr (Mitosporic Fungi) Chineese Caterpiller Fungi, “Tochukaso” Mushrooms 1:251-261 (Review) International Journal of Medicinal 58 36 Paul M K., Paul F C., David W M and Stalpers J A., 2008 Dictionary of the Fungi; CABI 37 Pramer D (1965) "Fungal Parasites of insects and nematodes" Bacteriological Reviews 29: 382-387 38 Reis, F.S., Barros, L., Calhelha, R.C., 2013 The methanolic extract of Cordyceps militaris (L.) Link fruiting body shows antioxidant, antibacterial, antifungal and antihuman tumor cell lines properties Food Chem Toxicol, 62, 91–8 39 Sato H and Shimazu M., 2002 Stromata production for Cordyceps militaris (Clavicipitales: Clavicipitaceae) by injection of hyphal bodies to alternative host insects Applied Entomology and Zoology 37:85–92 40 Seulmee S., Sungwon L., Jeonghak K., Sunhee M., Seungjeong L., Chong-Kil L., Kyunghae C., Nam-Joo H., Kyungjae K., 2009 Cordycepin Suppresses Expression of Diabetes Regulating Genes by Inhibition of Lipopolysaccharide-induced Inflammation in Macrophages Immune Network 9(3):98-105 41 Shih I.L., Tsai K.L., Hsieh C.Y., 2007 Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris Biochemical Engineering Journal 33, 193–201 42 Shonkor K D., Shinya F., Mina M and Akihiko S., 2010 Efficient Production of Anticancer Agent Cordycepin by Repeated Batch Culture of Cordyceps militaris Mutant Lecture Notes in Engineering and Computer Science 20-22 59 43 Shrestha, B, Han, S.K., Lee, W.H 2005b Distribution and in vitro fruiting of Cordyceps militaris in Korea Mycobiology 33:178–181 44 Shrestha, B., Choi, S.K, Kim, H.K., 2005a Genetic analý sis of pigmentation in Cordyceps militaris Mycobiology 33:125–130 45 Shrestha, B., Kim, H.K., Sung, G.H., 2004a Bipolar heterothallism, a principal mating system of Cordyceps militaris in vitro Biotechnol Bioprocess Eng 9:440–446 46 Shrestha, B., Park, Y.J, Han, S.K., 2004b Instability in in vitro fruiting of Cordyceps militaris J Mushroom Sci Prod 2:140–144 47 Stensrud Ø., Hywel-Jones N.L., Schumacher T., 2005 Towards a phylogenetic classification of Cordyceps: ITS nrDNA sequence data confirm divergent lineages and paraphyly Mycological Research 109: 41–56 48 Stone R., 2008 Last stand for the body snatcher of the Himalayas? Science 322:1182 49 Sung J.M., 1996 The insects-born fungus of Korea in color Kyohak Publishing Co Ltd., Seoul 50 Sung J.M., Choi Y.S., Lee H.K., 1999 Production of fruiting body using cultures of entomopathogenic fungal species Korean Journal of Mycology 27:15–19 51 Sung J.M., Choi Y.S., Shrestha B., Park Y.J., 2002 Investigation on artificial fruiting of Cordyceps militaris Korean Journal of Mycology 30: 6– 10 60 52 Sung, J.M, Park, Y.J, Lee, J.O 2006a Effect of preservation periods and subcultures on fruiting body formation of Cordyceps militaris in vitro Mycobiology 34:196–199 53 Sung, J.M, Park, Y.J, Lee, J.O 2006b Selection of superior strains of Cordyceps militaris with enhanced fruiting body productivity Mycobiology 34:131–137 54 Tong, Y.K, Kuang, T., Wu, Y.X, 1997 Comparison of components of Cordyceps mycelium and natural Cordyceps sinensis Shi Pin Yan JiuYu Kai Fa, 18, 40–42 (in Chinese) 55 Wang G.D., 1995 Ecology, cultivation and application of Cordyceps and Cordyceps sinensis Scientific and Technical Documents, Beijing 56 Wang X.Q., Chen C.Q., Zhang R., 2002 Methodological studies on cultivation of Cordyceps militaris on pupae of Antheraea pernyi Journal of Anhui Agricultural Science 30:965-968 57 Wang, B.S., Lee, Ch.P., Chen, Z.T., 2012 Comparison of the hepatoprotective activity between cultured Cordyceps militaris and natural Cordyceps sinensis J Funct Foods, 4, 489–95 61 PHỤ LỤC Phiếu kết kiểm nghiệm hàm lượng Adenosine Cordycepin nấm đông trùng hạ thảo giá thể tằm nguyên ... hiên cứu: ? ?Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)? ?? 3 Chƣơng TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nấm Đông trùng hạ thảo. .. nghiệp, thực luận văn tốt nghiệp với đề tài: ? ?Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)? ?? Để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp,... ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.1.Giới thiệu nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.2 Sự phân bố nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.3 Vòng đời chế lây nhiễm Đông trùng