KHOA HOC CÖNG NGHË 59 CÔNG NGHÿ NHÂN GIÖNG CÂY KHOAI LANG țIPOMOEA BATATAS L ) S@CH BÿNH TRONG ÔNG NGHIÿM NGUYEN THANH MAI(*) I GIÓI THIEU Khoai lang Ià 1 trong sÖ nhúng cây läy cú quan trgng nhät Chú[.]
KHOA HOC - CƯNG NGHË 59 CƠNG NGHÿ NHÂN GIƯNG CÂY KHOAI LANG țIPOMOEA BATATAS L ) S@CH BÿNH TRONG ÔNG NGHIÿM NGUYEN THANH MAI(*) I GIÓI THIEU Khoai lang Ià sÖ nhúng läy cú quan trgng nhät Chúng có the rong rãi nhieu loąi dät khác nhau, tù döng bang trung du cho den nhđng nggn dưi sơi dá Theo FAOSTAT (1999), hien có 432 trieu tän khoai tây khoai lang dü?c canh tác 17 trieu hecta dät khap the giói, dó cac nuóc dang phát trien chiem 56% Gi”üa năm 1990, c tính có 158 trieu tan khoai lang du’ c tiê u thu hàng năm tąi cac quÖc gia dang phát trien Nhúng hieu biet v6 tarn quan trgng sån xuat thșc pham cûng nhLf nhúng vai trò khác cùa khoai lang the kÿ 21 dã cho thäy tiám rät Ión cua nơng nghiep ca cơng nghiep cúa nhieu qc gia tồn the giói Khå tái sinh tù nuôi cäy mô Ià mot bien pháp quan trgng de úng dqng vào cåi bien di truyën cua khoai lang Viec nghiên cúu dÖi tu’ğng khoai lang Ià rät khó, bơi phu thu/oc rät nhieu vào giƯng viec Isa chgn mơ ni cäy Trûóc năm 1984, häu nhU khơng có cơng trình nghiê n cúu cơng bćí ve tái sinh khoai lang Öng nghiem Vào năm 1984, 1989, Cantliffe Liu dã giói thieu mğt h{e thƯng hieu q hon dê tái sinh khoai lang tù sÿ phát sinh phơi sinh dng he thƯng dã düğc úng dung ky thuât chuyen gen nhân giÖng khoai lang Vói phUong pháp này, tän sƯ tái sinh chƯi dat hieu qua cao hon so vói cac phi ong pháp khác (*) Thąc sỵ, Phó Trûơng Khoa Công nghe Sinh hoc - Oai hoc Mô Bán công TP HCM nhie u tác gia dã khang !nh phüong pháp Ià tÖi üu nghiê n cúu tái sinh khoai lang Öng nghie m (Liu Cantliffe, 1984; Jarret cong st, 1984; Liu cong srY, 1992, 1997; Desamero cğng so, 1994; Gosukonda cong st, 1995; Otani Shimada, 1996; Zheng cğng st, 1996 ; Liu cong st, 1997) Tuy nhiên, häu het báo cáo vë phat sinh phôi sinh dũng ị khoai lang Ià phúc tąp chỵ thành cơng m{ot vài giƯng nhät d|nh Vì th6, nghiên cúu này, chúng tơi giói thiêu mơt cách tiep can mói de tái sinh khoai lang mà choi d0oc tái sinh tù nÖt re phát sinh tù mơ sęo Iá khoai lang Ưng nghiêm Cách tiep can mói don giån, tuân theo quy luat th nhiên de dàng úng dqng phqc tráng giÖng khoai lang, sàn xt mot ngn giƯng sąch benh, lai tąo phâm chät theo ÿ muÖn II.VAT LIEU VÀ PHUONG PHÁP Vat lieu GiÖng khoai lang Kokei No 14 Ià dƯi thing nghiên cúu Cac mơ la tuän tuoi d0oc tách tÙ sinh trüông ong nghiem mơi trc/ịng MS (Murashige Skoog, 1962) có bo sung 100mg/I myo-inositol, 309/1 dng 79/1 agar Các mơ kỵch thi óc khồng 2,5cm chieu ngang, 1,5cm chieu dài thu dUğc tù Öng nghiem dr/ğc cat ngang tąi V! trí giúa la, cng gân Iá thành mành có chieu dgc (theo gân Iá) khoàng 2,5cm; chieu ngang khoàng 0,7cm d{at vào mơi trr/ịng ni cäy thích hcip 60 TÂP SAN KHOA