Luận văn thạc sĩ VNUA nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng với bệnh nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm linh chi (ganoderma SP ) trong điều kiện in vitro

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ KIỀU LAN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG VỚI BỆNH NẤM MỐC XANH GÂY BỆNH TRÊN NẤM LINH CHI (GANODERMA SP.) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Xuân Cảnh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khoá luận trung thực chưa sử dụng công bố Em xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khoá luận cảm ơn thơng tin trích dẫn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Kiều Lan i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Sau thời gian làm đề tài tốt nghiệp Bộ môn Công nghệ vi sinh, giúp đỡ dìu dắt tận tình thầy giáo, cán phịng thí nghiệm Bộ môn, cố gắng nỗ lực học tập thân, em hoàn thành luận văn tốt nghiệp Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học tồn thể thầy giáo truyền đạt cho em kiến thức vơ bổ ích quý báu suốt thời gian học tập, rèn luyện thực luận văn tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Cảnh – giảng viên khoa Công nghệ sinh học định hướng đề tài tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình làm luận văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ vi sinh, toàn thể anh, chị, bạn bè em thực tập nghiên cứu phịng thí nghiệm giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian thực luận văn tốt nghiệp Và cuối cùng, với tất lịng kính trọng biết ơn vô hạn, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ người thân em nuôi nấng, động viên tạo động lực cho em suốt trình học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Kiều Lan ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng v Danh mục hình vi Danh mục chữ viết tắt vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Yêu cầu đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Nấm Linh Chi 2.1.1 Nguồn gốc phân bố 2.1.2 Tình hình trồng nấm Linh chi 2.1.3 Vị trí phân loại đặc điểm sinh học 2.1.4 Các bệnh thường gặp trồng Linh chi 2.1.5 Ứng dụng vi sinh vật vào đối kháng bệnh hại thực vật 14 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 17 3.1 Vật liệu nghiên cứu 17 3.1.1 Nguyên liệu địa điểm nghiên cứu 17 3.1.2 Thiết bị hóa chất 17 3.1.2 Môi trường 18 3.2 Phương pháp nghiên cứu 20 3.2.1 Phương pháp thu nhận phân lập mẫu 20 3.2.2 Phương pháp nuôi cấy, làm 20 3.2.3 Phương pháp giữ giống 20 3.2.4 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo 21 3.2.5 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học 21 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.2.6 Phương pháp định loại nấm sợi ( Nguyễn Lân Dũng, 2006) 22 3.2.7 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 24 3.2.8 Vi sinh vật 26 Phần Kết thảo luận 29 4.1 Kết phân lập xác định chủng nấm mốc xanh gây bệnh nấm linh chi 29 4.1.1 Kết phân lập 29 4.1.2 Kết lây nhiễm nhân tạo nấm linh chi 30 4.1.3 Định danh chủng nấm LC1 32 4.1.4 Kết xác định khả sinh enzyme ngoại bào chủng LC1 34 4.1.5 Kết đánh giá ảnh hưởng yếu tố đến sinh trưởng nấm LC1 35 4.2 Kết tuyển chọn nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật có khả đối kháng với nấm lc1 gây bệnh nấm linh chi điều kiện in vitro 38 4.2.1 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả đối kháng với nấm LC1 38 4.2.2 Đặc điểm hình thái chủng vi sinh vật tuyển chọn 41 4.2.3 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 44 4.3 Đánh giá khả đối kháng với nấm mốc xanh chủng vi sinh vật tuyển chọn trực tiếp linh chi bị nhiễm bệnh 52 4.4 Thảo luận 54 4.4.1 Phân lập nghiên cứu nấm mốc xanh gây bệnh nấm Linh chi 54 4.4.2 