CHỌN LỌC DÒNG TẾ BÀO MÃN ĐÌNH HỒNG (Althaea rosea) CÓ KHẢ NĂNG TĂNG SINH NHANH SỬ DỤNG TRONG THU NHẬN RUTIN Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM Quách Ngô Diễm Phương và tgk CHỌN LỌC DÒNG TẾ BÀO MÃN ĐÌNH HỒNG[.]
Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM Qch Ngơ Diễm Phương tgk _ CHỌN LỌC DỊNG TẾ BÀO MÃN ĐÌNH HỒNG (ALTHAEA ROSEA) CĨ KHẢ NĂNG TĂNG SINH NHANH SỬ DỤNG TRONG THU NHẬN RUTIN QUÁCH NGÔ DIỄM PHƯƠNG*, VŨ THỊ BẠCH PHƯỢNG**, BÙI VĂN LỆ*** TĨM TẮT Mục đích nghiên cứu chọn lọc dịng Mãn Đình Hồng (Althaea rosea) có khả tăng sinh nhanh chứa rutin Mơ sẹo xốp Mãn Đình Hồng tạo mơi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA mg/l NAA Sau tuần, đưa vào môi trường MS lỏng bổ sung 0,5 mg/l BA mg/l NAA lắc 150 vòng/phút tạo dịch huyền phù tế bào Sau 14 ngày, cấy trải đĩa Sau tuần, chọn dòng tế bào tăng sinh nhanh so với dòng lại, đưa vào nuôi cấy lỏng lắc Sau 21 ngày xác định hàm lượng rutin tiết dịch nuôi cấy ngoại bào 1,07 mg/g trọng lượng tươi Từ khóa: rutin, Mãn Đình Hồng (Althaea rosea), chọn lọc dịng tế bào ABSTRACT Selecting fast growing Althaea rosea cell lines for producing rutin The aim of this research is to select Althaea rosea fast growing cell lines for producing rutin Friable callus tissue of Althaea rosea was achieved on MS liquid environment supplemented with 0.5 mg/l BA and mg/l NAA After weeks, friable callus was cultured in MS liquid environment supplemented with 0.5 mg/l BA and mg/l NAA, on rotary shaker at 150 rpm to create cell suspension After 14 days, the cells were culured in Petri plate After weeks, the fast growing cell lines were selected to culture in shaking liquid After 21 days, the amount of rutin exuded from cultured exospore is 1.07 mg/g Keywords: rutin, Althaea rosea, cell lines selection Mở đầu Rutin hay gọi rutoside, quercetin-3-rutinoside hay sophorin, flavonoid glycoside Rutin giúp tăng cường sức bền cho mao mạch, nên giúp giảm bệnh xuất huyết (haemophilia) dùng điều trị bệnh tim mạch [3] Một thuốc dùng điều trị bệnh tim mạch * TS, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TPHCM ** HVCH, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TPHCM *** PGS TS, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TPHCM có nguồn gốc từ chất thứ cấp thực vật rutoside hay cịn gọi rutin Rutin thuộc nhóm flavonoid, có hoạt tính vitamin P, có tác dụng làm bền giảm tính thấm mao mạch, tăng độ bền hồng cầu, hạ thấp trương lực chống co thắt (Yang cộng sự, 2007) [6] Rutin có nhiều lồi thực vật, Mãn Đình Hồng lồi chứa rutin Các tế bào có tính chất sinh lí khơng giống Do đó, việc chọn lọc dòng tế bào cần thiết để tăng sản lượng hợp chất thứ cấp từ thực vật Vì vậy, nghiên cứu chúng tơi thực 105 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM Số 40 năm 2012 _ kĩ thuật chọn lọc dòng tế bào Mãn Đình Hồng với mục tiêu thu nhận dịng tế bào có khả tăng sinh nhanh chứa rutin Vật liệu phương pháp tiến hành 