HOC SO 2(3)-2005 Phcfdng pháp 2.1 Khao sát anh hüơng cua auxin Iên dac tính phát sinh hình thái tù ni cäy mành Iá khoai lang Ưng nghiem Các mơ Iá dc/dc ni cäy trê n mơi trtng MS bƯ sung 2,4-D (0,02; 0,05; 0,1; 0,5; 1,0mg/I) hoac 0,2 mg/I NAA; 309/1 duòng sucrose 79/1 agar tien hành cäy chuyen mô sęo, chưi tái sinh tù nƯt re có ngn gƯc mơ sęo cao khoång cm du’ğc tách cäy chuyen mơi tri ịng MS Trong thí nghiem, chúng tơi ghi nhcan sql phát sinh hình thái cúa månh Iá khoai lang Öng nghiem sau tn ni cäy qua chỵ tiêu sau: 2.2 Khåo sát ånh hi ông cua auxin KIN Iên d{ac tính phát sinh hình thái tù ni cäy mành Iá khoai lang Ưng nghiem Các mơ Iá du c ni cäy mơi trL/ịng MS bo sung 2,4-D (0,02; 0,05; 0,1mg/I) 0,5mg/I KIN, 309/1 di òng sucrose 79/1 agar.y4 2.3 Khåo sát ånh hL/ông cua ABA Iên dac tính phát sinh hình thái tù ni cäy mành khoai lang Ưng nghiem Các mơ Iá du’qc ni cäy mơi trc/ịng MS bo sung 0,05mg/I 2,4-D; 0,5mg/I KIN; ABA (0,5; 1,0; 2,0mg/I), 309/1 dûịng sucrose 79/1 agar + Ty le hình thành mơ sęo/ måu + Tÿ le hình thành re/ mau + Tÿ le hình thành chói/ måu + SƯ chưi trung bình/ mau X'u’ Iÿ so lieu Các thí nghiem düdc leap Iąi Ian, moi Ian 15 mau, thƯng kê trung bình cuong sau tuan ni cäy bang chewong trình Microsoft Excel Dcfa ngồi vcfèn cfdm Dieu kien ni cay Các re tƯt Ưng Các thí nghiem du’ c tien hành phịng ni 250C + 2, cu’òng dğ ánh sáng 3.000 lux, thòi gian chieu sáng 16 giị/ngày am duo ttYdng dƯi 90% Thu thğp dỵỵ liğu De theo dưi st phát sinh hình thái cúa mơ khoai lang Ưng nghiem, chúng tơi nghiem có chieu cao khổng 6-8 cm dudc dem vào khay xÖp (loąi 60 Io) có chúa dät mùn ngồi vcfịn iJom de theo dõi st sinh truông phát trien cùa chúng III KIT QUÀ VÀ THAO LUAN Ành hiJông cúa auxin Iên d{ac tính phát sinh hình thái tù ni cäy månh Iá khoai lang Öng nghiem sau tuan diJoc chỵ bång Bång 1: Ánh hc/ơng cúa auxin Iên d}ac tính phát sinh hình thái tù ni cäy månh khoai lang Öng nghiem sau tuän Chat dieu hèa sinh trøóng th¢fc vğt (mg/I) Hình thành mơ sęo (%) Hình thành re (%) Hình thành chëi (%) So chưi trun bình/mau 2,4-D NAA 0,02 0,0 100 0,0 ‘ 0,0 0,0 0,05 0,0 100 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0 100 0,0 0,0 0,0 0,5 0,0 100 0,0 0,0 0,0 1,0 0,0 100 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 100 100 28 0,16 KHOA HOC - CƯNG NGHË Các mành Iá düdc ni cäy trê n mơi trJịng MS có bƯ sung 2,4-D (0,02; 0,05; 0,1; 0,5; 1,0mg/I) dêu tąo mơ sęo vói tỵ le cao (100%) Sau den 10 ngày, hau het Gác månh Iá bat dau hình thành mơ sęo trang mem Cac mô sso phát trien rät nhanh, tiep tuc tăng sinh sau tuän nuôi cäy mà khơng có st phát sinh rë Cac månh la mơi trng MS có bo sung 0,2mg/I NAA dã hình thành nhúng mơ sęo xanh chac (hình 1f) Sau tói tuan ni cäy, mơ sęo la hinh thành re bät d!nh +ı (hình 1d, el) Choi tái sinh trÿc tiep tù cac nÖt cúa re bät d!nh (hình 1b, e2) vỊ tąİ v! trí giúa