Tuyển chọn vi sinh vật đối kháng với nấm mốc xanh gây bệnh nấm Linh chi 55 Phần Kết luận kiến nghị 57 5.1 Kết luận 57 5.2 Kiến nghị 57 Tài liệu tham khảo 58 Phụ lục 61 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Kết phân lập nấm nấm mốc gây bệnh 29 Bảng 4.2 Kết quan sát nấm LC1 gây bệnh kính hiển vi 32 Bảng 4.3 Hoạt tính đối kháng chủng xạ khuẩn với nấm mốc xanh gây bệnh nấm Linh chi phương pháp khuếch tán đĩa thạch 40 Bảng 4.4 Hoạt tính đối kháng chủng vi khuẩn với nấm mốc xanh gây bệnh nấm Linh chi phương pháp khuếch tán đĩa thạch 41 Bảng 4.5 Một số đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn 116 sau ngày nuôi 30oC 44 Bảng 4.6 Khả sử dụng nguồn cacbon khác chủng xạ khuẩn 116 46 Bảng 4.7 Khả sử dụng nguồn nitrogen khác chủng xạ khuẩn 116 49 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình thái giải phẫu thể nấm Linh chi Hình 2.2 Cấu tạo thành tế bào nấm Hình 4.1 Kết lây nhiễm nhân tạo 31 Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm PCR 33 Hình 4.3 Kết xây dựng phân loại cho chủng LC1 34 Hình 4.4 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm mốc LC1 35 Hình 4.5 Ảnh hưởng nguồn cacbon lên nấm mốc xanh 36 Hình 4.6 Ảnh hưởng pH tới nấm mốc xanh 37 Hình 4.7 Ảnh hưởng nhiệt độ lên nấm mốc xanh 38 Hình 4.8 Kết thử hoạt tính kháng nấm mốc xanh gây bệnh nấm Linh chi số chủng xạ khuẩn phương pháp khuếch tán đĩa thạch 39 Hình 4.9 Vi khuẩn đối kháng với nấm LC1 41 Hình 4.10 Hình thái, màu sắc khuẩn lạc chủng xạ khuẩn 116 môi trường ISP2 sau ngày nuôi cấy 30°C 42 Hình 4.11 Hình thái chuỗi bào tử hệ sợi khuẩn ty chủng xạ khuẩn 116 42 Hình 4.12 Hình thái, màu sắc chủng xạ khuẩn 116 nuôi cấy số môi trường 44 Hình 4.13 Hình thái, màu sắc khuẩn lạc Vi khuẩn môi trường LB sau ngày nuôi cấy 30°C 45 Hình 4.14 Hình thái bào tử chủng vi khuẩn 45 Hình 4.15 Khả sử dụng số nguồn cacbon chủng xạ khuẩn 116 48 Hình 4.16 Kết kiểm tra ảnh hưởng nồng độ muối đến sinh trưởng chủng xạ khuẩn 116 50 Hình 4.17 Kết kiểm tra ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng xạ khuẩn 116 51 Hình 4.18 Khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn 116 nhiệt độ,20,30,37, 40 50°C 53 Hình 4.19 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng vi khuẩn 53 Hình 4.20 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng vi khuẩn 54 Hình 4.21 Thử khả đối kháng xạ khuẩn 116 trực tiếp Linh chi bị nhiễm nấm mốc xanh 55 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CKS Chất kháng sinh MT Môi trường VSV Vi sinh vật KH& KT Khoa học kĩ thuật PDA Potato Dextro Agar vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Kiều Lan Tên luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng với nấm mốc xanh gây bệnh nấm Linh chi (Ganoderma sp.) điều kiện in vitro Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02.01 Tên sở đào tạo: Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Phân lập nghiên cứu nấm mốc xanh gây bệnh nấm Linh chi (Ganoderma sp.) Từ tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả đối kháng mạnh với nấm mốc xanh điều kiện in vitro Sau tiến hành thử khả đối kháng với nấm mốc xanh chủng vi sinh vật tuyển chọn trực tiếp nấm Linh chi bị nhiễm bệnh Phương pháp nghiên cứu: Tất thí nghiệm thực điều kiện in vitro với đầy đủ thiết bị, máy móc, hóa chất cần thiết phòng cách li, từ tháng 2-9/2017 Phương pháp phân lập, nuôi cấy, tái lây nhiễm nhân tạo, nghiên cứu ảnh hưởng đến sinh trưởng yếu tố môi trường, pH, nhiệt độ, khả sử dụng nguồn cacbon nấm mốc gây bệnh Phương pháp tách chiết DNA định danh chủng nấm gây bệnh Phương pháp hoạt hóa, ni cấy, thử khả đối kháng xạ khuẩn vi khuẩn với nấm mốc gây bệnh khuếch tán đĩa thạch Nghiên cứu ảnh hưởng tới sinh