Giáo trình Giải phẫu bệnh lý động vật thuỷ sản (Nghề Phòng và chữa bệnh thuỷ sản Cao đẳng)

UỶ BAN NHÂN DÂN TỈNH ĐỒNG THÁP TRƯỜNG CAO ĐẲNG CỘNG ĐỒNG ĐỒNG THÁP GIÁO TRÌNH MƠN HỌC: GIẢI PHẪU BỆNH LÝ ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN NGÀNH, NGHỀ: PHÒNG VÀ CHỮA BỆNH THUỶ SẢN TRÌNH ĐỘ: CAO ĐẲNG (Ban hành kèm theo Quyết định Số:…./QĐ-CĐCĐ-ĐT ngày… tháng… năm 20… Hiệu trưởng Trường Cao đẳng Cộng đồng Đồng Tháp) Đồng Tháp, năm 2018 TUYÊN BỐ BẢN QUYỀN Tài liệu thuộc loại sách giáo trình nên nguồn thơng tin phép dùng ngun trích dùng cho mục đích đào tạo tham khảo Mọi mục đích khác mang tính lệch lạc sử dụng với mục đích kinh doanh thiếu lành mạnh bị nghiêm cấm i LỜI GIỚI THIỆU Giáo trình mơ đun GIẢI PHẪU BỆNH LÝ ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN trình bày từ kiến thức đến chuyên sâu vấn đề quản lý dịch bệnh thủy sản Giới thiệu cho sinh viên biết khái niệm bệnh động vật thủy sản, đường lan truyền bệnh Đồng thời giúp sinh viên nắm rõ kiến thức kỹ kỹ thuật biện pháp phòng bệnh tổng hợp ni trồng thủy sản từ hạn chế tác hại dịch bệnh động vật thủy sản góp phần thành cơng cho vụ ni Đồng thời, mơ đun trình bày chi tiết bệnh thường gặp động vật thủy sản bệnh virus, bệnh vi khuẩn, bệnh ký sinh trùng bệnh yếu tố sinh vật gây Các phương pháp phòng điều trị bệnh thường gặp dộng vật thủy sản Sinh viên sau học mơ đun tham gia chẩn đốn bệnh động vật thủy sản phịng thí nghiệm tham gia lấy mẫu bệnh trực tiếp trại giống, vùng nuôi thủy sản Xác định tác nhân gây bệnh để đề xuất liệu trình điều trị Giáo trình xây dựng sở dựa vào nghiên cứu công bố, tài liệu, giáo trình quý đồng nghiệp từ Trường, Viện nghiên cứu lĩnh vực nuôi trồng thủy sản, bệnh học thủy san, quan quản lý…Trong nội dung giáo trình có sai sót tác giả vui lịng tiếp nhận ý kiến đóng góp cho nội dung giáo trình ngày hoàn thiện nhằm bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu, học tập cho sinh viên người có quan tâm đến ngành thủy sản Tác giả xin chân thành cảm ơn! Đồng Tháp, ngày 26 tháng 07 năm 2018 Tham gia biên soạn Chủ biên: ThS NGUYỄN KIM KHA Thành viên: ThS HUỲNH CHÍ THANH Thành viên: ThS TẠ HỒNG BẢNH ii GIÁO TRÌNH MƠ ĐUN Tên mơ đun: GIẢI PHẪU BỆNH LÝ ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN Mã mơ đun: CNN571 Vị trí, tính chất, ý nghĩa vai trị mơn học: - Vị trí mơ đun: Là mơ đun chun mơn ngành bắt buộc ngành cao đẳng nuôi trồng thủy sản Môn có mối quan hệ mật thiết với mơ đun khác kỹ thuật ni lồi thủy sản nhằm giúp cán kỹ thuật quản lý sức khỏe cá cách có hiệu - Tính chất mô đun: Mô đun bao gồm kiến thức bệnh vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng virus đối tượng thủy sản, đường lây lan biện pháp phòng trị bênh động vật thủy sản - Ý nghĩa vai trò mô đun: Giúp cho sinh viên hiểu vận dụng kiến thức có liên quan đến chun mơn chuyên sâu phòng quản lý hiệu bệnh có liên quan đến động vật thủy sản học tập, nghiên cứu ứng dụng thực tế Bao gồm kiến thức lý thuyết thực hành nhằm nâng cao kỹ tay nghề sinh viên Mục tiêu mô đun: - Về kiến thức: Mô đun cung cấp cho sinh viên kiến thức bệnh động vật thuỷ sản, biện pháp phòng ngừa tổng hợp, nghiên cứu bệnh động vật thuỷ sản như: bệnh vi khuẩn, bệnh virus, bệnh nấm ký sinh trùng, bệnh phi sinh vật - Về kỹ năng: Có kỹ cần thiết để quan sát, kiểm tra, phân loại, xác định tác nhân gây bệnh tôm cá, từ hỗ trợ cho cơng tác phịng trị bệnh hợp lý - Về lực tự chủ trách nhiệm: Chủ động quản lý ao ni an tồn hiệu Ý thức trách nhiệm cao tính cộng đồng quản lý dịch bệnh thủy sản