ĐIỆN DI AGAROSE GEL

Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com M Đ U thể sinh vật, vật chất sống đ ợc cấu tạo từ đại phân tử sinh học, quan trọng nucleic acid protein Các nucleic acid đóng vai trị quan trọng l u trữ truyền đạt thông tin di truyền cho hệ sau Hơn nữa, thông tin đ ợc biểu thể thông qua tạo thành phân tử protein Trong trình chép nh tổng hợp protein xuất nhiều biến đổi, nguồn gốc c a tiến hóa tính đa dạng c a sinh giới Vì việc tìm hiểu, phân tích phân tử DNA, RNA cần thiết Khi hiểu rõ cấu trúc, đặc điểm c a đại phân tử này, kết hợp với phát triển kỹ thuật, công nghệ tiến hành lai tạo, chọn giống mới, sản xuất hợp chất thứ cấp dùng y học, sản xuất chất kháng sinh… Có nhiều kỹ thuật đ ợc ứng d ng công nghệ sinh học để nghiên cứu vật chất sống, điện di kỹ thuật hữu ích sử d ng nhằm phân tích, xác định tinh đoạn DNA cách dựa vào dịch chuyển c a chúng môi tr ng điện tr ng Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com N I DUNG I NGUYÊN T C CHUNG Điện di t ợng dịch chuyển c a phân tử tích điện d ới tác động c a điện tr ng, hay nói cách khác kỹ thuật phân chia phân tử DNA, RNA, protein dựa đặc điểm vật lỦ nh khối l ợng hay điện tích thực c a chúng Khi phân tử tích điện đ ợc đặt điện tr ng, chúng dịch chuyển cực (+) (-) tùy theo điện tích c a chúng Protein có điện tích thực d ơng âm, cịn nucleic acid có điện tích âm khơng đổi nh khung phosphate c a dịch chuyển h ớng đến cực d ơng Các phân tử protein nucleic acid đ ợc chạy điện di khuôn đỡ (support matrix) nh giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose polyacrylamide gel Tuy nhiên, kỹ thuật điện di giá rắn (agarose polyacrylamide) đ ợc sử d ng phổ biến Kỹ thuật sử d ng dung dịch đệm để dẫn điện tạo điện tr ng đều, gel để phân tách phân tử chất nhuộm khác để phát vị trí phân tử gel sau điện di Trong đó, polyacrylamide gel đ ợc dùng để phân tách phân tử protein phân tử DNA có chiều dài 100 oC sau đ ợc làm lạnh; dạng gel xuất khoảng 40-45 oC Bản chất q trình đơng lại c a agarose phản ứng trùng hợp gắn nhiều gốc monomer tạo thành polymer nh nhiệt độ Các Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com chuỗi polymer liên kết chéo với tạo thành hệ thống mạng l ới với kích th ớc mắt l ới tùy thuộc vào nồng độ agarose phản ứng polymer hố Hình C u trúc hoá học c a agarose c u trúc agarose gel Nguyên t c Các phân t nucleic acid co khôi l ̣ng va điê ̣n tich khac đ ̣c tach di chuyể n t c c̣ âm sang c c̣ d ơn g của ̣ điê ̣n di mô ̣t điê ̣n tr ơng co điê ̣n thê va c ơng đô ̣ thich hơ ̣p Tốc độ dịch chuyển c a phân tử gel ph thuộc vào kích th ớc, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện tr ng Điện di agarose gel đ ợc xem ph ơng pháp tối u dùng để phân tích, xác định tinh đoạn DNA Vị trí c a DNA gel đ ợc xác định trực tiếp : băng DNA gel đ ̣c nhuô ̣m ở nông đô ̣ thâp của thuôc nhuô ̣m huynh quang