Luận văn thạc sĩ HUS ứng dụng nuôi sinh khối vi tảo biển làm thức ăn cho ấu trùng trai ngọc tại vân đồn, quảng ninh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Hường ỨNG DỤNG NUÔI SINH KHỐI VI TẢO BIỂN LÀM THỨC ĂN CHO ẤU TRÙNG TRAI NGỌC TẠI VÂN ĐỒN, QUẢNG NINH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Hường ỨNG DỤNG NUÔI SINH KHỐI VI TẢO BIỂN LÀM THỨC ĂN CHO ẤU TRÙNG TRAI NGỌC TẠI VÂN ĐỒN, QUẢNG NINH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.Nguyễn Thị Hoài Hà Hà Nội – Năm 2012 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ Taq Taq (Thermus aquaticus) polymerases EPA Eicosapentaenoic acid AA Arachidonic acid DHA Docosahexaenoic acid PUFA Polyunsaturated fatty acid LA Linoleic acid DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid PCR Polymerase chain reaction MT F/2 Môi trường F/2 Omega3 (3) Omega6 () TB/ml Tế bào/ml LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Trai ngọc Pinctada [39] Hình 1.2 Bản đồ vùng đông bắc [41] 14 Hình 3.1 Hình dạng tế bào vi tảo Chaetoceros VĐ01 (×100) 27 Hình 3.2 Hình dạng tế bào vi tảo Chlorella VĐ02 (×100) 27 Hình 3.3 Hình dạng tế bào vi tảo Isochrysis VĐ03 (×100) 28 Hình 3.4 Hình dạng tế bào vi tảo Nannochloropsis VĐ04 (×100) 28 Hình 3.5 Hình dạng tế bào vi tảo Navicula VĐ05 (×100) 28 Hình 3.6 Hình dạng tế bào vi tảo Tetrselmis VĐ06 (×100) 29 Hình 3.7 Quan sát kính hiển vi giai đoạn ấu trùng trai ngọc ăn vi tảo (× 100) 32 Hình 3.8 Cây phả hệ Chaetoceros VĐ01 với lồi có quan hệ họ hàng gần 33 Hình 3.9 Cây phả hệ Chlorella VĐ02 với lồi có quan hệ họ hàng gần .34 Hình 3.10 Cây phả hệ Isochrysis VĐ03 lồi có quan hệ họ hàng gần 35 Hình 3.11 Cây phả hệ Nannochloropsis VĐ04 lồi có quan hệ họ hàng gần 36 Hình 3.12 Cây phả hệ Navicula VĐ05 lồi có quan hệ họ hàng gần .37 Hình 3.13 Cây phả hệ Tetraselmis VĐ06 lồi có quan hệ họ hàng gần 38 Hình 3.14 Thành phần acid béo loài vi tảo Chaetoceros calcitrans VĐ01, Chlorella vulgaris VĐ02, Isochrysis galbana VĐ03, Nannochloropsis oculata VĐ04, Navicula sp VĐ05 Tetraselmis chuii VĐ06 43 Hình 3.15 Sắc ký đồ thành phần acid béo vi tảo Chaetoceros VĐ01 .46 Hình 3.16 Sắc ký đồ thành phần acid béo vi tảo Chlorella VĐ02 47 Hình 3.17 Sắc ký đồ thành phần acid béo vi tảo Isochrysis VĐ03 47 Hình 3.18 Sắc ký đồ thành phần acid béo vi tảo Nannochloropsis VĐ04 48 Hình 3.19 Sắc ký đồ thành phần acid béo vi tảo Navicula VĐ05 48 Hình 3.20 Sắc ký đồ thành phần acid béo vi tảo Tetraselmis VĐ06 49 Hình 3.21 Động thái sinh trưởng chủng vi tảo độ mặn khác .52 Hình 3.22 Đường cong biến thiên Fv /Fm theo nhiệt độ loài vi tảo môi trường F/2 54 Hình 3.23 Quy trình ni cấy vi tảo biểntrong sản xuất giống trai ngọc 58 Hình 3.24 Nhân ni giống vi tảo cấp bình tam giác bình nhựa 2-5 lít 60 Hình 3.25 Nhân ni sinh khối vi tảo túi plastic 30-60 lít 61 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các loài vi tảo biển sử dụng làm thức ăn cho ấu trùng Pteria sterna [37] Bảng 1.2 Vi tảo biển thường đựơc sử dụng nuôi trồng thủy sản, chế độ ăn cá thể hay chế độ ăn chung (hỗn hợp) Bảng 3.1 Quan sát khả ăn tiêu hóa ấu trùng trai ngọc sau 30 Bảng 3.2 Khả ăn tiêu hóa vi tảo ấu trùng trai ngọc sau thời gian 1-2 sau lọc rửa ấu trùng theo thời gian sinh trưởng ấu trùng 30 Bảng 3.3 Thành phần acid béo loài vi tảo biển 40 Bảng 3.4 Khả sinh trưởng loài vi tảo nghiên cứu độ mặn (‰) khác 51 Bảng 3.5 Sự biến thiên Fv/Fm theo nhiệt độ lồi vi tảo mơi trường F/2 54 Bảng 3.6 Môi trường nuôi