Nội dung mô đun: Thời gian Stt Tổng số Tên iii Lý thuyết Thực hành, Bài tập Kiểm tra (định kỳ)/ôn tập/T hi Thời gian Tổng số Lý thuyết Thực hành, Bài tập (định kỳ)/ôn tập/T hi 3 0 5 0 6 0 29 20 Bài 5: BỆNH DO KÝ SINH TRÙNG Bệnh nguyên sinh động vật Bệnh ngành giun sán ký sinh Bệnh ngành giáp xác ký sinh 14 Kiểm tra 0 Bài 6: BỆNH DO ĐỊCH HẠI VÀ PHI SINH VẬT Bệnh địch hại Bệnh yếu tố môi trường Bệnh dinh dưỡng 3 0 Tên Stt Kiểm tra Bài 1: NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ BỆNH THỦY SẢN Đặc điểm phân loại bệnh động vật thuỷ sản Những khái niệm bệnh truyền nhiễm Khái niệm bệnh ký sinh trùng Một số trình bệnh lý Bài 2: NHỮNG NÉT CƠ BẢN VỀ NGHIÊN CỨU BỆNH THỦY SẢN Nguyên nhân điều kiện phát sinh bệnh Phương pháp thu bảo quản mẫu bệnh cá, tôm Phương pháp chẩn đoán phát bệnh cá, tơm Bài 3: BIỆN PHÁP PHỊNG BỆNH TỔNG HỢP TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Cơ sở khoa học cơng tác phịng bệnh Biện pháp phịng bệnh tổng hợp nuôi trồng thuỷ sản Một số phương pháp trị bệnh cá tôm Bài 4: BỆNH DO VI KHUẨN VIRUS VÀ NẤM Bệnh vi khuẩn Bệnh nấm ký sinh Bệnh virus tôm iv Thời gian Kiểm tra Tổng số Lý thuyết Thực hành, Bài tập (định kỳ)/ơn tập/T hi Ơn thi 0 Thi kết thúc học phần 0 60 29 28 Tên Stt Cộng v MỤC LỤC THÔNG TIN VỀ TÁC GIẢ MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ GIỚI THIỆU CHƯƠNG I: NHỮNG KIẾN THỨC TỔNG QUÁT 10 I.1 SỨC KHỎE VÀ ĐỘNG VẬT THỦY SẢN 10 I.2 NHỮNG VẤN ĐỀ CHUNG TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỦY SẢN 10 I.2.1 Sự đồng thao tác thu, xử lý phân tích mẫu .10 I.2.2 So sánh kết phòng thí nghiệm 10 I.2.2.1 Các dạng kết ý nghĩa chúng 10 I.2.2.2 Phương thức so sánh, ví dụ 11 I.2.3 Những vấn đề cần lưu ý 11 I.2.3.1 Giá trị giới hạn cho phép phân tích 11 I.2.3.2 Tính hiệu lực phương pháp chẩn đốn 11 I.2.3.3 Tính ổn định phương pháp 11 I.2.3.4 Đối chứng .11 I.2.4 Phát chẩn đoán bệnh 12 I.2.4.1 Chẩn đoán lâm sàng .12 I.2.4.2 Những biện pháp sàng lọc (screening) 12 I.2.4.3 Phát bệnh (detection) .12 I.2.4.4 Chẩn đoán bệnh (diagnostic) 12 I.2.4.5 Các đường lây truyền bệnh (disease transmission) 12 I.2.5 Vai trị chẩn đốn quản lý dịch bệnh thủy sản 13 I.2.6 Các mức độ chẩn đoán bệnh thủy sản 13 I.2.6.1 Mức I: .13 I.2.6.2 Mức 2: 14 I.2.6.3 Mức 3: 14 I.2.7 Phân nhóm kỹ thuật phát hiện/chẩn đốn bệnh thủy sản 14 I.2.8 Các kỹ thuật quan sát 17 I.2.8.1 Những kỹ thuật quan sát 17 I.2.8.2 Những kỹ thuật mô học đặc biệt 17 I.2.8.3 Kỹ thuật hiển vi điện tử 17 I.2.8.4 Các kỹ thuật nuôi vi sinh vật 17 I.2.9 Các kỹ thuật huyết .17 I.2.10 Các kỹ thuật phân tử 17 I.3 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG 18 CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT .19 II.1 QUAN SÁT DẤU HIỆU BỆNH, MẪU GIẢI PHẪU TƯƠI VÀ MÔ BỆNH HỌC 19 II.1.1 Phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh 19 II.1.1.1 Những vấn đề cần lưu ý quan sát bệnh lý thủy sản 19 II.1.1.2 Quan sát bệnh lý tôm 20 II.1.1.3 Phương pháp quan sát bệnh lý cá .22 II.1.2 Phương pháp quan sát mẫu giải phẫu tươi 25 II.1.3 Phương pháp mô học 26 II.1.3.1 Mục tiêu 27 II.1.3.2 Những điều cần lưu ý sử dụng phương pháp mô bệnh học: 27 II.1.3.3 Phương pháp mô học bao gồm bước: .27 II.2 KỸ THUẬT HĨA MƠ MIỄN DỊCH 28 II.2.1 Nguyên tắc 28 II.2.2 Ứng dụng .28 II.2.3 Mẫu phân tích 29 II.2.4 Thao tác .29 II.2.5 Ưu nhược điểm phương pháp 29 II.2.5.1 Ưu điểm: .29 II.2.5.2 Nhược điểm: 30 II.3 KỸ THUẬT NUÔI VI SINH VẬT 30 II.2.1 Nuôi vi khuẩn 30 II.2.1.1 Ứng dụng 30 II.2.1.2 Phương pháp 30 II.2.1.3 Mẫu phân tích .31 II.2.1.4 