ethidium bromide (EtBr) co thể phát d ới ánh sáng tử ngoại Các y u tố ảnh h ng 2.1 Ḱch thức c̉a phân t̉ Các phân tử DNA có kích th ớc lớn (khối l ợng phân tử lớn) tốc độ dịch chuyển chậm Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi qua gel tôc đô ̣ t̉ lệ nghịch với hàm log10 c a khối l ợng phân t ̉ của chung Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com đệm: 0,5 x TBE – 0,5 μg/mL EtBr điện di: V/cm 16 Log10 cặp nucleotide 0,5% 0,7% 0,9% 1,2% 1,4% Hình Mơi quan ̣ gi ̃ a kich th ơc DNA va đ linh đô ̣ng điêṇ di của no 2.2 Nông độ agarose Đoa ̣n DNA mang kich th ơc khác dich ̣ chuyể n ở cac tôc đô ̣ khac qua cac bản gel ch a cac nông đô ̣ agarose khac Bảng Các thông số địn di DNA b̀ng agarose gel Hàm l ̣ng agarose (%) gel Ḱch th ́c DNA mạch thẳ ng (kb) s ̉ du ̣ng co hiêụ quả 0,3 60-5 0,6 20-1 0,7 10-0,8 0,9 7-0,5 1,2 6-0,4 1,5 4-0,2 2,0 3-0,1 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com A B Hình Địn di m u DNA giống C 2 nồng đ agarose khác A: 1%, B: 1,5% C: 2% Theo hình trên, dịch chuyển c a tập hợp đoạn DNA hai mẫu nồng độ khác c a agarose, tất chúng ba khay gel đ ợc điện di điện áp th i gian xác định Kết cho thấy, đoạn lớn đ ợc phân tách tốt gel 1%, đoạn nhỏ thích hợp với gel 2% 2.3 Câu hinh của DNA Các DNA dạng vong đong, vịng đứt mạch thẳng có kh ối l ợng phân t ̉ sẽ dich ̣ chuyể n agarose gel ở cac tôc đô ̣ khac DNA c a plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh DNA c a plasmid loại nh ng có dạng mạch thẳng Dạng vịng đứt Dạng vịng đóng DNA mạch vịng DNA mạch thẳng Hình K t địn di v́i plasmid mạch vòng bên trái plasmid loại mạch thẳng bên phải Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 2.4 Th̀nh ph̀n base v̀ nhịt đ̣ Điê ̣n di của DNA agarose gel không bi ̣ảnh h ởng rõ bởi phân base của DNA hoă ̣c nhiê ̣t đô ̣ Trong agarose gel , tính linh động điện di t ơng đối c a đoạn DNA có kích th ớc khác không thay đổi kho ảng từ oC đến 30 oC Nói chung, agarose gel th ơng đ ̣c cha ̣y ở nhiê ̣t đô ̣ phong Ph ơng pháp địn di 3.1 Thiết bị địn di Hình C u trúc thi t bị địn di agarose gel Thiết bị điện di agarose gel gồm phận bản: nắp, khay vận hành buồng điện di + Nắp: nắp có đầu c a dây cáp điện nối điện cực buồng điện di với nguồn điện + Khay vận hành bao gồm: khay đổ gel, khuôn đổ gel, l ợc Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com + Buồng điện di: nơi đặt gel trình điện di Buồng có rưnh để cài l ợc, hai điện cực tạo điện tr ng dung dịch 3.2 Đê ̣m pH Một số đệm điện di DNA thích hợp Tris-acetate-EDTA (TAE), Trisborate-EDTA (TBE) Tris-phosphate-EDTA (TPE) nồng độ khoảng 50 mM va pH 7,5-7,8 Trong đó, TAE s ̉ du ̣ng nhiêu nhât , nh ng khả đê ̣m la ̣i thâp Đê ̣m TBE TPE đêu co khả hoa tan tôt cac đoa ̣n DNA va khả đê ̣m cao Các đoạn DNA dịch chuyển với tốc độ khác ba loại đệm Đệm giúp thiết lập giá trị pH, cung cấp ion để hỗ trợ cho độ dẫn