månh la cng (hình 1a) sau den tuan Bång cho thäy, tÿ le hình thành re chưi Ket q khác vói nhúng báo cáo cúa Xin Zhang (1987); Otani Shimada, (1988); Liu cuong st (1990) Cac tac giå dã khåo sát cac nưng dơ NAA dr/dc bo sung mơi trJòng MS de dieu khien cac mành la khoai lang Ưng nghie m tąo mơ sęo ChƯi tái sinh tù cac mô sęo la mà không thông qua re hoăC v! trí gi”c/a cuong la Hình Anh h/Yáng cûa auxin, KIN; ABA Iên st phát sinh hinh thái månh lă khoai lang ô“ng nghiem sau turn ni cá“y a Choi tái sinh tąi v| trí giúa cuÖng khoai lang Öng nghiem mơi trng MS có bo sung 0,2mg/I NAA b Chưi tái sinh tù re có nguon gƯc mơ sęo la khoai lang Ưng nghiêm mơi triJịng MS có bo sung 0,2mg/I NAA c Các nÖt cúa re phát sinh tù manh la düğc nuôi cäy trê n môi trüịng MS có bo sung 0,2mg/I NAA d Re phát sinh tù mành Iá khoai lang Öng nghiem mơi trüịng MS có bo sung 0,2mg/I NAA e1 Mơ sęo re hình thành t”u månh Iá khoai lang Ưng nghie m trê n mơ i trng MS có bo sung 0,2mg/I NAA e2 Choi tái sinh tù mơ sęo cùa månh Iá khoai lang Ưng nghiem mơi trng MS có bo sung 0,2mg/I NAA f Mơ sęo hình thành tù månh la khoai lang Ưng nghiem trén mơi trng MS có bƯ sung 0.2 mg/I NAA, quan sat mơ diJói kính hien vi soi nƯi g Mơ sęo hình thành tù mành la khoai lang Ưng nghiem trén mơi trng MS có bo sung 0,05mg/I 2,4-D; 0,5mg/I KIN 1,0mg/I ABA, quan sát mơ dcdi kính hiên vi soi noi Ành hng cúa auxin KIN Iên cac dac tính phát sinh hình thái tù nuôi cäy cac mành la khoai lang Öng nghiem sau tuan disc chi ô bang 62 TSAP SAN KHOA HOC SO 2(3)-2005 Bàng 2: Ành hcfơng cúa auxin KIN Iên dac tính phát sinh hình thái tù ni cäy mành Iá khoai lang Öng nghiem sau tuan Chat dieu hưa sinh trzng thrïc v§t (mg/I) 2,4-D KIN 0,02 0,05 0,1 0,5 Hình thành mơ sęo (%) Hình thành rË (%) Hình thành chëi (%) So chëi trung bình/mäu 100 100 20 0,2 100 100 43 0,56 100 100 0 Các månh Iá ni cäy mơi triJịng MS bÖ sung 2,4-D (0,02; 0,05; 0,1) 0,5mg/I KIN dã tąo mơ sso vàng bóng Sau tói 10 ngày, mô sęo Iá tąo rë bät d¡nh (hình 2b1) Hai tói tn sau tąo rë, chúng tơi ghi nhan chƯi xt hien tąi nƯt re (hình 2b2) tąi v/i trí giúa Iá cng (hình 2b3) nhiJng vói tän so thäp hon so vói ket q cúa Jing-Shang-W cğng sql (1998) Ngồi ra, theo tác giå Jing-Shang-W, månh Iá disc cåm úng mơ sęo mơi tru'ịng chúa 2,4-D KIN chưi tái sinh trÿc tiep tù mơ sęo Iá trê n mơi trüịng MS khơng có chät dieu hịa sinh trcfơng ho{ac mơi tri ịng MS có bo sung BAP Cịn thí nghiem này, ng tơi thäy rang KIN dóng vai trị quyet d!nh viec dieu khien ré tąo choi Hinh Anh huóng cua 2,4-D; KIN; ABA Iên st phát sinh hình thăi manh Iá khoai lang ćíng nghiem sau tn ni cay 63 KHOA HOC - CƠNG NGHE b2 Chưi hình thành tù nƯt re có ngn a1 Re hình thành tù mành la khoai gÖc månh khoai lang Ưng nghiêm lang Ưng nghiem mơi trüịng MS có mơi trng MS có bo sung 0,05mg/I 2,4-D bo sung 0,05mg/I 2,4- D; 0,5mg/I KIN 1,mg/I 0,5mg/I KIN