Nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vacxin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn từ chủng virus phân lập tại việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯ PHẠM VĂN SƠN NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VƠ HOẠT PHỊNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯ PHẠM VĂN SƠN NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHỊNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HƠ HẤP Ở LỢN TỪ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Bá Hiên TS Nguyễn Văn Cảm HÀ NỘI, 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng thân Các kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa dùng bảo vệ để lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cám ơn thông tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận án Phạm Văn Sơn iv năm 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án, tác giả nhận giúp đỡ tạo điều kiện nhiều người, sau lời cảm ơn chân thành tác giả: Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Bá Hiên TS Nguyễn Văn Cảm, người trực tiếp hướng dẫn suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận án Nhờ có hướng dẫn nhiệt tình ý kiến đóng góp quý báu thầy mà luận án tơi hồn thành Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật Truyền nhiễm, Phịng Thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học Thú y, tồn thể thầy, giáo cán Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, trang bị cho kiến thức q báu giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Trân trọng cảm ơn nhóm nhà Khoa học nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất vacxin vơ hoạt phịng Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn” Thuộc chương trình KC-04 PGS.TS Nguyễn Bá Hiên chủ nhiệm tạo điều kiện cho tham gia nhiều công đoạn nghiên cứu cho phép sử dụng số kết nghiên cứu luận án Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp quan mà công tác tạo điều kiện thời gian, động viên, chia sẻ vật chất, tinh thần, giúp đỡ q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Phạm Văn Sơn MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng .ix Danh mục hình xi Trích yếu luận án xiv Thesis abstract xvi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài .1 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu chung 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.5.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Lịch sử tình hình dịch PRRS lợn 2.1.1 Lịch sử tình hình dịch PRRS lợn giới .5 2.1.2 Lịch sử tình hình dịch PRRS lợn Việt Nam 2.2 Căn bệnh 14 2.2.1 Cấu trúc virus PRRS 14 2.2.2 Phân loại virus PRRS 17 2.2.3 Khả gây bệnh sức đề kháng virus PRRS 18 2.3 Truyền nhiễm học 19 2.3.1 Loài vật mắc bệnh 19 2.3.2 Chất chứa mầm bệnh trình truyền lây 19 2.3.3 Cơ chế sinh bệnh, phương thức truyền lây đáp ứng miễn dịch 20 2.4 Triệu chứng bệnh tích 22 2.4.1 Triệu chứng lâm sàng 22 2.4.2 Bệnh tích 23 2.5 Chẩn đốn phịng trị bệnh .24 2.5.1 Chẩn đoán 24 2.5.2 Các biện pháp phòng trị bệnh 25 2.6 Giống gốc sản xuất vacxin .27 2.6.1 Định nghĩa 27 2.6.2 Cách chế tạo giống gốc 27 2.6.3 Cách quản lý giống gốc 27 2.6.4 Các phương pháp bảo quản giống gốc PRRSV phịng thí nghiệm 28 2.7 Nghiên cứu sản xuất vacxin phòng PRRS 30 2.7.1 Sản xuất vacxin phương pháp vô hoạt virus .30 2.7.2 Sản xuất vacxin phương pháp nhược độc virus môi trườngtế bào 31 2.7.3 Phương pháp sản xuất vacxin hệ 32 Phần Nội dung, vật liệu phương pháp nghiên cứu 36 3.1 Địa điểm nghiên cứu 36 3.2 Thời gian nghiên cứu 36 3.3 Vật liệu nghiên cứu 36 3.4 Nội dung nghiên cứu 36 3.4.1 Nghiên cứu biến đổi bệnh lý lợn ổ dịch PRRS thu thập mẫu .36 3.4.2 Phân lập tuyển chọn chủng giống gốc PRRSV .36 3.4.3 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vơ hoạt nhũ dầu phịng PRRS 37 3.5 Phương pháp nghiên cứu 37 3.5.1 Phương pháp mổ khám 37 3.5.2 Phương pháp RT - PCR 37 3.5.3 Phương pháp làm tiêu vi thể 40 3.5.