Bảng Các loại đ̣m sử dụng phổ bi n địn di Đ̣m Nồng đ dung dịch sử dụng Tris-acetateEDTA(TAE) 40 mM Tris 20 mM acetic acid mM EDTA Tris-borateEDTA (TBE) 89 mM Tris 89 mM boric acid mM EDTA Tris-phosphateEDTA (TPE) Dung dịch stock (1 lít) (50) 242 g Tris base 57,1 mL glacial acetic acid 100 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0) (10) 108 g Tris base 55 g boric acid 40 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0) 80 mM Tris- phosphate mM EDTA (10) 108 g Tris base 15,5 mL H3PO4 85% 40 mL EDTA 3.3 Quy trinh điê ̣n di 3.3.1 Chuẩn bị agarose gel Có nhiều loại agarose khác thích hợp để chạy điện di , loại agarose dùng tôt nhât thi nghiê ̣m la type -II-agarose co nô ̣i thẩ m thâu thâp (low-endo- osmotic) Nó d̃ dàng chảy va ta ̣o mô ̣t dung dich ̣ suôt , kêt quả la gel đan hôi thâ ̣m chi ở cac nông đô ̣ thâp Tuy nhiên , type-II-agarose dễ bi ̣bẩ n b sulphate polysaccharides (SP), n ̃ a SP c chê cac enzyme nh ligase polymerase va RE Vì thế, đoạn DNA dung ly từ gel nh phải đ ợc làm c̉n thận tr ớc chúng đ ợc dùng nh khuôn mẫu chất cho cac enzyme i , Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com Cách tiến hành: Cho 1% type-II-agarose vao 100 mL đê ̣m 0,5 TAE Đun nồi khử trùng hoă ̣c lị vi sóng cho đên agarose tan hoan toan trình đun n ớc nhiều phải thêm n ớc cho đ Nêu qua 100 mL Để nguô ̣i khoảng 60oC va đổ vao bu ồng điê ̣n di co cai s ẵn l ̣c Chiêu day gel khoảng mm la thích hơ ̣p Sau 30-40 phút, gel đã đông c ng, gỡ l ̣c 3.3.2 Đ̣t m̃u DNA v̀o giếng Tùy thuộc vào m c đích điện di khác sử d ng nồng độ DNA cao hoă ̣c thâp Chẳ ng ̣n theo tỷ lê ̣ sau: DNA (1 g/1 µL ) : L Đê ̣m mau bromophenol (10 loading dye):1 L N ớc cât lân: L Tổng số : 11 L Dùng micropipette hút 11 L dung dich ̣ cho vao giêng Th ơng đă ̣t mẫu sau đã đổ dich ̣ đê ̣m 0,5 TAE vao buồng điê ̣n di cho ngâ ̣p gel, đă ̣t mẫu tr ớc đổ đệm sau Th ng dùng micropipette loại 20-200 L đặt bu ồng điê ̣n di ban co nên đen Khi tăng điện c a trình điện di, đoạn DNA lớn th ng dịch chuyển nhanh so với đoạn nhỏ DNA dịch chuyể n t c c̣ âm đên c c̣ d ơng Quan sat s ̣ d ịch chuyể n băng mau bromophenol để biết lúc cân ng ng điê ̣n di 3.3.3 Nhuộm DNA băng EtBr Ph ơng phap quan sat DNA agarose gel thuâ ̣n lơ ̣i nhât la dung thuôc nhuô ̣m huynh quang EtBr Sau cha ̣y điê ̣n di xong lây nhe ̣ bản gel khỏi khuôn ngâm vào dung dịch EtBr nông đô ̣ 0,5 g/mL, thơi gian 30-45 phút, tôt nhât may lăc nhe ̣ (đô ̣ 10 vòng/phút ) Đổ dịch nhuộm EtBr vào binh riêng để x ̉ ly va rửa gel cách ngâm n ớc cất hai lần, mỗi lân 15-20 phút EtBr th ơng pha sẵn ở da ̣ng đâ ̣m đă ̣c mg/mL va gi ̃ 4oC EtBr đ ̣c dung để phát hi ện DNA sơ ̣i đôi va RNA sơ ̣i đơn Tuy nhiên, lực (affinity) c a thuôc nhuô ̣m đôi vơi nucleic acid sơ ̣i đơn la t ơng đôi thâp va co hiê ̣u Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com suât huynh quang không cao Sau nhuộm, EtBr xen vào base c a nucleic acid cho phép phát d̃ dàng chúng gel Th ơng EtBr (0,5 g/mL) đ ̣c đ a vào agarose gel đ ể phản ứng nhuộm xảy suốt trình điện di Mă ̣c du tinh linh đô ̣ng điê ̣n di của DNA sơ ̣i đơi mạch thẳng giảm có mặt thuốc nhuộm (khoảng 15%), nh ng khả xac đinh ̣ gel tr c̣ tiêp d anh sang UV suôt qua trinh ện di hoă ̣c ở giai đoa ̣n cuôi co u thê rõ rê ̣t Tuy nhiên , nêu cân co thể ch ạy điện di gel không co EtBr va chỉ nhuô ̣m DNA ho ặc RNA sau điê ̣n di xong Gel đ ̣c ngâm đê ̣m điê ̣n di hoă ̣c H2O ch a EtBr (0,5 g/mL)/45 phút Vị trí gắn lược nhiệt độ phịng Dung dịch agarose gel Lược Giếng Băng dính b Gắn lược đổ agarose gel vào khuôn a Khuôn đổ gel c Lấy lược khỏi khuôn gel Nguồn điện di Micropipette Cable Đệm điện di Nắp Buồng điện di e Chạy điện di d Nạp mẫu DNA vào giếng Hình Sơ đồ minh họa b ́c trình địn di agarose gel 3.3.4 Quan sat va chụp ảnh Bản gel sau nhuộm EtBr đ ợc quan sát d ới ánh sáng tử ngoại nm) Dùng thiế t bi ̣chuyên du ̣ng đ ( = 302 ể phân tích l u trữ hình ảnh DNA (Gel Documentation System) Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com (a) (b) Hình 7: Quan sát DNA d ́i ánh sáng tử ngoại (a) hình ảnh địn di DNA agarose gel (b) 3.4 Ṃt số phương pháp thu hôi DNA tư agarose gel a) Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm đ ợc cắt khỏi gel cho vào đệm với t̉ lệ 1:1, bổ sung muối đến nồng độ 0,5 M, sau đ ợc nóng chảy 70oC để hịa tan hồn tồn đệm Dung dịch gel có DNA đ ợc chiết phenol/chloroform kết t a L u Ủ DNA đ ợc tách chiết ph ơng pháp khơng thích hợp cho ph ơng thức thao tác tiếp theo, diện c a nhân tố ức chế agarose Cho vào đệm với t̉ lệ 1:1 Agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp Cắt Bổ sung muối đến nồng độ 0,5M Đoạn DNA quan tâm 70oC Dung dịch gel có DNA Chiết phenol/chloroform kết t a Hình Sơ đồ tóm t t q trình thu hồi DNA quan tâm b̀ng cách dùng agarose có nhịt đ nóng chảy th p 10 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com b) Ly tâm Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm đ ợc cắt cho vào đệm chiết, làm nóng để hịa tan hồn tồn, sau cho dung dịch gel lên lớp th y tinh đư silicon hóa đặt cột lọc nhỏ loại 0,5 ml Cột đ ợc cho vào tube vi ly tâm loại 1,5 mL đ ợc ly tâm tốc độ cao 10.000-15.000 rpm 10-15 phút DNA liên kết với màng dung dịch đệm qua lớp th y tinh vào tube vi ly tâm Cho đệm rửa vào cột rửa cột vài lần cách ly tâm nhanh Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNA vào cột ly tâm để dung ly (elution) DNA khỏi màng vào tube Dung dịch DNA thu đ ợc đ ợc tinh thêm cần Cũng đơng lạnh mẫu gel tr ớc dùng ph ơng pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA cho vào tube ly tâm agarose gel chứa băng DNA Cắt ly tâm 10.00015.000 rpm 10-15 phút Đoạn DNA quan tâm DNA liên kết với màng cho vào đệm chiết, làm nóng hịa tan hồn toàn rửa cột vài lần th y tinh đặt cột lọc