ABA b3 Choi hình thành tù v| trí giúa cng a2; a‘3 ChƯi hình thành tù nƯt re có månh la khoai lang Ưng nghiem trê n ngn gƯc mơ sęo Iá khoai lang Ưng mơi trng MS có bo sung 0,05mg/I 2,4-D nghiêm trê n mơi tr ng MS có bo sung 0,5mg/I KIN 0,05mg/I 2,4-D; 0,5mg/I KIN 1,0mg/I ABA Khào sát anh hng cùa ABA Iên cac d{ac tính phat sinh hình thai tù ni cäy cac b1 Re hình thành tù månh khoai lang Öng nghiem mơi trûịng MS có mành Iá khoai lang Ưng nghiem sau tuan disc chi ô bàng bÖ sung 0,05mg/I 2,4-D 0,5mg/I KIN Bång 3: Khåo sát ånh hng cúa ABA Iên dac tính phát sinh hình thái tù ni cäy cac månh Iá khoai lang Öng nghie m sau tuan Chat diéu hưa sinh trng thee vat (mg/I) 2,4-D 0,05 KIN 0,5 ABA Hình thành mơ sęo (%) Hình thành rË (%) Hình thành chƯi (%) SƯ chƯi trung bình/mäu 0,5 100 100 40 0,76 1,0 100 100 66,6 1,90 2,0 100 100 16,6 0,17 De úng dung hieu qua nhân giÖng chuyen gen khoai lang, can nâng cao tƯi da tän sƯ tái sinh khoai lang Dia cd sô nghiên cúu cúa Liu cong st (1997) dã nêu vë vai trò thúc day st choi tù phơi sinh dũng cúa ABA, tien hành khão sat anh hiJông cúa chät Iên ski phát sinh hình thái mành Iá khoai lang ni cäy Ưng nghiem Cac rë bät d|nh xuät hien th mô sęo la khoai lang môi trng MS có bƯ sung 1mg/I ABA, 0,05mg/I 2,4-D 0,5mg/I KIN sau tuan ni cäy (hình 2a1) Tąi cac nƯt re, v| trí giúa cng Iá hình thành choi sau tn ni cäy tiep theo (hình 2a2, 2a3; Iän halt) Choi tiep ttJc hinh thành nhiëu tuan ni cäy thú Trong thí nghiem có ABA, ng tơi ghi nhcan tƯc phát trien re tù mơ khoai lang châm hdn thí nghiem chi có 2,4-D KIN Tuy nhiên, tan sƯ tái sinh chƯi, sƯ choi trung bình m mơ thí nghiem cao hon cac chƯi phat sinh tù rë có nguon gƯc la cúng xt hien sóm hon Theo dõi sinh triJơng giai doąn com Cac re tÖt Öng nghiem có chiáu cao khồng - 8cm disc dem trưng vào cac khay xƯp (loąi 60 IƯ) có chúa dat mùn ngồi vu’ịn iJdm Tat cå cac deu sinh tru’ơng tƯt sau vi òn udm sau hai tháng có thê trL/c tiep ngồi dong ruong IV f¢ET LUAN 2,4-D khơng có kha dieu khien cac månh Iá khoai lang Öng nghie m phat sinh re nhüng phÖi hip vói KIN dã có st hình thành re bät dinh 100% mô la khoai lang tao re trê n môi trûòng MS bo sung 2,4-D ; Khi phoi hip 0,05mg/I 2,4-D vói 0,5mg/I KIN dã kích thích tąo choi tù re tù v! trí giúa cng la vói tan so tái sinh chÖi 43% Viec thêm ABA ((0,5; 1,0; 2,0mg/I) vào mơ i trrïịng MS bo sung 0,05mg/I 2,4-D phÖi 64 TAP SAN KHOA HOC SO 2(3)-2005 hdp vói 0,5mg/I KIN dã tăng ccfịng st choi tù nÖt re Tan sÖ tái sinh sÖ chÖi moi mơ dąt cao nhät (66,6%) mơi tr0ịng MS có bƯ sung 1mg/I ABA, 0,05mg/I 2,4-D 0,5mg/I KIN Trên mơi trng MS bo sung 0,2mg/I NAA kích thích månh Iá khoai lang tąo re 100% tan so tái sinh chưi dąt 28% Có the sù dqng quy trình nhân giƯng phqc vq cơng tác giƯng cho ngu’ịi trưng khoai lang cúng nhu cung cap qui trình tái sinh cho thí nghiem chuyen gen, tąo giƯng trê n dƯi ti ing