cấy F/2 64 Bảng 3.7 Thành phần dung dịch môi trường nuôi cấy 64 Bảng 3.8 Môi trường cho nhân nuôi sinh khối 65 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN .3 1.1 Giới thiệu trai ngọc .3 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm trai ngọc 1.1.3 Giá trị ngọc trai 1.1.4 Khả tiêu hóa vi tảo biển ấu trùng trai ngọc .5 1.2 Đặc điểm vi tảo biển ứng dụng nuôi trồng thủy sản .6 1.2.1 Đặc điểm chung vi tảo biển sử dụng nuôi trồng thủy sản 1.2.2 Đặc điểm dinh dưỡng vi tảo 1.3 Tình hình nghiên cứu vi tảo biển làm thức ăn cho ấu trùng nhuyễn thể nước nước 11 1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 11 1.3.2 Tình hình ni cấy trai ngọc nước 12 1.3.3 Tình hình ni trai ngọc huyệnVân Đồn, Quảng Ninh .14 Chương PHƯƠNG PHÁP 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu .17 2.3 Hóa chất 17 2.4 Máy móc dụng cụ 17 2.5 Môi trường nuôi cấy 18 2.6 Phương pháp phân lập vi tảo biển micropipette 18 2.7 Xác định khả tiêu hóa ăn vi tảo biển ấu trùng trai ngọc 19 2.8 Xác định trình tự gen mã hóa 18S rADN 19 2.8.1 Phương pháp tách chiết ADN 19 2.8.2 Nhân đoạn gen phản ứng PCR .20 2.8.3 Xác định trình tự gen máy tự động .22 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.9 Xác định thành phần acid béo 23 2.10 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng vi tảo biển 24 2.10.1 Ảnh hưởng độ mặn 24 2.10.2 Ảnh hưởng nhiệt độ .25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi tảo biển 27 3.2 Khả ăn tiêu hóa vi tảo ấu trùng trai ngọc .29 3.3 Phân tích giải trình tự 18S rADN chủng vi tảo biển 32 3.4 Thành phần acid béo loài vi tảo biển 39 3.5 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng chủng vi tảo biển 49 3.5.1 Ảnh hưởng độ mặn 49 3.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 53 3.6 Xây dựng hệ thống nuôi cấy vi tảo biển 56 3.6.1 Chuẩn bị trang thiết bị dự phòng sản xuất 56 3.6.2 Quy trình ni cấy vi tảo biển 59 3.6.3 Lựa chọn lồi vi tảo biển cho hệ thống ni .62 3.6.4 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi tảo 63 3.6.5 Xác định mật độ tế bào vi tảo biển 65 KẾT LUẬN 68 KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO .71 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỞ ĐẦU Nuôi trồng thủy sản ngành quan tâm phát triển hầu có bờ biển Với chiều dài 3200 km bờ biển, nghề nuôi trồng thủy sản nước ta chứa đầy tiềm mang lại lợi nhuận cho kinh tế quốc dân Trong năm gần đây, nhu cầu tiêu thụ thủy sản không ngừng tăng lên với quan tâm phủ, nghề nuôi trồng thủy sản nước ta phát triển mạnh mẽ Các sản phẩm từ thủy sản có giá trị kinh tế cao có ngọc trai- vật trang sức ưa chuộng từ lâu Từ xa xưa người biết thu hoạch ngọc trai biển dù trải qua nhiều kỷ, trai ngọc nguồn lợi vô to lớn Với tốc độ sản lượng khai thác lớn, liên tục, khơng có kế hoạch định hướng nên nguồn lợi hải sản sớm bị cạn kiệt Để đáp ứng đủ nhu cầu thương mại, ngành nuôi cấy trai ngọc cần số lượng lớn trai trưởng thành để lấy ngọc Vì vậy, việc sản xuất trai giống phương pháp nhân tạo trở thành mối quan tâm hàng đầu Trong đó, thức ăn yếu tố định tới chất lượng giống Một nguồn thức ăn quan trọng nuôi trồng thủy sản vi tảo biển Việc lựa chọn chủ động nguồn thức ăn tươi sống giàu dinh dưỡng từ vi tảo cho ấu trùng số lồi thủy sản cịn gặp nhiều khó khăn như: nguồn giống sinh khối cịn phụ thuộc vào điều kiện thu vớt tự nhiên nên không khiết, khó lưu trữ Các chủng vi tảo nguồn gốc ngoại nhập có quy trình ni khơng phù hợp với điều