Ưu nhược điểm phương pháp 31 II.2.2 Nuôi nguyên sinh động vật 31 II.2.2.1 Ứng dụng 31 II.2.2.2 Phương pháp 31 II.2.2.3 Mẫu phân tích .31 II.2.2.4 Ưu nhược điểm phương pháp 31 II.2.3 Nuôi vi-rút 31 II.2.3.1 Ứng dụng 31 II.2.3.2 Phương pháp 32 II.2.3.3 Mẫu phân tích .32 II.2.3.4 Đọc kết 32 II.3 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG II 33 CHƯƠNG III: CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH 34 III.1 PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA MIỄN DỊCH 34 III.1.1 Nguyên lý 34 III.1.2 Ứng dụng 35 III.1.3 Mẫu phân tích .35 III.1.4 Các dạng khuếch tán miễn dịch 35 III.1.4.1 Kết tủa môi trường lỏng .35 III.1.4.2 Tủa môi trường gel 37 III.1.4.3 Miễn dịch khuếch tán điện 38 III.1.4.4 Miễn dịch khuếch tán: Điện di với miễn dịch khuếch tán in situ 38 III.1.5 Ưu nhược điểm phương pháp 39 III.1.5.1 Ư u ểm: 39 III.1.5.2 Nhược điểm: 39 III.2 PHƯƠNG PHÁP NGƯNG KẾT MIỄN DỊCH 39 III.2.1 Nguyên lý 39 III.2.2 Xếp loại phản ứng ngưng kết .40 III.2.2.1 Ngưng kết trực tiếp: 40 III.2.2.2 Ngưng kết gián tiếp: 40 III.2.2.3 Ngưng kết nhân tạo: 40 III.2.3 Ứng dụng 41 III.2.4 Mẫu phân tích .41 III.2.5 Ưu nhược điểm phương pháp 41 III.2.5.1 Ư u ểm: 41 III.2.5.2 Nhược điểm: 41 III.3 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG 41 III.3.1 Nguyên lý 41 III.3.2 Phương pháp .42 III.3.2.1 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp 42 III.3.2.2 Kỹ thuật miễn dịch huỳng quang gián tiếp 42 III.3.3 Ứng dụng 43 III.3.4 Mẫu phân tích .43 III.3.5 Ưu nhược điểm phương pháp 43 III.3.5.1 Ưu điểm: 43 III.3.5.2 Nhược điểm: 43 III.4 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH LIÊN KẾT ENZYM 44 III.4.1 Nguyên lý 44 III.4.2 Ứng dụng 45 III.4.3 Mẫu phân tích .45 III.4.4 Phương pháp .45 III.4.4.1 Kỹ thuật ELISA gián tiếp 45 III.4.4.2 Kỹ thuật ELISA trực tiếp 46 III.4.5 Ưu nhược điểm phương pháp 47 III.4.5.1 Ưu điểm: 47 III.4.5.2 Nhược điểm: 47 III.5 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG III 47 CHƯƠNG 4: CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ 48 IV.1 KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP 48 IV.1.1 Nguyên tắc 48 IV.1.1.1 Giai đoạn biến tính (denaturation): .48 IV.1.1.2 Giai đoạn lai (hybridization): 48 IV.1.1.3 Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (extension): 48 IV.1.2 Ứng dụng 49 IV.1.3 Phương pháp 50 IV.1.3.1 Ly trích DNA hay RNA từ vật chủ để sử dụng làm mạch khuôn .50 IV.1.3.2 Chuẩn bị 50 IV.1.3.3 Đối chứng 51 IV.1.4 Các hạn chế phương pháp PCR 52 IV.1.5 Các dạng PCR 52 IV.1.5.1 PCR truyền thống 52 IV.1.5.2 PCR phiên mã ngược 53 IV.1.5.3 PCR thời gian thật .54 IV.2 KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG VỀ CHIỀU DÀI ĐOẠN GIỚI HẠN 54 IV.2.1 Nguyên lý 54 IV.2.2 Phương pháp 54 IV.2.3 Hệ thống phi phóng xạ DIG .55 IV.2.4 Ứng dụng kỹ thuật lai Southern 56 IV.2.5 Mẫu phân tích 57 IV.2.6 Ưu nhược điểm 57 IV.2.6.1 Ưu điểm: .57 IV.2.6.2 Nhược điểm: 57 IV.3 KỸ THUẬT LAI IN SITU 57 IV.3.1 Nguyên lý 57 IV.3.2 Ứng dụng 57 IV.3.3 Mẫu phân tích 57 IV.3.4 Ưu nhược điểm phương pháp 58 IV.3.4.1 Ưu điểm: .58 IV.3.4.2 Nhược điểm: 58 IV.4 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG IV 58 CHƯƠNG V: MỘT SỐ QUI TRÌNH PHÁT HIỆN BỆNH Ở THỦY SẢN 59 V.1 PHÁT HIỆN VI-RÚT ĐỐM TRẮNG Ở TÔM BẰNG KỸ THUẬT PCR 59 V.1.1 Ðối tượng phạm vi áp dụng 59 V.1.2 Tài liệu tham khảo xây dựng tiêu chuẩn ngành 59 V.1.3 Giải thích thuật ngữ .59 V.1.4 Thiết bị, dụng cụ, mồi hóa chất 60 V.1.4.1 Thiết bị, dụng cụ 60 V.1.4.2 Mồi, hóa chất 61 V.1.5 Chuẩn