trưởng xạ khuẩn, vi khuẩn qua yếu tố: môi trường nuôi cấy, pH, nhiệt độ, khả sử dụng nguồn nitrogen, khả chịu muối Bố trí thí nghiệm nhằm đánh giá khả đối kháng vi sinh vật tuyển chọn điều kiện in vitro với nấm mốc xanh trực tiếp Linh chi Kết kết luận: Từ mẫu nấm Linh chi Ganoderma lucidum bị nhiễm bệnh, phân lập chủng nấm mốc xanh kí hiệu LC1 Tiến hành lây nhiễm nhân tạo thành cơng để khẳng tính gây bệnh nấm mốc xanh LC1 Qua nghiên cứu đặc điểm hình thái đặc điểm sinh học chủng LC1 cho thấy khuẩn lạc chủng LC1 có màu xanh, hệ sợi khí sinh, dễ phán tán bào tử Sinh trưởng tốt mơi trường có nguồn đường đa (lactose, saccarose, mantose), tốt môi trường chứa D-glucose Phát triển phổ nhiệt độ pH rộng, nhiệt độ tối ưu nằm khoảng 25-30oC pH tối ưu 5,5-6,5 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Qua phân tích đặc điểm sinh học kết hợp với kết định danh cho thấy chủng LC1 có quan hệ họ hàng gần gũi với loài Penicillium citrinum đặt tên cho chủng Penicillium citrinum LC1 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn 116 chủng vi khuẩn GL01, KCO3 đối kháng mạnh với nấm LC1 điều kiện in vitro Qua nghiên cứu đặc điểm hình thái đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn 116 có hệ sợi khí sinh phân nhánh, dạng thẳng, khơng có vách ngăn, chuỗi bào tử ngắn, bào tử hình bầu dục chúng tơi dự đoán chủng xạ khuẩn 116 thuộc chi Streptomyces Qua thí nghiệm đánh giá khả đối kháng chủng xạ khuẩn 116 với nấm mốc xanh trực tiếp nấm Linh chi bị nhiễm bệnh cho thấy chủng 116 giảm thiểu lây lan vết bệnh khơng thể diệt hồn tồn bệnh nấm mốc xanh Linh chi bị bệnh ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thể sống Trái Đất Nó thành phần tất amino axit, liên kết với protein, có mặt chất cấu thành nên acid nucleic ADN ARN Trong mơi trường ni cấy, nguồn nitrogen đóng vai trị thành phần nguyên liệu cho tổng hợp sản phẩm tế bào, hợp chất chứa nitrogen cịn giúp tế bào thực q trình trao đổi chất điều hịa q trình chuyển hóa Tuy nhiên, nguồn nitrogen có mặt nhiều hợp chất nguyên vật liệu khác khả mà sinh vật sử dụng nitrogen từ nguồn khác không giống Vậy để đánh giá khả sử dụng nitrogen chủng 116, tiến hành nuôi cấy chủng 116 môi trường Starch Nitrate với nguồn nitrogen NaNO3 thay nguồn khác như: Pepton; (NH4)2SO4; NH4Cl; NH4NO3 Môi trường Starch Nitrate không bổ sung NaNO3 xem đối chứng âm có bổ sung NaNO3 xem đối chứng dương Dựa mức đánh giá Nguyễn Lân Dũng (1972) để đánh giá khả sử dụng nitrogen theo mức sau: (+): Sinh trưởng mạnh đối chứng dương chút – Có khả sử dụng nguồn nitrogen (++): Sinh trưởng mạnh đối chứng dương nhiều – Sử dụng tốt nguồn nitrogen (-): Sinh trưởng đối chứng âm khơng mọc – Khơng có khả sử dụng nguồn nitrogen Khả sử dụng nguồn nitrogen thay đổi theo ngày nuôi cấy khác Quan sát khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn sau ngày nuôi cấy nhiệt độ 30°C Kết thể bảng sau: Bảng 4.7 Khả sử dụng nguồn nitrogen khác chủng xạ khuẩn 116 Nguồn nitrogen NH4Cl Pepton (NH4)2SO4 NH4NO3 Khả sử dụng + ++ ++ + Chú thích: (+): Có khả sử dụng nguồn nitrogen (++): Sử dụng tốt nguồn nitrogen (-): Khơng có khả sử dụng nguồn nitrogen 47 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Qua đây, thấy chủng xạ khuẩn 116 sử dụng tốt nguồn nitrogen từ nguồn vô NH4Cl hữu pepton Trong đó, nguồn nitrogen từ (NH4)2SO4 , pepton chủng xạ khuẩn 116 sinh trưởng tốt c Khả chịu muối chủng xạ khuẩn 116 Nồng độ muối ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển xạ khuẩn Để khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối, tiến hành nuôi cấy chủng 116 môi trường Gause-1 có bổ sung nồng độ muối NaCl từ 1% - 9% Quan sát kết sau ngày ni cấy Hình 4.16 Kết kiểm tra ảnh hưởng nồng độ muối đến sinh trưởng chủng xạ khuẩn 116 Kết cho thấy nồng độ muối có ảnh hưởng rõ rệt đến chủng xạ khuẩn 116, nồng độ muối tăng khả sinh trưởng chủng 116 có giảm dần Chủng xạ khuẩn 116 sinh trưởng mơi trường có nồng độ muối từ 1% - 6% sinh trưởng tốt nồng độ muối từ 1% - 4% d Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn 116 Nồng độ ion hydro có quan hệ chặt chẽ phát triển vi sinh vật Mỗi loại vi sinh vật có phạm vi pH khác pH số logarit âm nồng độ ion hydro pH = - logarit CH+ Các vi sinh vật sống đất, nước thích nghi với điều kiện biến động mạnh mẽ pH nên có phạm vi pH sinh trưởng rộng Trong vi khuẩn kí sinh sống điều kiện biến động thể vật chủ 48 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nên phạm vi pH sinh trưởng hẹp Mỗi loại vi sinh vật có giới hạn pH là: + pH thấp (pH thấp mà xạ khuẩn sinh trưởng được) + pH thích hợp (pH mà xạ khuẩn sinh trưởng tốt nhất) + pH cao (pH cao mà xạ khuẩn sinh trưởng được) Sự sinh trưởng, phát triển tổng hợp hợp chất xạ khuẩn ảnh hưởng nhiều pH môi trường, để điều chỉnh pH môi trường gọi trao đổi chất thích ứng Nghiên cứu ảnh hưởng này, tiến hành nuôi cấy 116 môi trường Gause-1 pH thay đổi từ – 10 Kết thể hình 4.17 sau: Hình 4.17 Kết kiểm tra ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng xạ khuẩn 116 49 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết cho thấy chủng xạ khuẩn 116 có khả sinh trưởng mơi trường có dải pH rộng từ - 10 tốt pH từ 8-10 e Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn 116 Các loài vi sinh vật khác bị ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ khác Cũng giống điều kiện pH mà chia thành giới hạn nhiệt độ: nhiệt độ thấp nhất, nhiệt độ thích hợp nhiệt độ cao Nhiệt độ yếu tố quan trọng tác động đến hoạt động sống tế bào đặc biệt khả sinh tổng hợp chất có hoạt tính sinh học Các lồi vi sinh vật khác có q trình sinh lý khác nhau, việc xác định nhiệt độ sinh trưởng tối ưu cho chúng cần thiết ni cấy Vì vậy, tơi tiến hành ni cấy chủng 116 môi trường Gause-1 để nhiệt độ khác nhau: 4oC, 20°C, 30°C, 37°C, 40°C 50°C Kết thể hình 4.18 sau: 4oC 20°C 30°C 37°C 50 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 40oC 50OC Hình 4.18 Khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn 116 nhiệt độ,20,30,37, 40 50°C Kết cho thấy chủng xạ khuẩn 116 sinh trưởng ngưỡng nhiệt độ từ 20°C - 50°C Và sinh trưởng tốt nhiệt độ từ 30°C - 40°C 4.2.3.2 Vi khuẩn a) Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng phát triển vi khuẩn Như trình bày ảnh hưởng pH đến sinh trưởng vi sinh vật nói chung phần trên, chúng tối tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH tới sinh trưởng vi khuẩn Nghiên cứu ảnh hưởng này, tiến hành nuôi cấy KCO3 GL01 môi trường LB pH thay đổi từ – 7.5, nuôi khuẩn ngày Kết thể hình 4.19 a b Hình 4.19 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng vi khuẩn (a) Vi khuẩn GL01; (b) Vi khuẩn KCO3 51 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết cho thấy chủng khuẩn phát triển tốt dải pH5-7.5 Phát triển mạnh khoảng pH5.5-6.5 b) Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng vi khuẩn Nhiệt độ yếu tố quan trọng đến phát triển vi khuẩn Các lồi vi sinh vật khác có q trình sinh lý khác nhau, việc xác định nhiệt độ sinh trưởng tối ưu cho chúng cần thiết ni cấy hay thí nghiệm lây nhiễm, đối kháng thực tiễn khác Vì vậy, tơi tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn KCO3 GL01 môi trường LB để nhiệt độ khác nhau: 13oC, 20°C, 27°C,31°C, 37°C, 40°C Và nuôi cấy ngày, quan sát thu kết quả: KCO3 13 20 27 31 37 40 GL01 Hình 4.20 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng vi khuẩn Vi khuẩn KCO3 GL01 phát triển mạnh khoảng nhiệt độ 2740oC , khó phát triển nhiệt độ thấp 4.