kiện Việt Nam, nên hiệu đem lại không cao, sinh khối đạt thấp, giống sơ cấp không chủ động, tính chống chịu cao khơng cao với nhiệt độ môi trường Từ yếu tố dẫn đến việc phân lập, định danh sử dụng vi tảo làm thức ăn tươi sống ương nuôi lồi thủy sản gặp khó khăn khơng đáp ứng nhu cầu thực tế Do đó, nghiên cứu đặc tính sinh học vi tảo ứng dụng chủng vi tảo vào nuôi giống thủy sản cần thiết Những loài vi tảo biển sử dụng làm thức ăn phải có tiêu chuẩn định kích cỡ, hàm lượng chất dinh dưỡng, hệ số tiêu hóa phù hợp với yêu cầu, khả nhận biết kích thước miệng ấu thể Cần LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com tìm kiếm phát triển nguồn thức ăn tự nhiên theo hướng giảm thiểu chi phí, chủ động với khối lượng lớn thời gian ngắn, đáp ứng nhu cầu sản xuất vấn đề quan tâm đặc biệt Muốn thực tốt điều cần có phối hợp quan nghiên cứu khoa học doanh nghiệp thủy sản nhằm đảm bảo nguồn thức ăn tươi sống chất lượng cho sản xuất giống Do đó, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ứng dụng nuôi sinh khối vi tảo biển làm thức ăn cho ấu trùng trai ngọc Vân Đồn, Quảng Ninh” Sự thành công đề tài góp phần mang lại hiệu kinh tế cao, quan trọng hơn, từ kết nghiên cứu này, chủ động giống góp phần phát triển sản xuất trai lấy ngọc có quy mơ lớn hạn chế việc khai thác tự nhiên bảo vệ nguồn lợi trai ngọc Vân Đồn, Quảng Ninh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 1- TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu trai ngọc 1.1.1 Phân loại Trai ngọc thuộc Ngành: Mollusca Lớp: Bivalvia Bộ: Pterioida Họ: Pteriidae Chi: Pinctada 1.1.2 Đặc điểm trai ngọc Hình 1.1 Trai ngọc Pinctada [39] Trai ngọc thuộc lớp vỏ hai mảnh, đầu bị tiêu giảm, chân hình lưỡi rìu màu vàng để di chuyển cát Vỏ gồm mảnh gắn lại với dây chằng, có hai khép mở bám mặt hoạt động theo nguyên lí cửa sổ Vỏ có lớp sừng bao bọc mặt ngồi, lớp đá vôi cuối lớp xà cừ Sau vỏ vạt áo Trai, đến hai mang nằm khoang áo chân, thân Trai ngọc sống vùng triều, lớn thường sống triều, có sâu 20 m nơi có dịng nước lưu chuyển đáy rạn san hô, sỏi, cát; độ cao; độ mặn ổn định khoảng 32-35‰ Chúng có chân tơ bám vào bờ đá, rạn san hô hay giá bám cứng Thường sống tập trung - 10 cá thể vật bám [8] LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nguồn giống cho nhân nuôi sinh khối quy mô lớn 3.6.2.3 Nhân nuôi sinh khối (khơng cần vơ trùng, sục khí liên tục) Khi giống cấp đạt tới pha sinh trưởng với mật độ tế bào khoảng 6-10 × 106/ml, vừa dùng làm giống cho cấy chuyển giai đoạn nhân nuôi giống cấp 1, lại nguồn giống cho nhân nuôi sinh khối hệ thống túi plastic 30-60 lít (hình 3.25) San cấy 1-2 lít giống từ bình giống cấp sang túi plastic 30-60 lít Ni cấy nhiệt độ 22-25°C, tăng cường chiếu sáng >4.000 Lux, sục khí liên tục định kỳ bổ sung khí CO2 Giai đoạn nuôi cấy mật độ đạt lớn × 106tế bào/ml, dùng làm thức ăn cho ấu trùng, giống, bố mẹ sinh sản cấy chuyển để tăng lượng giống cho nhân nuôi sinh khối quy mơ lớn từ 500-1000 lít Hình 3.25 Nhân nuôi sinh khối vi tảo túi plastic 30-60 lít Chú ý giảm thiểu tối đa lây nhiễm nuôi cấy, nhiên không tránh khỏi nhiễm khuẩn nuôi cấy Cần để ý tượng sau: bọt xuất bề mặt khối vi tảo nước trở nên đục tượng cho thấy nhân nuôi sinh khối vi tảo bị nhiễm nặng lượng sinh khối nên loại 61 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com bỏ Hệ thống thùng, bể nuôi cấy thiết bị sục khí làm chlorine, sau rửa kỹ lại nước cồn (75 - 85%) Nhân nuôi sinh khối thùng bể 