bị mẫu .62 V.1.5.1 Số lượng mẫu 62 V.1.5.2 Yêu cầu mẫu để phân tích 63 V.1.6 Phương pháp tiến hành 63 V.1.6.1 Xử lý mẫu 63 V.1.6.2 Phản ứng khuếch đại PCR 63 V.1.6.3 Tiến hành điện di 64 V.1.7 Ðọc kết 64 V.1.8 Quy định đảm bảo an toàn 65 V.2 PHÁT HIỆN YHV VÀ GAV BẰNG KIT IQ2000 YHV/GAV 65 V.2.1 Giới thiệu .65 V.2.2 Thành phần 65 V.2.3 Thiết bị hóa chất .66 V.2.4 Giới hạn phát tính nhạy 67 V.2.5 Chuẩn bị mẫu ly trích RNA 67 V.2.5.1 Thao tác ly trích RNA 67 V.2.5.2 Hoà tan RNA 68 V.2.6 Qui trình khuếch đại 68 Hình 3.1 Hiện tượng tủa với hình thành mạng lưới cân Việc hình thành mạng lưới kết tủa phải có nhiều điều kiện sau: - Kháng thể phải có hai hóa trị - Kháng nguyên đa hóa trị - Kháng nguyên phải hịa tan thành phần mơi trường lực ion hay pH có vai trị định việc làm xảy tượng kết tủa - Các kháng thể IgG có chứa 3% glucid chất gây tủa tốt nhất, kháng thể IgM chứa tới 10% nên dễ hịa tan kết tủa - Các phức hợp kháng nguyên-kháng thể to dễ kết tủa III.1.2 Ứng dụng Kỹ thuật miễn dịch khuếch tán kỹ thuật đơn giản giúp phát kháng nguyên mẫu huyết hay huyết tương cách định tính hay định lượng III.1.3 Mẫu phân tích Mẫu huyết hay huyết tương III.1.4 Các dạng khuếch tán miễn dịch III.1.4.1 Kết tủa môi trường lỏng Phương pháp Heideiberger Kendall Phương pháp cho phép định lượng phản ứng miễn dịch, đến cịn dùng để giải thích tượng tủa xuất khơng, thay đổi tỷ lệ nồng độ tương đối kháng thể kháng nguyên Trong loạt ống thí nghiệm, cho lượng kháng thể không thay đổi Sau cho vào kháng nguyên với nồng độ tăng dần Kết tượng kết tủa tăng dần từ ống đầu sau giảm (hình 3.2) Nếu đem ly tâm lấy tủa định lượng nitrogen tủa ống Nếu kháng ngun khơng phải protein lượng nitrogen tủa tỷ lệ với lượng kháng thể bị tủa Nếu lấy ống có tủa nhiều xác định lượng kháng thể có huyết ống 95% kháng thể bị tủa Hơn nữa, biết lượng kháng nguyên cho vào ống trọng lượng phân tử riêng kháng ngun kháng thể người ta tính cơng thức phức hợp Sau ly tâm tách tủa, lấy nước mặt cho thêm kháng nguyên vào ống đầu kháng thể vào ống cuối có tủa thêm Điều cho phép xác định khu vực: - Trong ống đầu khu vực thừa kháng thể, nơi mà thiếu kháng nguyên nên ngăn không cho kết tủa hết kháng thể - Trong ống cuối khu vực thừa kháng nguyên nên khơng cho phép hình thành mạng lưới chiều - Những ống gần nơi tủa tối đa tương ứng với khu vực tương đương kháng nguyên kháng thể có tỉ lệ nồng độ tối ưu cho phép tủa gần hết phân tử kháng thể kháng ngun Hình 3.2 Hiện tượng tủa mơi trường lỏng Định lượng đo độ đục Dùng tia sáng mạnh đơn sắc cho qua ống nghiệm có trộn kháng nguyên với kháng huyết tương ứng Tia sáng bị khuếch xạ mạnh tủa nhiều Việc định lượng tiến hành vùng có thừa kháng thể nhờ việc đọc độ cản quang so sánh với đường chuẩn Việc sử dụng tia laser cho phép việc định lượng có giá trị cao Kỹ thuật có nhiều ứng dụng việc định lượng kháng nguyên khác mà nồng độ môi trường sinh học khoảng mg/l IgG, IgA, IgM…và việc tìm kháng kháng thể III.1.4.2 Tủa môi trường gel Nguyên lý Kháng thể kháng nguyên khuếch tán thạch (gel) gặp gây tủa, tủa khơng di chuyển lên trông thấy mắt thường nhuộm Miễn dịch khuếch tán kép (kỹ thuật Ouchterlony) Trong lớp thạch không dày, đục thủng suốt lỗ cách nhau, khoảng cách phụ thuộc vào hệ số khuếch tán chất phản ứng Rồi nhỏ vào lỗ đối diện với dung dịch kháng nguyên kháng thể Thời gian xuất đường cung tủa hai ngày đến tuần Hình 3.3 Khuếch tán kép (kỹ thuật Ouchterlony) Kỹ thuật dù nhạy cho phép phân tích hệ thống kháng nguyên- kháng thể Muốn so sánh hai kháng nguyên hay để