dung ly DNA khỏi màng Hình Sơ đồ tóm t t q trình thu hồi DNA quan tâm b̀ng cách dùng ly tâm c) Điện di vào bẫy * Cách 1: Một rãnh nhỏ đ ợc cắt agarose gel phía tr ớc c a băng DNA quan tâm Rưnh đ ợc làm đầy glycerol gel đ ợc điện di nhanh tr lại để chuyển DNA từ gel vào dung dịch glycerol (quá trình điện di 11 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com đ ợc kiểm sốt UV) Dung dịch glycerol-DNA sau đ ợc chiết pipette * Cách 2: sau điện di, khe nhỏ đ ợc cắt gel phía tr ớc băng DNA quan tâm đặt khe mẫu giấy loại NA-45 Gel sau đ ợc điện di tr lại băng DNA quan tâm dịch chuyển vào mẫu giấy Mẫu giấy sau đ ợc rửa DNA đ ợc dung ly đệm cách đun nóng mẫu giấy tới 70oC DNA sau đ ợc tách chiết phenol kết t a Cắt rãnh nhỏ tr ớc băng DNA quan tâm Cắt rãnh nhỏ phía tr ớc băng DNA quan tâm Đặt khe mẫu giấy loại NA-45 Làm đầy glycerol Điện di nhanh tr lại để chuyển DNA từ gel vào mẫu giấy Điện di nhanh tr lại để chuyển DNA từ gel vào dung dịch glycerol Rửa mẫu giấy dung ly DNA đệm Chiết dung dịch glycerol-DNA pipette Tách chiết DNA phenol kết t a (b) (a) Hình 10 Sơ đồ tóm t t q trình thu hồi DNA quan tâm b̀ng cách dùng địn di vào b y (a): cách 1, (b): cách d) Dùng hạt th y tinh Mẫu gel quan tâm đ ợc hòa tan dung dịch muối NaI nồng độ khoảng M Sau đó, hạt th y tinh đ ợc bổ sung vào dung dịch để liên kết hiệu với đoạn DNA đ ợc phóng thích nồng độ đư cho c a NaI RNA, protein tạp chất khác không liên kết với hạt th y tinh Tiếp theo, tiến hành rửa kết t a tiểu thể, DNA tinh đ ợc dung ly khỏi hạt th y tinh đệm muối thấp Tuy nhiên, ph ơng pháp nhanh hiệu nh ng lại có phạm vi tối u hẹp Thu hồi đoạn DNA nhỏ (500-800 bp) không hiệu đoạn lớn 12 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com (>15 kb) liên kết với hạt th y tinh khác sợi DNA bị phá vỡ suốt chu kỳ rửa Hòa tan gel dung dịch muối NaI (4 M) Rửa kết t a tiểu thể Dung ly DNA khỏi hạt th y tinh đệm muối thấp Bổ sung hạt th y tinh vào dung dịch Tách chiết DNA phenol kết t a DNA liên kết với hạt th y tinh Hình 11: Sơ đồ tóm t t q trình thu hồi DNA quan tâm b̀ng cách dùng hạt th y tinh ng dụng c a địn di agarose gel ớc l ợng kích th ớc c a phân tử DNA sau thực phản ứng cắt hạn chế (ví d : lập đồ hạn chế c a DNA đ ợc tạo dịng…) Phân tích sản ph̉m PCR (ví d : ch̉n đốn di truyền phân tử in dấu di truyền…) Phân tách DNA hệ gen đư đ ợc cắt hạn chế tr ớc th̉m tích Southern, RNA tr ớc th̉m tích Northern u điểm nh ̣c điểm * u điểm c a ph ơng pháp gel đ ợc rót d̃ dàng, khơng gây biến tính mẫu bền vững vật lỦ polyacrylamide Mẫu d̃ thu hồi * Nh ợc điểm agarose gel bị nóng chảy q trình điện di, đệm bị tiêu hao, dạng khác c a nucleic acid chạy khơng ổn định II ĐIỆN DI POLYACRYLAMIDE GEL Acrylamide monomer có cấu trúc nh sau: CH2 = CH C NH2 O Khi có mặt gốc tự do, đ ợc cung cấp b i ammonium persulphate ổn định b i TEMED (N, N, N', N'-tetramethylathylene-diamine), phản