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM MỐC XANH CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT ĐÃ TUYỂN CHỌN TRÊN TRỰC TIẾP CÂY LINH CHI ĐÃ BỊ NHIỄM BỆNH Sau lây nhiễm nấm mốc xanh lên nấm Linh chi để bị nhiễm bệnh nặng , chúng tơi tiến hành bố trí thí nghiệm thử khả đối kháng xạ khuẩn 116 trực tiếp Linh chi Thí nghiệm: Linh chi chia thành nhóm, nhóm 2cây (tất Linh chi bị nhiễm nấm) Nhóm 1: hàng ngày tưới 30ml/1cây dịch xạ khuẩn 116 nuôi lỏng lắc 52 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com sau ngày (giá trị OD=0,788) Nhóm 2: hàng ngày tưới nước Để nhóm Linh chi cách li Thí nghiệm lặp lại lần Quan sát ghi lại kết vịng 20 ngày Hình 4.21 Thử khả đối kháng xạ khuẩn 116 trực tiếp Linh chi bị nhiễm nấm mốc xanh Kết đợt lây nhiễm vào tháng thời tiết nắng nóng, nhiệt độ 30 C nấm Linh chi phát triển mạnh lấn át vết bệnh lây nhiễm khiến việc tiến hành đánh giá gặp khó khăn Tiếp tục lây nhiễm nấm đến đầu tháng nắng nóng giảm, mưa nhiều, thời tiết mát mẻ hơn, nhiệt độ dao động từ 25-30oC, Linh chi phát triển chậm lại cịn nấm mốc xanh mọc nhanh lan rộng tạo thành vết bệnh lớn quanh thể nấm Linh chi Tiến hành thí nghiệm thử khả đối kháng xạ khuẩn 116 Thu kết ngày đầu , vết bệnh nấm có dấu hiệu ngừng lan rộng , quan sát tiếp đến ngày 20 thấy đối chứng nấm bị lan rộng cịn tưới xạ khuẩn116 vết bệnh phát triển thêm Kết luận, xạ khuẩn 116 có khả ức chế vết bệnh nấm mốc xanh lan rộng Linh chi Tuy nhiên lí nấm Linh chi bị nhiễm bệnh nặng nên tưới dịch xạ khuẩn ngăn vết bệnh phát triển o hết hoàn toàn Do điều kiện thời tiết giao mùa miền Bắc, nhiệt độ giảm, mát mẻ , mưa nhiều, không thuận lợi cho trồng Linh chi vụ mới, Linh chi vụ trước già , việc sử dụng Linh chi non để lây nhiễm nấm mốc xanh tiến hành đánh giá khả đối kháng vi khuẩn KCO3, GL01 trực tiếp Linh chi bị nhiễm nấm LC1 gặp khó khăn Hơn thời gian thực hành 53 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com luận văn có hạn, chúng tơi khơng thể tiến hành đánh giá khả đối kháng với nấm mốc xanh vi khuẩn GL01 KCO3 trực tiếp Linh chi bị bệnh 4.4 THẢO LUẬN Nấm Linh chi, tên khoa học Ganoderma lucidum, biết đến rộng rãi dược liệu quý mà người từ xa xưa biết dùng làm thuốc Linh chi xếp vào loại siêu thượng phẩm nhân sâm, có tác dụng bảo can (bảo vệ gan), giải độc, cường tâm, kiện não (bổ óc), tiêu đờm, lợi niệu, ích vị (bổ dày); gần nhà khoa học Trung Quốc Nhật phát nấm linh chi cịn có tác dụng phịng chống ung thư, chống lão hóa làm tăng tuổi thọ Ở nước Đơng Nam Á, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan Việt Nam việc nghiên cứu, phát triển sử dụng Linh chi công nghiệp hóa với quy mơ rộng lớn, phân loại học, thu hái tự nhiên, nuôi trồng chủ động, chế biến bào chế dược phẩm, đồng thời nghiên cứu hóa dược hoạt chất, tác dụng dược lý Tuy nhiên, có nhiều bệnh làm giảm sản lượng chất lượng nấm, nghiêm trọng gây thất thu cho người trồng, đáng ý bệnh nấm mốc xanh Do cần phân lập nghiên cứu đặc điểm sinh học nấm mốc gây bệnh nấm Linh chi đồng thời tìm kiếm nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật có khả đối kháng với nấm mốc xanh làm sở để đưa giải pháp phòng chống bệnh 4.4.1 Phân lập nghiên cứu nấm mốc xanh gây bệnh nấm Linh chi Chúng tiến hành phân lập chủng nấm mốc xanh từ mẫu Linh chi bị nhiễm bệnh thu thập Sau phân lập thành cơng nấm mốc xanh kí hiệu LC1, tiến hành lây nhiễm nhân tạo nấm linh chi để khẳng định tính gây bệnh Dựa vào kết lây nhiễm nhân tạo, phân tích đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc Chúng tơi xác định chủng nấm mốc xanh thuộc chi nấm Penicillium, phù hợp với nghiên cứu Knee bone Merek (1959.Tiếp sau đó, tiến hành tách chiết DNA