trưng có giá tr! TÀI LI WEU THAM KHÀO Bieniek, M.E., Harell, R.C and Cantliffe, D.J 1995 Enhancement of somatic embryogenesis of Ipomoea batatas in solid cultures and production of mature somatic embryogenesis liquids cultures for application to a bioreactor production system Plant Cell Tiss Org Cult 41: 1-8 Chee, R.P and Cantliffe, D.J 1988 Selective enhancement of Ipomoea batatas Poir embryogenic and non-embryogenic callus growth and production of embryos in liquid culture Plant Cell Tiss Org Cult 15: 149-159 Chee, R.P and Cantliffe, D.J 1989 Composition of embryogenic suspension cultures of Ipomoea batatas Poir and production of individualized embryos Plant Cell Tiss Org Cult 17: 39-52 Chee, R.P., Schulthesis, J.R and Cantliffe, D.J 1990 Plant recovery from sweetpotato somatic embryos HortSci 25 (7): 795-797 Desamero, N.V., Rhodes, B.B., Decoteau, D.R and Bridges, W.C 1994 Piconilic acid induced direct somatic embryogenesis in sweet potato Plant Cell Tiss Org Cult 37: 103-110 Gosukonda, R.M., Prakash, C.S and Dessai, A.P 1995 Shoot regeneration In vitro from diverse genotypes of sweet potato and multiple shoot production per explant HortSci 30: 1074-1077 Jarret, R.L., Salazar, S and Fernandez, R.Z 1984 Somatic embryogenesis in sweet potato HortSci 19: 397-398 Litz, R.E., and Conover, R.A 1978 In vitro propagation of sweet potato HortSci 13 (6): 659660 Liu, J.R., and Cantliffe, D.J 1984 Somatic embryogenesis and plant regeneration in tissue culture of sweet potato (Ipomoea batatas Poir.) Plant Cell Rep 3: 112-115 Liu, Q.C., Kokubu, T and Sato, M 1992 Varietal differences of somatic embryogenesis in shoot tip culture of sweetpotato, Ipomoea batatas (L.) Lam Japan Breed 42: 8-9 Liu, Q.C., Mi, K.X., Lu, D.H., Zhou, H.Y and Fu, Z 1997 Establishment of embryogenic cell suspension cultures in sweet potato, Ipomoea batatas (L.) Lam Acta Agr Sinica 23(1): 2226 Murata, T., Okada, Y., Saito, A., Kimura, T.M., Mori, M., Nishiguchi, K., Hanada, J.S and Foukoda, H 1998 Transformation by direct gene transfer in sweetpotato [Ipomoea batatas (L.) Lam.] In: Proceedings of International Workshop on Sweetpotato Production toward the 21st Century, Miyakonojo, Miyazaki, Japan, p 159-180 Newell, C.A., Lowe, J.M., Merryweather, A., Rooke, L.M and Hamilton, W.D.O 1995 Transformation of sweetpotato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) with Agrobacterium tumerfaciens and regeneration of plants expressing cowpea trypsin inhibitor and snowdrop lectin Plant Sci 107: 215-227 Otani, M and Shimada, T 1996 Efficient embryogenic callus formationin sweetpotato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) Breeding Sci 46: 257-260 Prakash, C.S., Egnin, M and Jaynes, J 1998 Biotechnology touches a Third World crop: Improving protein content in sweetpotato Agricultural Biotech International