phát có mặt nhiều kháng thể huyết bố trí hai lơ kháng ngun trước lỗ có chứa huyết Kết có thể: (i) Phản ứng giống hệt hai kháng nguyên y hệt hay có epitop tương tự đường kết tủa với kháng thể nối liền nhau; (ii) Phản ứng không y hệt hai kháng nguyên khác kết hợp riêng với hai kháng thể hai đường kết tủa cắt chéo (iii) Phản ứng giống phần hai kháng nguyên có epitop epitop riêng khác kháng thể tương ứng cho đường tủa chung liền với đường tủa phụ gắn với đường tủa trước kháng nguyên thứ hai (hình 3.3) Ngược lại, dùng kỹ thuật để so sánh với hai kháng huyết gây tủa để xem chúng có nhận biết kháng nguyên hay không Kỹ thuật hay dùng để phát kháng thể chống nhân người so với huyết chuẩn Miễn dịch khuếch tán vòng (kỹ thuật Mancini) Kỹ thuật dùng để định lượng kháng nguyên Kháng thể đặc hiệu hòa vào thạch trước đổ dãy thạch lên kính hay hộp petri Sau đó, đục lỗ cho vào dung dịch kháng nguyên có độ pha loãng khác Kháng nguyên khuếch tán gặp kháng thể thạch tạo nên vòng kết tủa mà bề mặt tỉ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên Việc định lượng suy từ đường biểu diễn chuẩn lập từ nồng độ biết kháng nguyên III.1.4.3 Miễn dịch khuếch tán điện Miễn dịch khuếch tán điện đơn (kỹ thuật Laurell) Xuất phát từ nguyên lý kỹ thuật khuếch tán vòng, kỹ thuật khác chỗ di chuyển kháng nguyên định lượng thực điện trường Do vùng kết tủa có hình tên lửa (cịn gọi điện di tên lửa) (hình 3.4) Chiều dài hình tên lửa tỷ lệ với nồng độ kháng nguyên Kỹ thuật nhạy kỹ thuật Mancini dùng nhiều chất phản ứng Hình 3.4 Khuếch tán điện: 1,2,3 mẫu chuẩn; x: mẫu Miễn dịch điện di (kỹ thuật Grabar Williams) Khi dung dịch định phân tích có chứa nhiều kháng ngun khuếch tán kép khơng đủ để xác định đường kết tủa Miễn dịch điện di bổ sung thiếu sót cách tách trước kháng nguyên theo tốc độ di chuyển chúng điện trường gây tủa kháng huyết đặc hiệu rải rãnh đào sẵn dọc theo chiều điện di Các đường tủa xuất theo hình thức cung hai bên rãnh Kỹ thuật chủ yếu dùng để định tính, cho phép đánh giá có tượng tủa hay khơng so với đối chứng Đây kỹ thuật tốt để xác định Ig đơn dòng tạo cung tủa dày hơn, cong gần rãnh đồng thời nối liền với cung tủa Ig huyết lớp III.1.4.4 Miễn dịch khuếch tán: Điện di với miễn dịch khuếch tán in situ Trong kỹ thuật dịch sinh học định nghiên cứu cho chạy điện di trước, sau cho tác dụng kháng thể đặc hiệu lớp thạch để hình thành kết tủa kháng nguyên- kháng thể Như vậy, thành phần hỗn hơp phức tạp huyết tách bằn điện di thạch Sau đó, phân tử khác định nghiên cứu tủa cách chọn lọc kháng huyết đặc hiệu với ptotein di chuyển bề mặt thạch Kháng thể nhanh chóng thấm vào bên gel thạch kết tủa chỗ kháng nguyên tương ứng Những phân tử không bị kết tủa rửa hết Từ đó, dễ dàng nhuộm phức hợp kháng nguyên- kháng thể cho hình ảnh xác tình trạng phân bố kháng nguyên sau điện di Kỹ thuật nhanh nhạy kỹ thuật điện di để chuẩn đốn bất thường đơn dịng Ig Nó có lợi kháng ngun khơng có thời gian để khuếch tán trước bị kết tủa kháng thể Tính thành phần đơn dịng có lượng thấp bảo tồn kỹ thuật Sau việc giải thích hình ảnh thu dễ dàng kỹ thuật miễn dịch điện di III.1.5 Ưu nhược điểm phương pháp III.1.5.1 Ư u ểm: Kỹ thuật đơn giản III.1.5.2 Nhược điểm: Kháng nguyên muốn phát phải dạng hòa tan khuếch tán Mặt khác phương pháp có tính nhạy khơng cao III.2 PHƯƠNG PHÁP NGƯNG KẾT MIỄN DỊCH III.2.1 Nguyên lý Hiện tượng ngưng kết chế hình thành mạng lưới kháng nguyên kháng thể cho phép lượng hạt sáp lại với để hình thành đám ngưng kết đủ to để mắt thường nhìn thấy Mạng lưới