KỸ THUẬT PHỐI KHỔ MASS SPECTROMETRIC TECHNIQUES TƯ VẤN VIÊNĐẦU TIÊN 1 2 TƯ VẤN VIÊNĐẦU TIÊN 2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ KỸ THUẬT PHỐI KHỔ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHỐI KHỔ GIỚI THIỆU CHUNG VỀ KỸ THUẬT PHỐI KHỔ 3 TƯ.
KỸ THUẬT PHỐI KHỔ MASS SPECTROMETRIC TECHNIQUES GIỚI THIỆU CHUNG VỀ KỸ THUẬT PHỐI KHỔ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHỐI KHỔ TƯ VẤN VIÊNĐẦU TIÊN GIỚI THIỆU CHUNG VỀ KỸ THUẬT PHỐI KHỔ TƯ VẤN VIÊNĐẦU TIÊN THIỆU CHUNG HUMANGIỚI RESOURCES SLIDE VỀ PHƯƠNG PHÁP KHỐI PHỔ LỊCH SỬ ỨNG DỤNG NGUYÊN TẮC CHUNG THÀNH PHẦN CỦA KHỐI PHỔ KẾ TƯ VẤN VIÊNĐẦU TIÊN LỊCH SỬ • Goldstein (1886) Wein (1898) thấy chùm tia ion dương tách khỏi tác dụng điện trường từ trường Cuối TK XIX • Sự kết hợp GC/MS thực năm 1960 LC/MS năm 1970 1960 • J.J.Thomson phát electron thí nghiệm tia cathode Đạt giải Nobel năm 1906 1897 • Munson Field mơ tả ion hóa hóa học 1966 • Francis Aston cơng nhận máy khối phổ đo m/z hợp chất ion 1919 • MS sử dụng phát dầu mỏ phân tích hormon/steroid (1950) 1940 • Nhiều kỹ thuật nhanh chóng phát triển như: • 1968, Ion hóa tia điện (EI) (Dole, Mack cộng sự) • 1975, Ion hóa hóa học áp suất khí (APCI) (Carroll cộng sự) • 1985, F Hillenkamp, M.Kara đồng nghiệp mơ tả thuật ngữ ion hóa giải hấp thụ ma trận (MALDI) • 1989, Paul phát kỹ thuật bẫy ion 1968-1989 TƯ VẤN VIÊNĐẦU TIÊN ỨNG DỤNG: • Sự phát triển hai kỹ thuật ion hóa: electrospray (ESI) MALDI cho phép xác định khối lượng xác hợp chất có phân tử khối cao phân tử có khối lượng phân tử thấp cách mạng hóa khả ứng dụng phép đo phổ khối hầu hết phân tử sinh học • Xác định hợp chất chưa biết cách dựa vào khối lượng phân tử hợp chất hay phần tách riêng (hữu cơ) • Xác định kết cấu chất đồng vị thành phần hợp chất (vơ cơ) • Xác định cấu trúc hợp chất cách quan sát phần tách riêng • Các ứng dụng khoa học proteomics điều chế thuốc • Một số lượng lớn phân tử tương tự sản xuất cách tổng hợp hóa học phân tích để tìm hợp chất hiệu so với nhóm hóa chất hữu liên quan TƯ VẤN VIÊNĐẦU TIÊN NGUYÊN TẮC CHUNG: • Nguyên tắc: Phổ khối (MS) kỹ thuật phân tích có giá trị phân tử mẫu thử chuyển đổi thành ion khí, sau tách theo tỷ lệ khối lượng (m / z) chúng khối phổ kế phát • Phương thức tiến hành: Chuyển chất nghiên cứu thành thể khí • Bằng hệ thống chân khơng cao, áp suất thấp chất rắn lỏng chuyến thành khí Ion hóa gia tốc ion đến vận tốc cụ thể điện trường • Năng lượng bắn phá phân tử thành ion khoảng 10eV Tách ion máy phân tích khối Phát chất có tỷ lệ m / z cụ thể • z = m/e (số khối) TƯ VẤN VIÊNĐẦU TIÊN THÀNH PHẦN CỦA KHỐI PHỔ KẾ: TƯ VẤN VIÊNĐẦU TIÊN THÀNH PHẦN CỦA KHỐI PHỔ KẾ: A) HỆ THỐNG CHÂN KHÔNG CAO ( TORR HOẶC ) • Tất khối phổ kế hoạt động chân không để giảm thiểu va chạm ion phân tử khơng khí • Nếu khơng có độ chân khơng cao, ion tạo nguồn khơng đến máy dị Ở áp suất khí quyển, đường tự trung bình ion điển hình khoảng 52nm; mtorr, 40 mm; torr, 40 m • Trong hầu hết thiết bị, hai loại bơm chân không sử dụng o Một bơm cánh quạt quay (để tạo giảm áp suất chính) Bơm cánh quạt quay bơm dầu để cung cấp chân không ban đầu (khoảng torr), o Sau bơm phân tử bơm khuếch tán để tạo độ chân không cao (1 mtorr đến ntorr) Đây tuabin khí tốc độ cao với rotor xen kẽ (lưỡi dao di chuyển) stator (tức lưỡi cố định cánh cố định) TƯ VẤN VIÊNĐẦU TIÊN THÀNH PHẦN CỦA KHỐI PHỔ KẾ: B) BỘ PHẬN DẪN MẪU: • Mẫu từ hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), sắc ký khí (GC), điện di mao quản • Solid probe plate MALDI • Bơm mẫu trực tiếp qua xi lanh Lượng mẫu 0,1 -1 mg TƯ VẤN VIÊNĐẦU TIÊN CÁC PHƯƠNG PHÁP PHỐI KHỔ ION HÓA TÁC ĐỘNG ĐIỆN TỬ ELECTRON IMPACT IONISATION (EI) PHƯƠNG PHÁP BẮN PHÁ NGUYÊN TỬ NHANH FAST ATOM BOMBARDMENT (FAB) ION HÓA HÓA HỌC CHEMICAL IONISATION (CI) ION HÓA PHUN ĐIỆN ELECTROSPRAY IONISATION (ESI) TƯ VẤN VIÊNĐẦU TIÊN 17 ION HÓA TÁC ĐỘNG ĐIỆN TỬ (ELECTRON IMPACT IONISATION (EI)) • EI sử dụng rộng rãi để phân tích chất chuyển chất thải thành phần hóa, thuốc y dược • EI đầu dị khối phổ cho sắc kí khí GC/MS Hình: Sơ đồ cấu tạo EI Chèn kéo & thả ảnh bạn ION HÓA TÁC ĐỘNG ĐIỆN TỬ (ELECTRON IMPACT IONISATION (EI)) Gồm phận: • Dây tóc làm vonfarm rhenium (Filament) • Buồng tác động (Source chamber) • Bộ phận cho mẫu vào (Sample insertion) • Nơi electron phân tích Hình: Sơ đồ cấu tạo EI Chèn kéo & thả ảnh bạn ION HÓA TÁC ĐỘNG ĐIỆN TỬ (ELECTRON IMPACT IONISATION (EI)) Mẫu dạng khí đưa vào buồng nhận mẫu Dòng electron tạo từ dây tóc làm nóng Các dịng nhanh chóng di chuyển đến nguồn +70 eV Các mảnh ion đưa vào hệ thống sắc kí đồ Tương tác với chất phân tích, phân cắt thành mảnh ion Chèn kéo & thả ảnh bạn ION HÓA TÁC ĐỘNG ĐIỆN TỬ (ELECTRON IMPACT IONISATION (EI)) Một số lưu ý: • Dưới tác động ion hóa, chất hữu bị phân cắt thành nhiều mảnh kích thước khác nhau, có chất mang điện khơng mang điện • Chỉ có chất mang điện tích sắc kí đồ nhận • Các đoạn ion bị phá vỡ mức bình thường Vì khơng có nhiều ion tồn tại, làm giảm tín hiệu thu nhận • Một ví dụ đơn giản n-butane (CH3CH2CH2CH3) số phân đoạn hình 9.3.a Phổ EI tương ứng hình 9.3b: Chèn kéo & thả ảnh bạn ION HÓA TÁC ĐỘNG ĐIỆN TỬ (ELECTRON IMPACT IONISATION (EI)) Các đường phân đoạn n-butane phổ EI Trong phổ, độ phong phú tương đối vẽ từ đến 100% đỉnh lớn đặt 100% (đỉnh sở) Chèn kéo & thả ảnh bạn ION HÓA HĨA HỌC (CHEMICAL IONISATION (CI)) • CI sử dụng cho loại mẫu tương tự EI • Một phương pháp hữu ích việc xác định trọng lượng phân tử, với phân tử ion có độ nhạy cao hình thành phân đoạn => làm tăng khả quang phổ • Về cấu tạo nguyên tắc giống EI, nhiên mẫu dẫn vào buồng với khí methane (CH4) ammonia (NH3) Các chất khí có tác dụng làm giảm lực ion hóa electron Chèn kéo & thả ảnh bạn PHƯƠNG PHÁP BẮN PHÁ NGUYÊN TỬ NHANH (FAST ATOM BOMBARDMENT (FAB)) • Phát triển năm đầu 1980 • Là ion hóa mềm, dẫn đến hình thành ion có lượng bên thấp phân mảnh • Cho phép phân tích phân tử sinh học mà không cần tạo dẫn xuất trước Chèn kéo & thả ảnh bạn PHƯƠNG PHÁP BẮN PHÁ NGUYÊN TỬ NHANH (FAST ATOM BOMBARDMENT (FAB)) Mẫu trộn với chất có độ nhớt cao : glycerol, thioglycerol, mnitrobenzyl alcohol Hỗn hợp đặt đầu dò Xác định khối phổ ion dương âm Chèn kéo & thả ảnh bạn Nguồn bắn phá chùm ion hóa ngun tử trung tính (Ar, He, Xe) với vận tốc cao Hình thành loại ion giả phân tử (M + H)+ (M – H)- 25 ION HÓA PHUN ĐIỆN (ELECTROSPRAY IONISATION (ESI)) Chèn kéo & thả ảnh bạn • Tạo ion cách phun dung dịch chất phân tích vào trường điện từ • Là kỹ thuật ion hóa mềm, cho phép phân tích phân tử sinh học có khối lượng phân tử lớn : protein DNA • Ion hóa phun điện (ES) tạo giọt nhỏ chất phân tích chứa dung mơi 26 ION HÓA PHUN ĐIỆN (ELECTROSPRAY IONISATION (ESI)) Chèn kéo & thả ảnh bạn • Dung mơi (thường 50: 50 nước dung mơi hữu cơ) • Dung dịch mẫu bị tác động điện trường mạnh (khoảng keV cuối mao quản keV điện cực đếm) • Khi dung mơi bay hơi, kích thước giọt giảm cuối chất phân tích tích điện (khơng có dung mơi) cịn • Ion hóa xảy áp suất khí phương pháp gọi ion hóa áp suất khí (API) 27 ION HĨA PHUN ĐIỆN (ELECTROSPRAY IONISATION (ESI)) Nồng độ mẫu sử dụng 1-10 pmol mm-3 Pha 50/50 acetonitril metanol) / H2O với axit axetic 1% axit formic 0,1% Tốc độ dòng chảy vào nguồn thường khoảng vài mm3 min-1 Dịch phun điện trường – Các phân tử nhỏ tạo ion tích điện đơn lẻ – Các phân tử sinh học lớn tạo ion tích điện nhân – Ở pH thấp, nhóm bị ion hóa – Ở pH kiềm chuỗi bên axit cacboxylic, anion mạnh bị ion hóa Dung mơi bay hơi, hình thành ion tích điện Chèn kéo & thả ảnh bạn 28 ION HÓA PHUN ĐIỆN (ELECTROSPRAY IONISATION (ESI)) Chèn kéo & thả ảnh bạn VÍ DỤ : XÁC ĐỊNH KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ PROTEIN BẰNG ESI Một protein phân lập từ mô người Xác định Mr: sắc ký rây phân tử = 12000; Mr điện di gel = 13000 Sau tinh chế, mẫu xác định phương pháp khối phổ ion hóa phun điện liệu thể m/z Độ phong phú (%) 773.9 825.5 884.3 952.3 1031.3 88 100 66 37 59 29 ION HÓA PHUN ĐIỆN (ELECTROSPRAY IONISATION (ESI)) Chèn kéo & thả ảnh bạn Cho n2=(m1-1) / (m2-m1) M= n2 (m2-1) giả sử ion hỗn hợp phát sinh proton hóa, suy khối lượng phân tử trung bình cho protein phương pháp này: 30 Chèn kéo & thả ảnh bạn ION HÓA PHUN ĐIỆN (ELECTROSPRAY IONISATION (ESI)) Lấy đỉnh ESI theo cặp: m1-1 m2-m1 n2 m2-1 M(Da) z 951.3 79.0 12.041 1030.3 12406.6 12 883.3 68.0 12.989 951.3 12357.1 13 824.5 58.8 14.022 883.3 12385.7 14 772.9 51.6 14.978 824.5 12349.9 15 Tổng M= 49 499.3 Da Trung bình M =12 374.8 Da 31 ... CHUNG VỀ KỸ THUẬT PHỐI KHỔ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHỐI KHỔ TƯ VẤN VIÊNĐẦU TIÊN GIỚI THIỆU CHUNG VỀ KỸ THUẬT PHỐI KHỔ TƯ VẤN VIÊNĐẦU TIÊN THIỆU CHUNG HUMANGIỚI RESOURCES SLIDE VỀ PHƯƠNG PHÁP KHỐI PHỔ LỊCH... triển hai kỹ thuật ion hóa: electrospray (ESI) MALDI cho phép xác định khối lượng xác hợp chất có phân tử khối cao phân tử có khối lượng phân tử thấp cách mạng hóa khả ứng dụng phép đo phổ khối hầu... nhận máy khối phổ đo m/z hợp chất ion 1919 • MS sử dụng phát dầu mỏ phân tích hormon/steroid (1950) 1940 • Nhiều kỹ thuật nhanh chóng phát triển như: • 196 8, Ion hóa tia điện (EI) (Dole, Mack cộng