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào .41 3.5.5 Phương pháp nhân virus PRRS 43 3.5.6 Phương pháp xác định hiệu giá virus 43 3.5.7 Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng virus 43 3.5.8 Phương pháp giải trình tự gen 44 3.5.9 Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus định lượng protein 45 3.5.10 Phương pháp gây tối miễn dịch chuột 45 3.5.11 Phương pháp trung hòa virus (phương pháp virus cố định huyết pha loãng) 46 3.5.12 Phương pháp IPMA 47 3.5.13 Phương pháp kiểm tra vô trùng giống PRRS (master seed working seed).48 3.5.14 Phương pháp kiểm tra khiết giống (master seed workingseed) kỹ thuật PCR/RT-PCR 50 3.5.15 Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 hệ thống Bioreactor 50 3.5.16 Phương pháp cô đặc virus PRRS lọc tiếp tuyến 50 3.5.17 Phương pháp vô hoạt virus 51 3.5.18 Phương pháp kiểm tra sau vô hoạt .51 3.5.19 Phương pháp nhũ hóa vacxin .52 3.5.20 Phương pháp kiểm tra tiêu khiết vacxin 52 3.5.21 Kiểm tra tiêu an toàn 53 3.5.22 Phương pháp kiểm tra tiêu hiệu lực vacxin 53 3.5.23 Phương pháp Realtime RT-PCR 54 3.5.24 Phương pháp ELISA 55 3.5.25 Phương pháp thống kê, xử lý số liệu 56 Phần Kết thảo luận 57 4.1 Nghiên cứu số biểu bệnh lý lợn mắc PRRS 57 4.1.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm 57 4.1.2 Chẩn đoán PRRS phương pháp RT-PCR 58 4.1.3 Nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể 60 4.1.4 Nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể 62 4.2 Phân lập tuyển chọn chủng giống gốc PRRS 65 4.2.1 Phân lập virus PRRS môi trường tế bào MARC-145 65 4.2.2 Nghiên cứu ổn định số đặc tính sinh học chủng virus PRRS phân lập Việt Nam 71 4.2.3 Đặc tính sinh học phân tử chủng virus PRRS .79 4.2.4 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch động vật thí nghiệm với chủng virus PRRS nghiên cứu .98 4.2.5 Sản xuất giống gốc 102 4.3 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vơ hoạt nhũ dầu phịng PRRS 107 4.3.1 Nhân giống sản xuất (Working seed) vacxin 107 4.3.2 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS 109 4.3.3 Nghiên cứu kiểm nghiệm vacxin vô hoạt PRRS 115 Phần Kết luận kiến nghị 123 5.1 Kết luận 123 5.2 Kiến nghị 123 Danh mục cơng trình cơng bố có liên quan đến luận án 124 Tài liệu tham khảo .125 Phụ lục 137 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ BEI Binary Ethylenimine CSF Classical swine fever CPE Cytophathogenic Effect DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EMCV Encephalomyocarditis virus ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum GP Glyco protein HE Haematoxylin – Eosin IFA Immunofluorescence assay IHC Immuno Histochemistry IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay KKT Kháng kháng thể MLV Modifier Live Vacine MOI Multiplicity Of Infection MSD Mystery Swine Disease NSP Non structural protein OD Optical Density OIE Office International des Epizooties ORF Open Reading Frame PAM Porcine Alveolar Macrophage PBS Photphat Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PCV2 Porcine circovirus type PEDV Porcine epidemic diarrhea virus PEARS Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome ... đích nghiên cứu Tuyển chọn chủng virus PRRS phân lập từ lợn mắc PRRS Việt Nam sử dụng làm giống gốc phục vụ sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS Giống gốc chủng virus PRRS phân lập Việt Nam, ... vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn từ chủng virus phân lập Việt Nam? ?? Chuyên ngành: Bệnh lý học chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam. .. giống gốc PRRSV phịng thí nghiệm 28 2.7 Nghiên cứu sản xuất vacxin phòng PRRS 30 2.7.1 Sản xuất vacxin phương pháp vô hoạt virus .30 2.7.2 Sản xuất vacxin phương pháp nhược độc virus