xuất với kháng thể có hai hóa trị IgM với đến 10 vị trí kết hợp nên có khả ngưng kết mạnh IgG Nói chung kháng nguyên hữu hình đa hóa trị khơng bị hạn chế Ở phản ứng ngưng kết miễn dịch đòi hỏi kháng nguyên hữu hình Đó kháng ngun có kích thước lớn hồng cầu tế bào vi sinh vật Kháng nguyên hữu hình có epitop bề mặt liên kết chéo với kháng thể tạo thành cụm nhìn thấy mắt thường Kháng thể phản ứng gọi kháng thể gây ngưng kết Phản ứng ngưng kết nhạy phản ứng kết tủa nên dùng để định tính bán định lượng kháng thể huyết Cơ sở lí hóa phản ứng ngưng kết: hỗn hợp bao gồm tiểu phần lơ lửng dung môi Các tiểu phần giữ trạng thái III.2.2 Xếp loại phản ứng ngưng kết Người ta phân biệt thành ngưng kết chủ động hay trực tiếp hạt hữu hình có mang sẵn nhóm định kháng nguyên đặc hiệu hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, tinh trùng, vi khuẩn ngưng kết thụ động hạt chất trơ làm giá đỡ cho định kháng nguyên hòa tan gắn cách nhân tạo lên bề mặt nó, thường dùng hồng cầu xử lý formol III.2.2.1 Ngưng kết trực tiếp: Cho hạt hữu hình có mang sẵn nhóm định kháng ngun tiếp xúc với kháng thể nồng độ pha loãng khác Các kháng thể kết hợp với kháng nguyên gắn hạt dẫn đến hình thành mạng lưới ngưng kết III.2.2.2 Ngưng kết gián tiếp: Kháng nguyên hòa tan cố định hạt khác tùy theo typ phản ứng, sau hỗn hợp hạt cho tiếp xúc với huyết điều kiện ngưng kết trực tiếp III.2.2.3 Ngưng kết nhân tạo: Khi kháng thể không phát huy tác dụng hai vị trí trên, nghĩa tượng kết hợp kháng nguyên kháng thể có xảy mà có tượng ngưng kết Coombs cho thêm kháng thể anti-globulin tạo cầu nối globulin miễn dịch có sẵn hạt theo hai hình thức sau: test coombs trực tiếp thử hồng cầu có gắn sẵn cách tự nhiên kháng thể không gây ngưng kết, cho thêm kháng thể anti-globulin vào gây ngưng kết; Test Coombs gián tiếp test huyết cho phép tìm xem huyết có hay khơng có kháng thể chống hồng cầu khơng gây ngưng kết Đầu tiên, ủ huyết với loại hồng cầu biết rõ nhóm Sau đó, rửa hồng cầu bám kháng thể huyết thêm kháng thể antiglubolin có ngưng kết có nghĩa có kháng thể định tìm (hình 3.5) Hình 3.5 Phương pháp test coombs trực tiếp vá gián tiếp III.2.3 Ứng dụng Phát kháng nguyên đánh giá tương tác kháng thể với kháng nguyên dạng hạt Có dạng thường gặp: - Ức chế ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination inhibition-HI): đánh giá tương tác kháng thể với vi-rút có chứa protein ngưng kết hồng cầu - Ngưng kết vi khuẩn (Bacterial agglutination): xác định kháng thể huyết tạo để chống lại nhiễm khuẩn - Ức chế ngưng kết (Agglutination inhibition): phát lượng nhỏ kháng thể chống lại tác nhân gây bệnh III.2.4 Mẫu phân tích Mẫu huyết tương hay huyết III.2.5 Ưu nhược điểm phương pháp III.2.5.1 Ư u ểm: Kỹ thuật đơn giản III.2.5.2 Nhược điểm: Kháng nguyên mầm bệnh muốn phát phải dạng hạt Mặt khác phương pháp có tính nhạy khơng cao III.3 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG III.3.1 Nguyên lý Trong kỹ thuật kháng thể đánh dấu thuốc nhuộm huỳnh quang Kỹ thuật dựa tính chất thuốc nhuộm kích thích xạ có bước sóng đặc hiệu phát sáng Chẳng hạn fluorescein phát huỳnh quang màu vàng lục, rodamin phát quang màu đỏ da cam Kháng thể gắn thuốc nhuộm huỳnh quang gọi kháng thể đánh dấu kháng thể huỳnh quang III.3.2 Phương pháp III.3.2.1 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp Kỹ thuật có hai thành phần: Kháng nguyên kháng thể, tạo hai lớp phản ứng Một hai thành phần gắn trực tiếp với thuốc nhuộm huỳnh quang Đầu tiên người ta cố định vi khuẩn lam kính sau phủ kháng thể