2.1 Nguyên liệu Hạt Mãn Đình Hồng mua từ trại giống trồng Quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh 2.2 Phương pháp Tạo in vitro Các hạt Mãn Đình Hồng rửa bên ngồi xà phịng rửa lại nước cất Sau chuyển vào phịng cấy, lắc hạt với cồn 700 phút Tiếp theo lắc ngâm hạt dung dịch Javen 25% thời gian 10 phút Rửa hạt lại cho nước cất vô trùng Các hạt cấy môi trường MS bổ sung 7,6 g/l agar Tạo mô sẹo dịch huyền phù tế bào Cây sau tuần gieo hạt, rễ thân cắt thành lát mỏng 2-3mm cấy môi trường MS rắn bổ sung 0,5mg/l BA 1mg/l NAA để tạo sẹo xốp [2] Sau tuần nuôi cấy, chuyển mô sẹo xốp (khoảng 2g) vào chai 250ml chứa 50 ml môi trường lỏng MS bổ sung 0,5mg/l BA mg/l NAA nuôi điều kiện lỏng lắc 150 vòng/phút để tạo dịch huyền phù tế bào Sau 14 ngày nuôi cấy, lấy tế bào dịch huyền phù nhuộm 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) quan sát kính hiển vi để xác định khả sống/chết tế bào Khảo sát tăng trưởng dịch huyền phù tế bào 106 Xác định đường cong tăng trưởng tế bào dịch huyền phù: Lấy 10ml dịch huyền phù tế bào sau 14 ngày ni cấy (chứa 1ml thể tích tế bào lắng ban đầu) cấy vào erlen 100ml chứa 20ml môi trường MS lỏng bổ sung 0,5mg/l BA mg/l NAA lắc 150 vòng/phút Sau thời gian 7, 14, 21 30 ngày đo thể tích tế bào lắng để xác định số tăng trưởng tế bào Chỉ số tăng trưởng tế bào tính theo công thức Chen cộng (2003) [4] SCVsau – SCVtrước Chỉ số tăng trưởng = SCVtrước Khảo sát ảnh hưởng thể tích dịch huyền phù tế bào cấy chuyền ban đầu lên tăng trưởng dịch huyền phù tế bào: Dịch huyền phù tế bào cấy vào erlen 100 ml chứa 20 ml môi trường MS lỏng bổ sung 0,5mg/l BA 1mg/l NAA, lắc 150 vòng/phút (cho tất nghiệm thức), theo thể tích 5; 10; 15; 20; 25ml tương ứng với thể tích tế bào lắng ban đầu 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 ml Đo thể tích lắng dịch huyền phù tế bào ngày thứ thứ 14 để xác định số tăng trưởng tế bào dịch huyền phù SCV14 ngày – SCV7 ngày Chỉ số tăng trưởng = Chọn lọc dòng tế bào SCV7 ngày Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM Quách Ngô Diễm Phương tgk _ Dịch huyền phù tế bào Mãn Đình Hồng lọc qua màng lọc vơ trùng có kích thước 150µm Hút 10ml dịch huyền phù trộn chung với 30ml môi trường MS bổ sung 2,5g/l phytagel, 0,5mg/l BA 1mg/l NAA làm tan chảy để nguội khoảng 30-350C Tiếp theo, lắc hỗn hợp tế bào môi trường đổ vào đĩa Petri với bề dày khoảng 1mm (theo kĩ thuật cấy trải đĩa tạo dòng tế bào Bergmann, 1960) [5] Sau tuần, chọn dịng tế bào Mãn Đình Hồng tăng sinh nhanh cấy chuyền sang môi trường có thành phần điều kiện ni cấy để chúng tiếp tục tăng sinh Sau tuần nuôi cấy, dòng tế bào chọn lọc tạo thành cụm mơ sẹo, có dịng tạo mơ sẹo đặc, có dịng tạo mơ sẹo xốp Chọn dịng tế bào tạo mô sẹo xốp tăng trưởng nhanh đưa vào nuôi cấy lỏng lắc 150 vịng/phút mơi trường MS lỏng bổ sung 0,5mg/l BA 1mg/l NAA để tạo dịch huyền phù tế bào Đo hàm lượng rutin dịch huyền phù tế bào từ dòng tế bào chọn lọc Dịch huyền phù tế bào