500-1000 lít, thùng bể làm kỹ nước sau rửa chlorine 3.6.3 Lựa chọn lồi vi tảo biển cho hệ thống ni Vi tảo sử dụng làm thức ăn cho nuôi trồng thủy sản nói chung ngành động vật thân mềm nói riêng phải đáp ứng đầy đủ dinh dưỡng cho phát triển chúng Nuôi cấy vi tảo làm thức ăn cho ấu trùng, giống bố mẹ sinh sản trai ngọc yếu tố quan trọng trình sản xuất giống trai ngọc Rất nhiều lồi vi tảo sử dụng làm thức ăn cho chúng loài hỗ trợ tăng trưởng loài động vật thân mềm đặc biệt Bởi khác kích thước, khả tiêu hóa đặc biệt dinh dưỡng vi tảo Giá trị dinh dưỡng phụ thuộc chủ yếu vào thành phần sinh hóa vi tảo giá trị dinh dưỡng cần thiết cho chăn ni sản xuất giống trai ngọc Sáu lồi vi tảo thường sử dụng làm thức ăn tươi sống cho ấu trùng, giống bố mẹ sinh sản trai ngọc 3.6.3.1 Chaetoceros calcitrans VĐ01 Theo Volkman Chaetoceros calcitrans C muelleri loài vi tảo có giá trị dinh dưỡng tốt sử dụng rộng rãi cho trại sản xuất giống trai ngọc Chaetoceros calcitrans VĐ01 có chứa 12 loại acid béo không no đặc biệt chứa hàm lượng cao AA EPA Mặc dù Chaetoceros calcitrans VĐ01 khơng có khả chịu nhiệt độ cao, sinh trưởng phát triển khoảng nhiệt độ 25-28°C Vi tảo phù hợp kết hợp nuôi cấy với Isochrysis điều kiện nhiệt đới 3.6.3.2 Chlorella vulgaris VĐ02 Mặc dù giá trị dinh dưỡng vi tảo không cao loài vi tảo nghiên cứu Tuy nhiên Chlorella vulgaris VĐ02 chủng vi tảo dễ thích nghi điều kiện nhiệt độ chịu nhiệt độ lên tới 36°C, độ mặn với dải tối ưu tương đối rộng 15-35‰ 3.6.3.3 Isochrysis galbana VĐ03 Isochrysis loài vi tảo tốt sử dụng cho nuôi trồng thủy sản vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Isochrysis galbana VĐ03 cho thấy 62 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com tăng trưởng nhanh chóng 3-5 × 106 tế bào/ml sau 3-5 ngày nuôi cấy giai đoạn nhân giống cấp tồn khoảng thời gian dài mà trì mật độ cao pha suy tàn (6-9 × 106 tế bào/ml - 10 ngày) điều kiện chiếu sáng yếu, cho thấy loài khả kháng chịu nhiễm khuẩn Lồi coi loại thực phẩm thích hợp cho nuôi ấu trùng dài hạn Vi tảo có giá trị dinh dưỡng cao, đặc biệt chứa hai loại acid béo khơng bão hồ EPA DHA Sự kết hợp Isochrysis Chaetoceros spp sử dụng cho hoạt động sản xuất giống trai ngọc Úc 3.6.3.4 Nannochloropsis oculata VĐ04 Vê mặt giá trị dinh dưỡng vi tảo Nannochloropsis oculata VĐ04 loài đa dạng thành phần acid béo loài vi tảo nghiên cứu Sau 4-6 ngày nuôi cấy mật độ tế bào đạt tới 10-15 × 106/ml, pha suy tàn mật độ tế bào cao khoảng 8-12× 106/ml Lồi vi tảo chịu nhiệt độ lên tới 38°C, nhiên khả chịu mặn lại kém, nuôi cấy tốt môi trường với độ mặn 20‰ 3.6.3.5 Navicula sp VĐ05 Navicula gần giới thiệu sử dụng sản xuất ấu trùng trai ngọc vùng nhiệt đới cận nhiệt đới loài vi tảo silic thích hợp cho tạo vỏ ấu trùng Lồi có khả chịu nhiệt 32°C, độ mặn 30‰ Sự tăng trưởng ban đầu pha log vi tảo chậm sau 5-7 ngày mật độ đạt 2-3 × 106 tế bào/ml Nhưng sau tăng trưởng nhanh với mật độ tế bào 5-7 × 106/ml 3.6.3.6 Tetraselmis chuii VĐ06 Tetraselmis chuii VĐ06 chứa không nhiều loại acid béo, thành phần lại chứa hai loại acid béo khơng bão hịa AA DHA Lồi có khả thích nghi điều kiện nhiệt độ cao 38°C, độ mặn 35‰ Tuy giá trị sinh dưỡng khơng phải q cao lồi vi tảo thích hợp cho phát triển ấu trùng trai ngọc giai đoạn sau từ 10 ngày tuổi, kích thước lớn phù hợp với kích thước lỗ miệng ấu trùng, ấu trùng dễ bắt ăn vi tảo 3.6.4 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi tảo Môi trường F/2 Guillard môi trường