phục vụ cho phản ứng PCR để định danh cho kết tốt Gửi giải trình tự cơng ty 1st BASE (Singapore), sau nhận trình tự, tiến hành so sánh trình tự thu với trình tự khác ngân hàng gen nhờ công cụ blast, dựng phân loại lập từ kết thấy chủng nấm mốc LC1 nằm nhánh với chủng Penicillium citrinum với giá trị bootstrap 71 Bên cạnh kết trình tự nucleotide cho thấy mức độ tương đồng 54 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ITS rRNA hai chủng 92% Xét mặt giá trị tin cậy mức độ tương đồng hai chủng giống Ngồi đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa nghiên cứu, nhận thấy chủng nấm mốc LC1 có nhiều đặc điểm giống với chủng Penicillium citrinum ngân hàng gen Kết định danh cho phép đưa kết luận chủng LC1 có quan hệ họ hàng gần gũi với lồi Penicillium citrinum chúng tơi đặt tên cho chủng Penicillium citrinum LC1 Tiếp tục tiến hành ) đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào nấm LC1, nhỏ thuốc thử Lugol vào đĩa thử hoạt tính quan sát thấy vịng sáng xuất Điều chứng tỏ chủng nấm mốc LC1 có khả sinh enzyme ngoại bào phân giải chitin cellulose Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu Nguyễn Đức Lượng et al (2004), khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào chủng nấm mốc Nghiên cứu đặc điểm sinh học nấm mốc xanh, đánh giá yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng nấm LC1 kết luận nấm LC1 phát triển mạnh môi trường bổ sung đường đa (lactose, mantose, saccarose), mạnh môi trường D-glucose Dải pH nhiệt độ nấm LC1 rộng, sinh trưởng mạnh khoảng pH 5.5-6.5, nhiệt độ tối ưu 25-30oC Phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Lân Dũng ( 1967) Chính thế, vào thời điểm năm nhiệt độ hạ xuống mát mẻ, độ ẩm cao thuận lợi cho nấm mốc xanh phát triển lan rộng Người nuôi trồng Linh chi không giải vấn đề môi trường giá thể ni nấm mà cần chủ động có biện pháp phòng chống trước thời điểm bệnh nấm mốc xanh phát triển mạnh 4.4.2 Tuyển chọn vi sinh vật đối kháng với nấm mốc xanh gây bệnh nấm Linh chi Đã có nhiều biện pháp áp dụng để ngăn ngừa dịch bệnh sử dụng loại hóa chất, loại kháng sinh…Tuy nhiên, biện pháp không đem lại hiệu lâu dài mà gây hậu nghiêm trọng ô nhiễm môi trường, chất lượng nơng sản, sức khỏe người Cần có giải pháp vừa hiệu phòng chống bệnh hại vừa than thiện với môi trường người Người nuôi trồng dần hướng đến chế phẩm sinh học đáp ứng đầy đủ mong muốn va tiêu chí tiêu dung người trồng trọt Chúng tuyển chọn mẫu xạ khuẩn vi khuẩn có khả đối kháng với nấm mốc xanh gây bệnh Linh chi phương pháp khuếch tán 55 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đĩa Kết thu chủng xạ khuẩn 116 chủng vi khuẩn GL01, KCO3 có khả kháng lại nấm mốc xanh Chúng tơi tiến hành nghiên cứu đặc điểm hình thái đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng xạ khuẩn 116: có hệ sợi khí sinh phân nhánh, dạng thẳng, khơng có vách ngăn, chuỗi bào tử ngắn, bào tử hình bầu dục chúng tơi dự đốn chủng xạ khuẩn 116 thuộc chi Streptomyces Chủng 116 sinh trưởng tốt khoảng nhiệt độ 30-40oC , pH tối ưu 8-10 Vi khuẩn GL01, KCO3 phát riển tốt khoảng nhiệt độ cao 25-40oC , khoảng PH tối ưu 5,5-6,5 Sau bố trí thí nghiệm để đánh giá khả đối kháng xạ khuẩn 116 với nấm mốc xanh trực tiếp Linh chi bị nhiễm bệnh Chia thành nhóm Linh chi (tất bị nhiễm nấm mốc xanh), sau tiến hành thí nghiệm nhóm tưới dịch xạ khuẩn, cịn nhóm tưới nước để cách li nhóm Thí nghiệm lặp lại lần, kết cho thấy xạ khuẩn đối khánh mạnh với nấm mốc xanh điều kiện in vitro thí nghiệm trực tiếp Linh chi bị nhiễm bệnh xạ khuẩn 116 giảm thiểu lây lan vết bệnh nấm mốc nấm Linh chi khơng thể diệt hồn tồn nấm mốc xanh để trở bệnh Tuy nhiên vụ Linh chi, khơng có mẫu nấm Linh chi non để tiến hành