huỳnh quang lên để kháng thể gắn với tế bào vi khuẩn Rửa loại bỏ kháng thể thừa quan sát kính hiển vi huỳnh quang Chỉ có vi khuẩn đặc hiệu với kháng thể huỳnh quang quan sát (hình 3.6) Hình 3.6 Kháng thể huỳnh quang kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp III.3.2.2 Kỹ thuật miễn dịch huỳng quang gián tiếp Kỹ thuật hai thành phần kháng nguyên kháng thể đặc hiệu tạo hai lớp phản ứng cịn có thành phần gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang, tạo lớp thứ ba kháng- kháng thể (hình 3.7) III.3.3 Ứng dụng Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang sử dụng để phát kháng nguyên mầm bệnh chuyên biệt mô hay tế bào bị nhiễm bệnh Phương pháp tương tự kỹ thuật IHC, cho phép việc phát kháng nguyên qua kết hợp đặc hiệu với kháng thể có đánh dấu huỳnh quang III.3.4 Mẫu phân tích Mẫu phân tích mẫu mơ, mẫu tế bào, huyết Các mẫu lưu trữ cách đông lạnh, làm khô hay cố định dung dịch cố định thích hợp III.3.5 Ưu nhược điểm phương pháp III.3.5.1 Ưu điểm: Có tính nhạy cao thao tác nhanh để phát định dạng mầm bệnh mẫu kính phết, mơ hay tế bào III.3.5.2 Nhược điểm: Đòi hỏi phải sử dụng kháng thể huỳnh quang kháng huyết Việc đọc kết đòi hỏi kỹ kinh nghiệm người thực việc chẩn đoán để phân biệt trường hợp dương tính giả âm tính giả Phản ứng chéo kháng thể với kháng nguyên xảy kháng thể sử dụng phải có tính chun biệt cao Hình 3.7 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp III.4 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH LIÊN KẾT ENZYM III.4.1 Nguyên lý Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym (ELISA-Enzyme- Linked Immunosorbent Assay) kỹ thuật nhạy đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên kháng thể nồng độ thấp (khoảng 0,1 ng/ml) So với kỹ thuật phóng xạ kỹ thuật rẻ tiền an tồn mà xác Nguyên tắc kỹ thuật ELISA giống kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, thay kháng thể gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang người ta gắn kháng thể với enzym Khi cho thêm chất thích hợp vào phản ứng, enzym thủy phân chất thành chất có màu Sự xuất màu chứng tỏ xảy phản ứng đặc hiệu kháng nguyên với kháng thể, thông qua cường độ màu người ta biết nồng độ kháng nguyên cần phát Kỹ thuật ELISA chia làm hai dạng ELISA trực tiếp ELISA gián tiếp Các enzym thường dùng kỹ thuật ELISA -galactoxidaza, glucooxidaza, peroxidazza phophadaza kiềm ELISA dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh vi-rút, vi khuẩn, nấm, kí sinh trùng III.4.2 Ứng dụng ELISA sử dụng để đánh giá tiếp xúc mẫu bệnh phẩm với tác nhân gây bệnh khác vi khuẩn, vi-rút, ký sinh trùng Kháng nguyên làm tinh hàm lượng kháng thể sử dụng hàm lượng kháng nguyên xác định III.4.3 Mẫu phân tích Huyết hay huyết tương III.4.4 Phương pháp Hàm lượng kháng thể sử dụng để kết hợp với kháng nguyên mầm bệnh xác định biểu đồ hàm lượng kháng thể chuẩn Kết đọc hàm lượng kháng thể III.4.4.1 Kỹ thuật ELISA gián tiếp Thường dùng để định tính định lượng kháng nguyên - Nhỏ huyết có kháng thể (ví dụ antitoxin) vào giếng bảng nhựa kháng thể bám vào thành giếng - Nhỏ tiếp dịch kháng nguyên cần xét nghiệm (ví dụ toxin) Nếu kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể gắn với kháng thể - Thêm cộng hợp gắn enzym vào giếng kháng thể cộng gắn với kháng nguyên mà trước gắn với kháng thể đầu tiên, tạo nên “bánh mì kẹp chả” kháng thể- kháng nguyên- kháng thể gắn enzym (hình 3.8a) - Bổ sung chất enzym Enzym thủy phân chất làm thay đổi màu dung dịch Tốc độ thủy phân enzym tỉ lệ thuận với lượng kháng