Conference, Saskatoon, Saskatchewan, Canada, p 42 KHOA HOC - CƯNG NGHË 65 TĨM TAT M jot phuong pháp tiep can mói nghiên cal"u tái sinh nhân giƯng ị khoai lang tuan ti bäng cách tái sinh thơng qua ni cäy re có nguon gƯc tù mơ sęo cùa la khoai lang dỹỗ/c trỡnh by bỏo cỏo ny Cỏc manh cua giÖng khoai lang Kokei No 14 düğc ni cäy mơi trr/ịng MS có bo sung 0,05mg/I axit 2,4-dichIorophenoxyacetic (2,4-D) 0,5mg/I kinetin (KIN) sau den tuan dã xuät hien re bät dİnh Chöi tái sinh tr¿c tiep tù cac re bät d!nh sau den tuan tiep theo, nhung tan sÖ tái sinh chöi tù re bät d|nh Ià rät thap Su' bo sung cúa 1mg/I axit absicic (ABA) vào mơi trüịng ni cäy dã cho mot tan sćí tái sinh choi hieu quà hdn NhiJ vay, cac månh Iá di ğc ni cäy trê n mơi triJịng MS có bo sung 0,05mg/I 2,4-D 0,5mg/I KIN thích hdp de tąo re bät d!nh thêm ABA (0,5; 1,0; 2,0mg/I) vào khå tái sinh chưi tù re bät d!nh cûa cac mành Iã khoai lang Öng nghiem cao hdn so vói khơng bƯ sung ABA Nhúng thu dLfğc tù re bät d|nh có st sinh trng bình thng khơng xt hien bien d! Các chuyen vüịn Udm dã sinh trJơng phat trien tƯt Các th khóa: NƯt re, Re bät d|nh, Tái sinh choi, Mơ sęo có kha phat sinh co quan, Khoai lang, ABA, Iá, Kokei No 14 SUMMARY A new approach to sweet potato (Ipomoea batatas.L) regeneration and micropropagation via adventitious roots derived from leaf segments was presented Adventitious roots were formed on MS (Murashige and Skoog, 1962) medium containing 0.05 mg.I-1 2,4-D (2,4-dichIorophenoxy acetic acid) and 0.5 mg.I-1 kinetin (KIN) by culturing cultivar Kokei No.14's leaf segments after to weeks Shoots were the directly regenerated from nodular roots after to weeks at low frequency The addition of abscisic acid (ABA) (0.5, 1.0, 2.0 mg.I-1) to this culture medium enhanced root formation as weíl as shoot regeneration from adventitious nodular roots of in vitro Kokei No 14's leaf segments ABA at the concentration of 1.0 mg.I-1 was optimal for regenerating shoots from nodular roots Plantlets derived from adventitious roots showed normal growth and uniform features When transfered to net-house, these plantlets grew and developed vigorously xey words: nodular root, adventitious root, shoot regeneration, lpomoea ćiafa/as.L, sweet potato, Kokeì No 14, leaf segment, ABA ... cal"u tái sinh nhân giƯng ị khoai lang tuan ti bäng cách tái sinh thông qua nuôi cäy re có nguon gƯc tù mơ sęo cùa la khoai lang dỹỗ/c trỡnh by bỏo cỏo ny Cỏc manh lỏ cua giƯng khoai lang Kokei No... hình thăi manh Iá khoai lang ćíng nghiem sau tn ni cay 63 KHOA HOC - CƠNG NGHE b2 Chưi hình thành tù nƯt re có ngn a1 Re hình thành tù mành la khoai gÖc månh khoai lang Öng nghiêm lang Ưng nghiem... 0,2mg/I NAA kích thích månh Iá khoai lang tąo re 100% tan so tái sinh chưi dąt 28% Có the sù dqng quy trình nhân giƯng phqc vq cơng tác giƯng cho ngu’ịi trưng khoai lang cúng nhu cung cap qui trình