bố trí thí nghiệm lây nhiễm nấm LC1 sau đánh giá khả đối kháng vi khuẩn GL01, KCO3 trực tiếp nấm Linh chi bị nhiễm bệnh với điều kiện thời gian làm luận văn khơng cho phép bố trí thí nghiệm cần nhiều thời gian đánh 56 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Phân lập chủng nấm mốc xanh từ mẫu nấm Linh chi Ganoderma lucidum bị nhiễm bệnh, kí hiệu LC1 Qua nghiên cứu đặc điểm hình thái đặc điểm sinh học chủng LC1 xác định nấm LC1 thuộc chi nấm Penicillium Qua phân tích đặc điểm sinh học kết hợp với kết định danh cho thấy chủng LC1 có quan hệ họ hàng gần gũi với lồi Penicillium citrinum chúng tơi đặt tên cho chủng Penicillium citrinum LC1 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn 116 chủng vi khuẩn GL01, KCO3 đối kháng với nấm LC1 điều kiện in vitro Qua nghiên cứu đặc điểm hình thái đặc điểm sinh học chúng tơi dự đốn chủng xạ khuẩn 116 thuộc chi Streptomyces Qua thí nghiệm đánh giá khả đối kháng chủng xạ khuẩn 116 với nấm mốc xanh trực tiếp nấm Linh chi bị nhiễm bệnh cho thấy chủng 116 giảm thiểu lây lan vết bệnh diệt hoàn toàn bệnh nấm mốc xanh Linh chi bị bệnh 5.2 KIẾN NGHỊ Nghiên cứu nên mở rộng ngồi phạm vi phịng thí nghiệm để đánh giá xác yếu tố ngoại cảnh tác động đến sinh trưởng nấm Linh chi bệnh nấm mốc xanh Tiến hành bố trí thí nghiệm đánh giá điều kiện in vitro in vivo với phương pháp nồng độ khác để thu kết tốt Trong phạm vi nghiên cứu đề tài hạn chế thời gian nghiên cứu số lương mẫu nấm Linh chi để bố trí nhiều thí nghiệm 57 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bản tin Khoa học cơng nghệ Số: 01/2017 PHỤC VỤ NƠNG NGHIỆP, NƠNG THƠN- Sở khoa học cơng nghệ tỉnh Quảng Trị Đặng Thị Hồng Oanh, 2008 Giáo trình vi sinh đại cương Khoa thủy sản Đại học Cần Thơ Hồ Thị Kim Thạch-Tình hình nhiễm bệnh số sở bào ngư linh chi2010- Tạp chí khoa học ứng dụng.(13) Lê Duy Thắng - Kỹ thuật trồng nấm – Tập - NXB Nông Nghiệp, 2005 Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, 2004 Công nghệ Enzyme Nhà xuất Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng, 2000 Vi Sinh Vật học Nhà xuất giáo dục Hà Nội Phạm Văn Kim, 2001 Giáo trình vi sinh đại cương Khoa Nông nghiệp, Đại học Cần thơ Tiếng Anh: Asai, K (1980) Miracle Cure Organic Germanium Japan: Japan Publications, pp 16-76 Boone, David R.; Castenholz, Richard W (May 18, 2001) [1984(Williams & Wilkins)] George M Garrity, ed The Archaea and the Deeply Branching and Phototrophic Bacteria Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (2nd ed.) New York: Springer p 721 ISBN 978-0-387-98771-2 British Library no GBA561951 10 Balch, W E., Fox, G E., Magrum, L J., Woese, C R., & Wolfe, R S (1979) Methanogens: reevaluation of a unique biological group Microbiological reviews, 43(2), 260 11 Boh, B (2013) Ganoderma lucidum: a potential for biotechnological production of anti-cancer and immunomodulatory drugs Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery, 8(3).pp 255-287 12 Carmen Sánchez (2016) Reactive oxygen species and antioxidant properties from mushrooms Synthetic and Systems Biotechnology Volume 2, Issue1,pp.13–22 58 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 13 Chiu, S W., Law, S C., Ching, M L., Cheung, K W., & Chen, M J (2000) Themes for mushroom exploitation in the 21st century: sustainability, waste management, and conservation The Journal of general and applied microbiology, 46(6).pp 269-282 14 Chen, A W., & Miles, P G (1996) Biomedical research and the application of mushroom nutriceuticals from Ganoderma lucidum Mushroom Biology and Mushroom Products.pp.161-175 15 Don J Brenner; Noel R Krieg; James T Staley (July 26, 2005) [1984(Williams & Wilkins)] George M Garrity, ed Introductory