phổ biến sử dụng cho nuôi cấy vi tảo làm thức ăn cho ấu trùng động vật thân mềm hai mảnh vỏ Môi trường 63 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com dinh dưỡng chứa thành phần dễ dàng sử dụng Có thể bảo quản nhiệt độ phòng thời gian dài cho nuôi cấy vi tảo để tiết kiệm thời gian đơn giản hóa việc chuẩn bị Tuy nhiên, tốt nên bảo quản lạnh 4°C Trong nghiên cứu, sử dụng mơi trường F/2 có thay đổi Bảng 3.6 Môi trường nuôi cấy F/2 Thành phần NaNO3 Hàm lượng Nhân giống gốc/Nhân giống cấp Nhân nuôi sinh khối 85 mg/l 50 g/l Na2HPO4.12H2O 10 mg/l g/l Na2SiO3.9H2O* F/2 metal** Vitamin B1 Vitamin B12 Biotin g/l 100ml 10-50 mg/l 0.1-0.2 mg/l 0.1-0.2 mg/l 12 mg/l ml 100 μg/l 0.5 μg/l 0.5 μg/l *Na2SiO3.9H2O bổ sung cho môi trường nuôi cấy tảo silic ** 100 ml F/2 metal bao gồm: Na2EDTA.2H2O 440mg FeCl3.6H2O 316mg CoSO4.7H2O 1.2mg ZnSO4.7H2O 2.1mg MnCl2.4H2O 18mg CuSO4.5H2O 0.7mg Na2MoO4.2H2O 0.7mg Bảng 3.7 Thành phần dung dịch môi trường nuôi cấy Nhân giống gốc (ml) Nhân giống cấp (l) Nhân nuôi sinh khối (l) 200ml môi trường 2.5 l môi trường 30 l môi trường Dung dịch A (ml) 0.2 2.5 15 Dung dịch B (ml) 1.0 12.5 15 Dung dich C (ml) 0.2 2.5 15 Dung dich D (ml) 0.2 2.5 15 Dung dịch Dung dịch A (Nguồn dinh dưỡng chính): Hịa tan lít nước cất NaNO3 85g Na2HPO4.12H2O 10g Giữ tủ lạnh 64 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Dung dịch B (F/2 Metals) Na2EDTA.2H2O 4.4g FeCl3.6H2O 3.16g CoSO4.7H2O 0.012g ZnSO4.7H2O 0.021g MnCl2.4H2O 0.18mg CuSO4.5H2O 0.007g Na2MoO4.2H2O 0.007g Hịa tan lít nước cất Giữ tủ lạnh Dung dịch C (Hỗn hợp Vitamin): 100mg Vitamin B1 (lấy 10ml từ ống dung dịch B1) 0.5mg (lấy 0.5ml từ ống dung dịch B12) Vitamin B12 Biotin 0.5mg (lấy 0.5ml từ ống dung dịch Biotin) Hòa tan lít nước cất Giữ tủ lạnh Dung dịch D (Silicate dùng cho tảo silic) Na2SiO3.9H2O 12g Hịa tan lít nước cất Giữ tủ lạnh Bảng 3.8 Môi trường cho nhân nuôi sinh khối Thể tích ni cấy (lít) Thành phần 100 NaNO3 Na2HPO4.12H2O F/2 Metals Vitamin Mix Na2SiO3-9H2O* 5g 0.5g 10ml 10ml 0.6g 200 10g 1g 20ml 20ml 1.2g 500 25g 2.5g 50ml 50ml 3g 1000 50g 5g 100 ml 100ml 6g * Na2SiO3-9H2O bổ sung cho môi trường nuôi cấy tảo silic 3.6.5 Xác định mật độ tế bào vi tảo biển Mật độ tế bào vi tảo cần thiết mật độ tế bào thể khả sinh trưởng phát triển vi tảo theo thời gian, giúp nhận định xác pha sinh trưởng vi tảo thích hợp cho cấy san, cấy chuyển dùng làm thức ăn nuôi cấy giai đoạn khác 65 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Cấu tạo buồng đếm Neubauer : Buồng đếm Neubauer thủy tinh dày khoảng mm, chia làm phần Các phần bên ngăn cách với phần rãnh dọc Phần chia đôi rãnh ngang thấp hai phần bên 0.1 mm tạo hai ngăn đếm giống Mỗi ngăn đếm hình vng, chia thành 16 ô lớn ô lớn lại chia thành 16 ô nhỏ, ô nhỏ có diện tích 1/400 m2, chiều cao 1/10mm Số lượng tế bào tính theo cơng thức: D = ( a /64)× 106 Trong đó: D: số lượng tế bào (số tế bào /ml) a: số tế bào trung bình buồng đếm 66 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Thao tác đếm: Buồng đếm lamen lau cồn, thấm khô trước cho mẫu tảo lam vào Lamen đặt buồng đếm, cho nhìn nghiêng thấy có giao thoa ánh sáng vị trí tiếp xúc buồng đếm lamen Sau đó, dùng pipete Pasteur hút dịch chứa tảo lam lắc trước chấm vào cạnh lamen dịch tảo tràn láng vào buồng đếm Buồng đếm có chứa tảo lam đưa lên kính hiển vi quan sát vật kính 40 thị kính 10 Đối với mẫu đếm đặc xác ta đem pha lỗng trước đếm nhân hệ số pha lỗng tính kết 67 