ứng chuỗi 13 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com bắt đầu acrylamide monomer đ ợc polymer hoá thành chuỗi dài CONH2 S2O42- CONH2 SO4- + nCH2 = CH nCH2 CH CONH2 CH2 CH TEMED Khi bisacrylamide (N, N'-methylenebisacrylamide) đ ợc bổ sung phản ứng polymer hoá, chuỗi liên kết chéo để tạo thành dạng gel Độ xốp c a gel đ ợc xác định b i chiều dài c a chuỗi mức độ liên kết chéo Mức độ liên kết chéo xác định kích th ớc lỗ, từ phân tách phân tử protein với kích th ớc khác Kích th ớc trung bình c a lỗ gel đ ợc điều chỉnh cách thay đổi t̉ lệ acrylamide bisacrylamide Hình 12 Hình thành liên k t chéo Hình 13 Hình thành polyacrylamide gel 14 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com Nguyên t c địn di polyacrylamide gel Dùng để phân tách phân t protein, đoa ̣n DNA , kể RNA DNA/RNA Gel phải đ ̣c rot vao gi ̃ a hai tâm kinh đ ̣c ngăn cach bởi cac miêng đệm (gel spacers) để ngăn không cho polyacrylamide tiêp xuc vơ i không Gel co thể dai t 10-100cm thuô ̣c vao yêu câu phân tich va chung th ơng đ ̣c cha ̣y ph ơng thẳ ng đ ng Có thể đúc gel nồng độ khác c a polyacrylamide từ 3,5%- 20% tùy thuộc vào kích th ớc c a phân tử protein đoa ̣n DNA quan tâm Nồng độ thấp tạo lỗ có kích th ớc lớn phân tách phân tử lớn Liên kết chéo c a monomer tác nhân liên kết đ ợc điều chỉnh để kiểm sốt mức độ xốp c a khn gel Điều cho phép tối u hóa khn gel để phân tách phạm vi kích th ớc đặc biệt c a phân tử protein Hình 14 Polyacrylamide gel Địn di acid nucleic Điện di polyacrylamide gel đ ̣c dung để phân tich va thu h ồi cac đoa ̣n DNA có chiều dài từ 5-2.000 bp Nồng độ polyacrylamide gel đ ợc sử d ng khoảng t 3,5-20% tùy thuộc vào kích th ớc c a đoạn DNA quan tâm Hai loa ̣i polyacrylamide gel th ng đ ̣c s ̉ du ̣ng la: - Polyacrylamide gel không biên tinh dung đ ể phân tách tinh đoa ̣n DNA sơ ̣i đôi - Polyacrylamide gel biên tinh b ằng urea formamide dung để phân tách va tinh sa ̣ch cac đoa ̣n DNA sơ ̣i đơn 15 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com Trong đó, polyacrylamide gel khơng biến tính loại gel hay đ ợc sử d ng Hiê ̣u c a phân tách DNA lo ại gel phu ̣ thuô ̣c vào nơng ̣ của acrylamide, kích th ớc điện tích c a DNA Bảng Hiêụ quả của s ̣ phân tách DNA polyacrylamide gel không biên tinh Acrylamide (% w/v) Hiêụ quả phân tich (nucleotide) 3,5 1.000-2.000 5,0 80-500 8,0 60-400 12,0 40-200 15,0 25-150 20,0 6-100 Hình 15 C u trúc thi t bị địn di polyacrylamide gel 16 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 2.1 Phương pháp địn di polyacrylamide gel khơng biến tính 2.1.1 Chuẩn bị polyacrylamide gel khơng biến tính Kích th ớc phổ biến c a kính đổ gel th ng đệm dày khoảng 0,5 mm-2,0 mm Các gel dày th trình điện di nên làm nhịe băng DNA , ng gel mỏng Tuy nhiên , khi cha ̣y mô ̣t l ̣ng lơn DNA 20 cm40 cm Miêng ng nóng lên i ta th ng sử d ng (>1 g/băng) cần chuẩ n bi ̣gel