thể gắn enzim, có nghĩa tỉ lệ thuận với kháng nguyên cần xét nghiệm Sự thay đổi màu dung dịch nhìn thấy mắt thường đo quang phổ kế Hình 3.8 Kỹ thuật ELISA: (a) ELISA gián tiếp; (b) ELISA trực tiếp (KT: kháng thể; KN: kháng nguyên; S: chất) III.4.4.2 Kỹ thuật ELISA trực tiếp Thường dùng để định tính định lượng kháng thể - Nhỏ dịch kháng nguyên cho hấp thụ lên thành giếng - Nhỏ tiếp kháng huyết (chứa kháng thể) cần xét nghiệm ủ Nếu huyết có chứa kháng thể đặc hiệu gắn với - Thêm cộng hợp kháng- kháng thể gắn enzym Kháng thể tạo thành để khống chế kháng thể người - Thêm chất enzym Tốc độ thủy phân chất gắn liền với thay đổi màu dung dịch tỉ lệ thuận với lượng kháng thể cần xác định mẫu Sự thay đổi màu quan sát mắt thường hay quang phổ kế (hình 3.8b) III.4.5 Ưu nhược điểm phương pháp III.4.5.1 Ưu điểm: Phương pháp ELISA phương pháp nhạy dễ thực Có thể xét nghiệm lúc nhiều mẫu bệnh phẩm, thời gian thực ngắn nên xem phương pháp vàng sàng lọc/phát bệnh III.4.5.2 Nhược điểm: Cần phải có kháng thể đơn dịng hay đa dòng phù hợp với kháng nguyên mầm bệnh cần xét nghiệm 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Tạ Hoàng Bảnh Nguyễn Kim Kha (2012) Bài giảng Quản lý dịch bệnh thủy sản - Khoa Nông nghiệp – Thủy sản, Trường Cao Đẳng Cộng Đồng Đồng Tháp Từ Thanh Dung, Đặng Thị hoàng Oanh Trần Thị Tuyết Hoa (2005) Bệnh học Thủy sản Đại học Cần Thơ Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng Nguyễn Thị Muội (2004) Bệnh học thủy sản Khoa nuôi trồng thủy sản- Trường đại học thủy sản Nha Trang Đỗ Thị Hòa, Võ Khả Tâm, Phan Văn Út, Nguyễn Ngọc Tú (2002) Ngiên cứu bệnh đốm trắng virus (WSBV) tôm sú Penaeus Monodon Khánh Hòa thử nghiệm biện pháp phòng bệnh Đại học Nha Trang Bùi Kim Tùng (2001) Thuốc kháng sinh Sở Khoa Học Công nghệ Môi trường tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Bùi Quang Tề (2003) Bệnh tơm ni biện pháp phịng trị Nhà xuất nông nghiệp Hà Nội Huỳnh Chí Thanh Tạ Hồng Bảnh (2013) Bài giảng Thuốc hóa chất dung ni trồng thủy sản Khoa Nông nghiệp – Thủy sản, Trường Cao Đẳng Cộng Đồng Đồng Tháp Hướng dẫn chẩn đoán bệnh động vật thủy sản Châu Á (2005) Tài liệu FAO 402/2 Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Quốc Thịnh Nguyễn Thị Kim Liên (2005) Bài giảng thuốc hóa chất ni trồng thủy sản Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Tiếng Anh Brown, L (1993) Aquaculture for veterinarinus fish husbandry and medicine - Oxford, NewYork, Seoul, Tokyo Valerie Inglis, Ronald J Roberts and Niall R Bromage (2001) Bacteria disease of fish Institute of Aquaculture University of Stirling http://www.vietlinh.com.vn/library/aquaculture shrimp/tombenhphatsang.asp Cập nhật ngày 01/11/2012, từ khóa: bệnh tơm, bệnh phát sáng) 47 Oanh D T.H., N T Phuong 2005 Prevalance of white spot syndrome virus (WSSV) and Monodon baculovirus infection in monodon penaeus postlarvee in Vietnam 48 ... THIỆU Giáo trình mơ đun GIẢI PHẪU BỆNH LÝ ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN trình bày từ kiến thức đến chuyên sâu vấn đề quản lý dịch bệnh thủy sản Giới thiệu cho sinh viên biết khái niệm bệnh động vật thủy sản, ... sinh viên kiến thức bệnh động vật thuỷ sản, biện pháp phòng ngừa tổng hợp, nghiên cứu bệnh động vật thuỷ sản như: bệnh vi khuẩn, bệnh virus, bệnh nấm ký sinh trùng, bệnh phi sinh vật - Về kỹ năng:... đun trình bày chi tiết bệnh thường gặp động vật thủy sản bệnh virus, bệnh vi khuẩn, bệnh ký sinh trùng bệnh yếu tố sinh vật gây Các phương pháp phòng điều trị bệnh thường gặp dộng vật thủy sản