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KẾT LUẬN Từ mẫu nước thu từ đầm nuôi thủy sản vùng biển Vân Đồn, Quảng Ninh phân lập chủng vi tảo biển Dựa vào đặc điểm hình thái phân tích giải trình tự rADN 18s sáu chủng vi tảo biển định danh thuộc loài:  Chủng VĐ01 thuộc loài Chaetoceros calcitrans  Chủng VĐ02 thuộc loài Chlorella vulgaris  Chủng VĐ03 thuộc loài Isochrysis galbana  Chủng VĐ04 thuộc loài Nannochloropsis oculata  Chủng VĐ05 thuộc loài Navicula sp  Chủng VĐ06 thuộc loài Tetraselmis chuii Sáu chủng vi tảo có hàm lượng acid béo omega3 omega6 cao từ 1.018-24.975% 0.285-11.67% Đặc biệt chủng Chaetoceros calcitrans VĐ01 hàm lượng omega3 omega6 đạt cao đạt 24.975 11.67% tổng hàm lượng acid béo Ấu trùng trai ngọc 2, 4, 5, 10 22 ngày tuổi ăn loài vi tảo biển Chaetoceros calcitrans VĐ01, Nannochloropsis oculata VĐ04 Isochrysis galbana VĐ03 Đặc biệt, ấu trùng sau 10 ngày tuổi ăn tiêu hóa Chlorella vulgaris VĐ02 Tetraselmis chuii VĐ06 Khơng nhận thấy q trình tiêu hóa Navicula sp., VĐ05 tất giai đoạn sinh trưởng ấu trùng Nồng độ NaCl thích hợp cho sinh trưởng lồi vi tảo biển Chaetoceros calcitrans VĐ01, Chlorella vulgaris VĐ02, Navicula sp., VĐ05 nằm khoảng 20-30‰ Với vi tảo Isochrysis galbana VĐ03 thích nghi tốt với nồng độ muối từ 25-30‰ Cịn với Nannochloropsis oculata VĐ04 nồng độ muối thấp từ 20-25‰ Đặc biệt, với Tetraselmis chuii VĐ06 có biên độ chịu mặn cao từ 25-35‰ Hiệu suất quang hợp (tỷ lệ Fv/Fm) loài vi tảo biển tăng lên với gia tăng nhiệt độ, sau giảm dần đến nhiệt độ định Tỷ lệ Fv/Fm Chaetoceros calcitrans VĐ01 Isochrysis galbana VĐ03 đạt 68 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com cao 26ºC tương ứng 0.878 0.654, Chlorella vulgaris VĐ02 cao 36ºC đạt 0.728, Nannochloropsis oculata VĐ04 đạt cao 38oC Với Navicula sp., VĐ05 nhiệt độ 32oC tỷ lệ Fv/Fm đạt cao 0,603 , Tetraselmis chuii VĐ06 thích nghi tốt 34ºC-36ºC (tỷ lệ Fv/Fm 0.581) Xây dựng hệ thống quy trình ni vi tảo biển đơn giản, riêng biệt nhằm cung cấp thức ăn với lượng lớn cho ấu trùng, trai ngọc bố mẹ suốt giai đoạn sinh sản sinh trưởng 69 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KIẾN NGHỊ Cần đẩy mạnh việc nghiên cứu, khả ứng dụng vi tảo biển ương ấu trùng trai ngọc Nhằm cung cấp đủ lượng thức ăn tươi sống từ vi tảo cho quy trình ni ấu trùng trai ngọc, từ ngày làm gia tăng lợi ích cho doanh nghiệp, người tiêu dùng bảo tồn nghề nuôi trồng thủy sản Ứng dụng phân lập, tuyển chọn nhân giống chủng vi tảo có nguồn gốc tự nhiên vào nuôi trồng thuỷ sản Đẩy mạnh công tác điều tra tuyên truyền nguồn thuỷ sản quý dần bị cạn kiệt, đồng thời tăng cường ương nuôi nhân tạo nguồn giống hải sản thức ăn tươi loài vi tảo biển 70 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt PGS.TS Nguyễn Chính (2007), Nghiên cứu kĩ thuật sản xuất nhân tạo thử nghiệm ni cấu ngọc trai lồi Pinctada Maxima Jameson 1901, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III Lê Đức, Trần Khắc Hiệp, Nguyễn Xuân Cự, Phạm Văn Khang, Nguyễn Ngọc Minh (2004) Một số phương pháp phân tích mơi trường, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội Tr 44-60 Nguyễn Thị Hoài Hà, Nghiên cứu hoàn thiện quy trình ni sinh khối vi tảo biển làm thức ăn cho ấu thể tu hài Vân Đồn, Quảng Ninh, Trung tâm Nghiên cứu Châu Á, ĐHQG, HN Phạm Thị Lam Hồng (1999), Nghiên cứu ảnh hưởng độ mặn, ánh sáng tỷ lệ thu hoạch lên số đặc điểm sinh học thành phần sinh hóa lồi vi tảo Nannochloropsis oculata (Droop) Hibber, 