day 2.1.2 Các bước tiến hành: a) Chuẩn bị dung dịch: 30% acrylamide (gôm bis-acrylamide), 1 TBE, 10% ammonium persulphate b) Lau sa ̣ch hai tâm kinh dung lam khuôn gel va miêng đê ̣m băng KOH/methanol hoă ̣c ethanol X ̉ ly bê mă ̣t của hai tâm kinh băng dung dich ̣ silicon để ngăn gel dính chặt vào hai kính gây rách gel lúc lấy khỏi khn sau điê ̣n di xong c) Tính tốn thể tích c a dung dịch dùng đ ể tạo polyacrylamide gel sở kich th ơc tâm kinh, đô ̣ day của miếng đệm Bảng Dung tich của cac chât dung cho polyacrylamide gel Sô mL của cac nông đô ̣ (%) khác Dung dich ̣ để chủn bị gel 3,5% 5,0% 8,0% 12,0% 20,0% 11,6 16,6 26,6 40,0 66,6 N ơc 67,6 62,7 52,7 39,3 12,7 5 TBE 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 0,7 0,7 0,7 0,7 30% acrylamide (bao gôm bis-acrylamide) 10% ammonium persulphate 0,7 d) Bổ sung 35 L TEMED vao mỗi 100 mL dung dich ̣ ta ̣o polyacrylamide gel, trơ ̣n hỡn hơ ̣p băng cach vortex Rót dung dịch tạo gel vào hai kính 17 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com Găn nhanh l ̣c vao , tránh bọt khí l ợc (giêng) Đỉnh của l ̣c phả i cao mep gel Nêu cân, bổ sung mô ̣t it dung dich ̣ ta ̣o gel để lam mep gel e) Cho phep acrylamide polymer hoa khoảng 60 phút nhiệt độ phịng, bở sung thêm dung dich ̣ ta ̣o gel nêu thây gel co vao nhiêu f) Sau polymer hoa hoan toan , rút l ợc cẩ n thâ ̣n , tháo băng dính khỏi đay khuôn gel Găn khuôn gel vao bu ồng điê ̣n di va lam bu ồng điê ̣n di băng đệm 1 TBE, dùng Pasteur pipette để phá bọt khí khỏi đáy gel giếng băng đê ̣m 1 TBE g) Trô ̣n cac mẫu DNA vơi m ột l ̣ng thich hơ ̣p của đê ̣m 6 gel-loading dye Đặt mẫu vào giếng micropipette Hamilton syringe h) Nôi buông điê ̣n di vơi bô ̣ nguôn Polyacrylamide gel không biên tinh th ơng chạy điện di khoảng V/cm đên V/cm Chạy gel thuốc nhuô ̣m chỉ thi ̣dich ̣ chuyể n đên vi ̣tri mong muôn Tăt nguôn, lây khuôn gel va đă ̣t lên ban Tháo kính nhỏ mặt tr ớc , tâm kinh lơn ở phi a sau đ ợc dùng làm giá đỡ chủn bị nhuộm gel Hình 16 Các b ́c chủn bị địn di 18 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 2.2 Phát hịn DNA polyacrylamide gel 2.2.1 Nhuộm băng ethidium bromide Ngâm nhe ̣ gel dung dich ̣ nhuô ̣m (0,5 g/mL EtBr 1 TBE) Sau 30-45 phút, lây gel kính đỡ ra, cẩ n thâ ̣n thâm khô bê mă ̣t gel b ằng giây thâm Kimwipe Ph lên bề mặt gel gi nylon (Saran wrap ), tránh tạo bọt khí hoă ̣c nêp gâp của Saran wrap Quan sát ch p ảnh may soi t ̉ ngoa ̣i Polyacrylamide co thể la m mât huynh quang của EtBr , đo không thể phat hiê ̣n cac băng DNA băng ph ơng phap nêu ham l ̣ng của no thâp 10 ng 2.2.2 Nhuộm thuốc nhuộm bạc: Thuốc nhuộm bạc sử d ng hiệu để phát cho phép phát l ợng protein dạng vết polyacrylamide gel l ợng nhỏ nucleic acid (pg), nhạy gấp 1.000-10.000 lần ph ơng pháp nhuộm EtBr Hai ph ơng pháp nhuộm bạc th ng đ ợc sử d ng là: 1) Dùng dung dịch diamine silver hay ammoniacal