Mãn Đình Hồng từ mơ sẹo xốp dịng tế bào chọn lọc đưa vào 20ml môi trường MS lỏng bổ sung 0,5mg/l BA 1mg/lNAA, lắc 150 vòng/phút Sau tuần nuôi cấy đem định lượng rutin ngoại bào dịch môi trường nuôi cấy phương pháp đo độ hấp thụ bước sóng 500nm [1] Hàm lượng rutin xác định theo đường chuẩn Điều kiện nuôi cấy Các mẫu cấy in vitro nuôi cấy điều kiện cường độ ánh sáng 3000lux, nhiệt độ 25 ± 20C, độ ẩm 75 – 80% Tất môi trường điều chỉnh pH = 5,8 trước hấp khử trùng nhiệt độ 1210C, atm, 15 phút Phương pháp phân tích xử lí số liệu Sử dụng phần mềm SPSS để phân tích xử lí kết thí nghiệm theo thuật toán thống kê Kết thảo luận Tạo mô sẹo dịch huyền phù tế bào Tế bào dịch huyền phù nhuộm TTC có khả bắt màu hồng (hình 1) Điều chứng tỏ tế bào sống có khả tăng trưởng dịch huyền phù Hình Tế bào dịch huyền phù nhuộm TTC Hình mũi tên tế bào phân chia 107 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM Số 40 năm 2012 _ Khảo sát tăng trưởng dịch huyền phù tế bào Xác định đường cong tăng trưởng tế bào dịch huyền phù: tăng trưởng tế bào dịch huyền phù trình bày hình Kết cho thấy số tăng trưởng đạt cao vào ngày thứ 21 Sau 21 ngày, sinh khối tế bào không tăng thêm, thể tế bào vào pha ngừng tăng trưởng tế bào dịch huyền phù Hình Đường cong tăng trưởng tế bào dịch huyền phù Khảo sát ảnh hưởng thể tích dịch huyền phù tế bào cấy chuyền ban đầu lên tăng trưởng dịch huyền phù tế bào Bảng Kết khảo sát ảnh hưởng thể tích dịch huyền phù tế bào Mãn Đình Hồng cấy chuyền ban đầu lên tăng trưởng dịch huyền phù tế bào Nghiệm thức J1 J2 J3 J4 J5 Thể tích huyền Thể tích tế phù tế bào bào lắng ban đầu ban đầu (ml/20 ml) (ml) 10 15 20 25 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Thể tích tế bào lắng ngày thứ (ml) Thể tích tế bào lắng ngày thứ 14 (ml) Chỉ số tăng trưởng 0,950 ± 0,029 1,983 ± 0,017 2,630 ± 0,051 3,093 ± 0,047 3,573 ± 0,050 2,083 ± 0,044 4,540 ± 0,038 10,573 ± 0,038 11,033 ± 0,033 10,060 ± 0,038 1,193 ± 0,048 1,287 ± 0,030 2,977 ± 0,045 2,570 ± 0,053 1,813 ± 0,047 Kết từ bảng cho thấy, nghiệm thức J3 môi trường MS lỏng bổ sung 0,5mg/l BA, 1mg/l NAA với thể tích dịch huyền phù tế bào cấy chuyền ban đầu 15ml (chứa thể tích tế bào lắng 1,5ml) 20ml môi trường cho tốc độ tăng trưởng dịch huyền phù tế bào thích hợp loạt nghiệm thức tiến hành (chỉ số tăng trưởng 2,977) 108 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM Quách Ngô Diễm Phương tgk _ Chọn lọc dòng tế bào Sau thực cấy trải đĩa, kết thu sau các tuần ni cấy trình bày hình 3, 4, Hình Các dịng tế bào Mãn Đình Hồng phát triển sau đổ đĩa A: tuần; B: tuần; C: tuần Hình mũi tên vị trí dịng tế bào tăng trưởng nhanh Hình Các dịng tế bào Mãn Đình Hồng tăng sinh nhanh cấy chuyền sang mơi trường để tiếp tục tăng sinh A1, A2, A3: dòng tế bào 5, 9, 12 tuần tuổi B: dịng tế bào tạo mơ sẹo xốp tuần tuổi Hình Dịch huyền phù tế bào Mãn Đình Hồng từ mơ sẹo xốp dịng tế bào chọn lọc sau ngày ni cấy 109 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM Số 40 năm 2012 _ Đo hàm lượng rutin dịch huyền phù tế bào từ dòng tế bào chọn lọc Kết dựng đường chuẩn rutin trình bày hình Hình Đường chuẩn rutin Đường chuẩn xây dựng có hệ số tương quan nồng độ rutin giá trị mật độ quang (OD = 500nm) R2 ≈1, giá trị đáng tin cậy để thấy rằng: nồng độ rutin dung dịch có mối quan hệ tuyến tính với giá trị mật độ quang (OD = 500nm) Mối quan hệ thể phương trình: y = 1,4063x - 0,0049 Kết đo hàm lượng rutin trình bày bảng Bảng Kết đo hàm lượng rutin dịch ngoại bào Mãn Đình Hồng độ hấp thụ có bước sóng 500 nm Hàm lượng rutin Giá trị OD dung 25ml dịch đem đo dịch đem đo (chứa (chứa 6ml dịch nuôi 6ml dịch nuôi cấy) cấy)(mg) 0,04 0,032*25 = 0,80 Hàm lượng rutin Hàm lượng rutin 20ml dịch nuôi 1g sinh khối cấy (tương ứng 2,5g tươi (mg/g) sinh khối tươi) 2,67 1,07 Từ bảng kết cho thấy, dòng tế bào Mãn Đình Hồng chọn lọc có chứa rutin với hàm lượng 1,07mg/g sinh khối tươi Kết luận Đã chọn dịng tế bào Mãn Đình Hồng có khả tăng trưởng nhanh chứa rutin Hàm lượng rutin tiết dịch nuôi cấy ngoại bào 1,07mg/g sinh khối tươi 110 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM Quách Ngô Diễm Phương tgk _ TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nxb Y học Nguyễn Thành Hải, Trần Chấn Đại, Quách Ngô Diễm Phương, Bùi Văn Lệ (2008), “Nuôi cấy mô sẹo dịch huyền phù Mãn Đình Hồng (Althaea rosea) cho mục tiêu thu nhận Rutin”, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV – Hóa sinh sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghiệp thực phẩm, tr 801 – 804 Abeywardena M.Y And Head R.J (2001), “Dietary polyunsaturated fatty acid and antioxidant modulation of vascular dysfunction in the spontaneously hypertensive rat”, Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acid, 65: 91- 97 Chen Y.Q., YiF., Cai M., and Luo J-X (2003), “Effects of amino acids, nitrate, and ammonium on the growth and taxol production in cell clutures of Taxus yunnanensis”, Plant Growth Regulation, 41: 265 – 268 Razdan M.K (2003), Introduction to Plant Tissue Cluture, Enfield: Science Publishers Inc., ISBN 1-57808-237-4, 375p Yang J., Guo J, Yuan J (2008), In vitro antioxidant properties of rutin, LWT – Food Science and Technology, 41: 1060 – 1066 (Ngày Tòa soạn nhận bài: 21-5-2012; ngày phản biện đánh giá: 21-6-2012; ngày chấp nhận đăng: 23-10-2012) 111 ... _ kĩ thu? ??t chọn lọc dịng tế bào Mãn Đình Hồng với mục tiêu thu nhận dịng tế bào có khả tăng sinh nhanh chứa rutin Vật liệu phương pháp tiến hành 2.1 Nguyên liệu Hạt Mãn Đình Hồng mua từ... trí dịng tế bào tăng trưởng nhanh Hình Các dịng tế bào Mãn Đình Hồng tăng sinh nhanh cấy chuyền sang môi trường để tiếp tục tăng sinh A1, A2, A3: dòng tế bào 5, 9, 12 tuần tuổi B: dịng tế bào tạo... lắc hỗn hợp tế bào môi trường đổ vào đĩa Petri với bề dày khoảng 1mm (theo kĩ thu? ??t cấy trải đĩa tạo dòng tế bào Bergmann, 1960) [5] Sau tuần, chọn dòng tế bào Mãn Đình Hồng tăng sinh nhanh cấy