1981vaf cheatoceros muelleri Lemmerman, 1898 điều kiện phòng thí nghiệm Đặng Đình Kim, Đặng Hồng Phước Hiền (1999) Công nghệ sinh học vi tảo NXB Nông Nghiệp Hà Nội Tr 16-27 Chu Văn Thuộc (2002), Nghiên cứu thành phần loài, phân bố khả gây hại số loài vi tảo độc thuộc ngành vi tảo Giáp (Dinophyta) vùng ven biển miền Bắc Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Phạm Thược (2006), Nghiên cứu xây dựng hồn thiện quy trình cơng nghệ sản xuất giống bảo tồn nguồn lợi Tu Hài Phạm Văn Phúc (2007), Bước đầu thử nghiệm việc nuôi cấy ống nghiệm (in vitro) tế bào biểu mô tạo xà cừ trai nước tạo điều kiện cho tiết xà cừ ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM 71 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Tài liệu tiếng Anh Albentosa, M., Perez-Camacho, A., Labarta, U., Beiras, R., Ferna´ndez-Reiriz, M.J (1993) “Nutritional value of algal diets to clam spat Venerupis pullastra” Mar Ecol., Prog Ser 97, 261–269 10 Amos Richmond (2004), “Handbook of Microalgal Culture: Biotechnology and Applied Phycology” Pp 352-390 11 Babinchak, J., Ukeles, R., (1979), “Epifluorescence microscopy, a technique for the study of feeding in Crassostrea virginica veliger larvae”, Mar Biol 51, 69 – 76 12 Becker EW (1995), Biotechnology and Alage, Cambridge University Press 13.Borowitzka M.A (1998), “Microbiology of fermented foods 2” Blackie Academic & Professional: London pp 585-602 14 Couteau, P., Sorgeloos, P., (1992), “The use of algal substitutes and the requirement for live algae in the hatchery and nursery rearing of bivalve molluscs: an international survey”, Journal of Shellfish Research, 11: 467476 Malcolm R Brown 292 Phycology, 4: 221-231 15 Douillet, P., (1993) “Bacterivory in Pacific oyster Crassostrea gigas larvae” Marine Biology, 98: 123-134 16 Erika Carlos Rangel-Da valos 2004 “Ingestion and digestion of 10 species of microalgae by winged pearl oyster Pteria sterna (Gould, 1851) larvae” Aquaculture, 230, pp 417–423 17 Fabregas, J and C Herrero (1986), “Marine microalgae as a potential source of minerals in fish diets” Aquaculture, 51:237-243 18 Fumie Kasai, Masanobu Kawachi, Mayumi Erata and Makoto M.Wantanabe (2004), “NIES - Collection, list of strains”, National Institute for Environmental Studies, Japan, No 182, pp 54 – 58 19 Gara, B., Shields, R J., McEvoy, L (1998), “Feeding strategies to achieve correct metamorphosis of Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L., 72 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com using enriched Artemia”, Aquaculture Research, 29: 935-948 20 Hallegraeff GM, Bolch CJ (1991), “Tranport of toxic dinoflagellate cysts via ships' ballast water” Mar Pollut Bull 22: 27-30 21 J D Wehr and R G Sheath (2003), “Freshwater of North America: Ecology and classification” Elsevier Inc 22 Laing, I Child, A R., Janke, A (1990), “Nutritional value of dried algae diets for larvae of manila clam (Tapes philippinarum)” Journal of the Marine Biological Association, United Kingdom, 70: 1-12 23 L K Medline and I Kaczmarska Evolution of the diatoms (2004), “Morphological and cytological support for the major clades and a taxonomic revision” Phycologia, Vol 43 (3), pp 245-270 24 Lewis, T., Nichols, P D., Hart, P R Nichols, D S., McMeekin, T A (1998), “Enrichment of rotifers Brachionus plicatilis with eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid produced by bacteria”, Journal of the World Aquaculture