Essays Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 2A (2nd ed.) New York: Springer pp 304 ISBN 978-0387-24143-2 British Library no GBA561951 16 Hikino, H., Konno, C., Mirin, Y., & Hayashi, T (1985) Isolation and hypoglycemic activity of ganoderans A and B, glycans of Ganoderma lucidum fruit bodies Planta medica, 51(04).pp 339-340 17 Gao, Y., S Zhou, W Jiang, M Huang and X Dai (2003) Effects of ganopoly (a Ganoderma lucidum polysaccharide extract) on the immune functions in advanced-stage cancer patients Immunological Investigations, 32(3).pp.201-215 18 Gary E K ( 2002) Microbiology learning object 1: Introduction to microbiology, the prokaryotic cell (bacteria) and the eukaryotic cell 19 Gary E K (2002) Microbiology learning object 2: Fungi, protozoa, viruses, and the innate immune system 20 Kneebone, L R., & Merek, E L (1961) Brief outline of and controls for mushroom pathogens,indicator molds, and weed molds or competitors 21 Kenneth Todar, (2003) Major groups of prokaryotes Department of Bacteriology University of Wisconsin-Madison 22 Kenneth Todar, (2003) Structure and function of procaryotic cells Department of Bacteriology University of Wisconsin-Madison 23 Mitra, A., Santra, S C., & Mukherjee, J (2008) Distribution of actinomycetes, their antagonistic behaviour and the physico-chemical characteristics of the world’s largest tidal mangrove forest Applied microbiology and biotechnology, 80(4).pp 685-695 59 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 24 Madigan, M.T., Martinko, J.M and Parker, J (2002) Biology of Microorganisms Tenth edition, Prenhall 25 Mengjiao Li, Tianxi Chen, Tan Gao, Zhigang Miao, Ailiang Jiang, Liang Shi, Ang Ren, Mingwen Zhao, (2015) “UDP-glucose pyrophosphorylase influences polysaccharide synthesis, cell wall components, and hyphal branching in Ganoderma lucidum via regulation of the balance between glucose-1-phosphate and UDP-glucose”, Fungal Genetics and Biology, 82.pp 251–263 26 Montani M, Vaamonde G, Resnik SL, Buera P (1988) Temperature influence on Penicillium citrinum thom growth and citrinin accumulation kinetics Int J Food Microbiol pp.115-22 27 Pooja Kapoor and B.M Sharma, (2014) “Studies on different growth parameters of Ganoderma lucidum” International Journal of Science and Technology, Vol 3, No 4.pp.1515 – 1524 28 S Srivastava (2003) Bergey's Manuals, Understanding bacteria , Springer, pp 40 29 Visagie C.M., Houbraken J., Frisvad J.C., Hong S.-B., Klaassen C.H.W., Perrone G., Selfert K.A., Varga J., Yaguchi T., and Samson R.A (2014) “Indentification and nomenclature of the genus Penicillium”, Studies in Mycology, 78.pp 343–371 30 Wagner, R., Mitchell, D A., Lanzi Sassaki, G., Lopes de Almeida Amazonas, M A., & Berovič, M (2003) Current techniques for the cultivation of Ganoderma lucidum for the production of biomass, ganoderic acid and polysaccharides Food technology and biotechnology, 41(4).pp 371-382 60 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Khả sử dụng nguồn nitrogen chủng xạ khuẩn 116 61 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Kiều Lan Tên luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng với nấm mốc xanh gây bệnh nấm Linh chi (Ganoderma sp. ) điều kiện in vitro Ngành: Công nghệ sinh. .. vật có khả đối kháng mạnh với nấm mốc xanh  Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật đối kháng với nấm mốc xanh  Xác định khả đối kháng với nấm mốc xanh chủng vi sinh vật trực tiếp Linh. .. chọn nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật có khả đối kháng với nấm lc1 gây bệnh nấm linh chi điều kiện in vitro 38 4.2.1 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả đối kháng với nấm