silver cho thấm vào gel pha loãng dung dịch acid c a formaldehyde 2) Thấm dung dịch silver nitrate vào gel môi tr ng acid yếu dùng formaldehyde khử có chọn lọc ion bạc thành bạc kim loại d ới điều kiện kiềm Ph ơng pháp diamine kiềm nhạy nh ng thích hợp gel dày, ph ơng pháp acid nhanh bắt màu tốt gel mỏng Quá trình nhuộm bao gồm b ớc sau: - Cố định nucleic acid acetic acid 7,5% tối thiểu phút để ngăn cản khuếch tán c a phân tử nucleic acid đư đ ợc phân tách gel, loại bỏ trung hịa hóa chất không mong muốn (urea đệm) - Rửa gel n ớc khử ion tối thiểu phút để loại bỏ acetic acid, chất b̉n dạng vết phần thừa c a thành phần gel hòa tan sau cố định - Nhuộm gel dung dịch bạc với có mặt c a formaldehyde để cải thiện độ nhạy độ t ơng phản Th i gian nhuộm tối u khoảng 20 phút Tuy nhiên, loại gel có đỡ polyester (8×10 cm) cần 10 phút để có chất l ợng hình ảnh cao mà không làm giảm độ nhạy - Rửa gel sau nhuộm bạc để loại bỏ thuốc nhuộm thừa gây kết t a màu nâu trình phát triển màu 19 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com - Phát triển màu c a gel hỗn hợp dung dịch sodium carbonate (4g/L), sodium thiosulfate (4 µM) formaldehyde để giảm background không đặc hiệu cách hiệu Nhiệt độ rửa thích hợp từ 8-10 oC, th i gian rửa thay đổi tùy vào thành phần c a dung dịch phát triển màu khoảng từ vài giây đến vài phút - Dừng phản ứng phát triển màu thu đ ợc hình ảnh tối u nhanh tốt cách dùng acetic acid lạnh 7,5% Hình 17 Phát hịn DNA b̀ng thuốc nhu m bạc 2.2.3 Phóng xạ tự ghi: DNA đ ợc phát đồng vị phóng xạ 32P Cố định nucleic acid acetic acid 7,5% Sau đó, tiến hành rửa gel n ơc kh ̉ ion Dùng giấy thâm Kimwipe để thâm khô bê mă ̣t gel Tiếp theo, đánh dấu phóng xạ sấy gel 80oC điều kiện chân không từ 1-2 gi sát kết 20 phim phóng xạ khoảng 24 giơ Quan Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com Hình 18 Hình ảnh địn di DNA có đánh d u 32P polyacrylamide gel phim X-quang 2.3 Phân lập cac đoạn DNA tư polyacrylamide gel Ph ơng phap tôt nhât để phân lâ ̣p DNA t polyacrylamide gel la kỹ thuâ ̣t của Maxam Gilbert (1977) u điểm c a ph ơng pháp: + DNA thu đ ̣c co đô ̣ tinh sa ̣ch cao + Phân lâ ̣p cả hai loa ̣i DNA sơ ̣i đôi va sơ ̣i đơn t cac polyacrylamide gel không biến tinh va biến tính Ph ơng th c sau đ ̣c cải tiến t kỹ thuâ ̣t của Maxam va Gilbert (1977): - Chạy điện di polyacrylamide gel Xác định vị trí c a DNA quan tâm phóng xạ tự ghi EtBr quan sát d ới ánh sáng UV - Dùng dao cắt mảnh gel chứa băng DNA quan tâm Không loa ̣i bỏ Saran wrap khỏi gel tr ơc căt , căt cả gel l ẫn Saran wrap, sau bóc mảnh gel nhỏ có chứa DNA quan tâm khỏi Saran wrap - Chuyể n gel vao E -tube (eppendorf tube), dùng tip c a micropipette để ép mảnh gel theo thành c a tube - Tính tốn thể tích thích hợp c a mảnh gel bổ sung1-2 thể tich của đê ̣m chiêt vào E-tube - Đong tube va ủ ở 37oC kem theo lăc vong nhe ̣ Đoa ̣n DNA nhỏ (