Society, 29: 313-318 25 Lucas, A., Rangel, C (1983), “Detection of the first larval feeding in Crassostrea gigas, using the epifluorescence microscope”, Aquaculture 30, 369– 374 26 Makoto shirai, Katsumi Matumaru, Akio Ohotake, Yoshichika Takamura, Tokujiro Adia and Masayasu Nakano (1989), “Development of a Solid medium for Growth and Isolation of Axenic Microcystis Strains (Cyanobacteria) ”, Appl Environ Microbiol 55(10): pp 2569-2571 27 Melba G bond-reantaso, Sharon E MacGladdery, Fanck C.J Berthe (2007), Pearl oyster health management, Food and argiculture organization of united Nations 28 Miller L.T (1982), "Single derivatization method for routine analasyis of bacterial whole cell fatty acid methyl esters, including hydroxy acids", J Clin Microbiol.,16 584-586 73 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 29 Mohamed, K.S.,Kripa, V.,Velayudhan, T.S.&Appukuttan, K.K (2006), “Growth and biometric relationships of the pearl, pinctada fucata (Gould) on transplanting from the Gulf of Mannar to the Arabian Sea” Aquaculture Research, 37: 725-741 30 Nell, J.A O'Connor, W.A (1991), “The evalution of fresh algae and stored algal concentrates as a food source for Sydney rock oyster, Saccostrea commercialis (Iredale and Roughley), larvae” Aquaculture, 99, 277-284 31 Ponis E Robert R Parisi P 2003 “Nutritional value of fresh and concentrated algal dietsfor larval and juvenile Pacific oysters” Aquaculture, 221: pp 491505 32 Sargent, J R., McEvoy, L A., Bell., J G., (1997) “Requirements, presentation and sources of polyunsaturated fatty acids in marine fish larval feeds” Aquaculture, 155: 117-127 33 Tamaru, C S., Murashige, R., Lee, C.-S (1994), “The paradox of using background phytoplankton during the larval culture of striped mullet, Mugil cephalus L”, Aquaculture, 119: 167-174 34 Watson, S A., Southgate, P C., Tyler, P A., and Peck, L S (2009), “Early larval development of the Sydney rock oysterSaccostrea glomerata under near-future predictions of CO2-driven ocean acidification”, J Shellfish Res, 28: 431–437 35 Webb, K L., Chu, F E (1983), “Phytoplankton as a food source for bivalve larvae In: G D Pruder, C J Langdon and D E Conklin (Editors), Proceedings of the Second International Conference on Aquaculture Nutrition: Biochemical and Physiological Approaches to Shellfish Nutrition”, Louisiana State University, Baton Rouge, LA, pp 272–291 74 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trang web 36 http://www.dost-bentre.gov.vn/ 37 http://www.elsevier.com/locate/aqua-online 38 http://www.kiengiang.gov.vn/ 39 http://www.ngoctrai.com.vn/goc-tu-van/16-dac-diem-sinh-hoc-trai-ngoc.html 40 http://www.seafarm.com 41 http://www.vietnamtravels.vn/vietnam-travel-information/Quang-Ninh.htm 42 http://www.vista.gov.vn/potal/ 75 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... Nguyễn Thị Hường ỨNG DỤNG NUÔI SINH KHỐI VI TẢO BIỂN LÀM THỨC ĂN CHO ẤU TRÙNG TRAI NGỌC TẠI VÂN ĐỒN, QUẢNG NINH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI... sản xuất giống Do đó, tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Ứng dụng nuôi sinh khối vi tảo biển làm thức ăn cho ấu trùng trai ngọc Vân Đồn, Quảng Ninh? ?? Sự thành công đề tài góp phần mang lại hiệu kinh... hóa ăn vi tảo biển ấu trùng trai ngọc Thí nghiệm thực cách sử dụng phương pháp quan sát trực tiếp ăn vào tiêu hóa vi tảo kính hiển vi huỳnh quang Zeiss Axio Vision Ấu trùng cho ăn hỗn hợp tảo