TỔNG QUAN
Thiết bị Franz
1.1.1 Vai trò của thiết bị Franz trong thí nghiệm đo khả năng thẩm thấu qua da
Thử nghiệm đo lường sự giải phóng thuốc từ một dạng thuốc được cho là điều cơ bản để phát triển các sản phẩm thuốc Xác định cụ thể kỹ thuật được sử dụng bởi chính dạng liều lượng và đường phân phối mong muốn của thuốc Đối với các dạng thuốc rắn, thử nghiệm về độ tan của thuốc đã được sử dụng trong 50 năm qua Gần đây, đối với sản phẩm thuốc bán rắn, thử nghiệm giải phóng thuốc in vitro (IVRT) là một phương tiện để đánh giá tính giải phóng của thuốc Tỷ lệ giải phóng in vitro có thể phản ánh hiệu quả kết hợp của một số thông số vật lý và hóa học, bao gồm độ hòa tan và kích thước hạt và các đặc tính lưu biến của dạng liều [18]
Phương pháp IVRT phổ biến nhất sử dụng thiết kế buồng mở như hệ thống thiết bị khuếch tán Franz và có thể được sử dụng với màng tổng hợp, cấu trúc mô hoặc mẫu sinh học, chẳng hạn như da người [18]
Hình 1.1 Thiết bị Franz và chi tiết các bộ phận
1.1.2 Cấu tạo của thiết bị Franz
Thiết bị Franz là các thiết bị giải phóng riêng biệt được làm từ hai phần thủy tinh borosilicate Phần trên có thể được gọi là nắp thiết bị, đỉnh của thiết bị, buồng cấp, hoặc khoang cấp Phần dưới thường được gọi là phần thân của thiết bị, hay còn được gọi là buồng thụ thể
Hình 1.2 Cấu tạo gồm hai phần chính của thiết bị Franz
Buồng trên hay buồng cấp được nối với buồng dưới hay còn là buồng thụ thể bằng một khớp Màng ngăn qua đó thẩm thấu hoặc vận chuyển chất được đặt ở giữa khớp và giữ bằng một chiếc kẹp
Các thiết bị có vỏ bọc có thể được nối với nguồn nước để kiểm soát nhiệt độ Các thiết bị không có vỏ bọc có thể được đặt trong máy sấy khô, bồn nước hoặc môi trường được kiểm soát nhiệt độ nếu cần Mặc dù các thiết bị có vỏ đắt hơn nhưng lại được sử dụng phổ biến hơn bởi vì chúng có thể dễ dàng kiểm soát nhiệt độ
Các thiết bị Franz thường sử dụng các máy khuấy V-Series Nhưng nếu chỉ sử dụng một thiết bị Franz đơn lẻ trong thí nghiệm in vitro thì cũng có thể sử dụng máy khuấy thí nghiệm thông thường
Tay lấy mẫu, ống dẫn, ống thoát nước nóng, và lưu lượng được tùy chỉnh của các thiết bị Franz tiêu chuẩn được làm từ ống OD 6mm có độ dày thành 1,0mm Dung sai của ống được nhà sản xuất ống đưa ra, đường kính
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
OD 2mm có thể dễ dàng được sử dụng để lấy mẫu thiết bị Franz Lượng lấy mẫu tiêu chuẩn của thiết bị Franz hiện chưa có quy chuẩn rõ ràng nên được lấy một lượng càng nhỏ càng tốt [14]
1.1.3 Cách hoạt động của thiết bị Franz
Các sản phẩm được thử nghiệm được đặt ở buồng cấp Màng ngăn tách buồng cấp chứa mẫu thử nghiệm với buồng thụ thể chứa đầy các chất trung gian Muối Phosphate Buffered Saline (PBS) thường được lựa chọn đầu tiên làm chất trung gian, mặc dù nó có thể không khả thi khi sử dụng trong một số trường hợp [18] Sự thẩm thấu của thuốc bán rắn qua màng được theo dõi bằng cách lấy mẫu từ buồng thụ thể theo thời gian và kiểm tra Tại các thời điểm xác định trước, một lượng chất trung gian được lấy ra từ buồng thụ thể để phân tích, thường là bằng HPLC Chất trung gian sẽ được bù vào với mỗi lần lấy mẫu như vậy Buồng dưới chứa chất lỏng từ đó các mẫu được lấy theo các khoảng thời gian đều đặn để phân tích Thử nghiệm này nhằm xác định lượng thẩm thấu qua màng tại mỗi thời điểm Buồng được duy trì ở nhiệt độ không đổi 37 o C Tùy thuộc vào phương tiện, khả năng thấm của từng chất nhất định được xác định thông qua phân tích thiết bị Franz có thể thay đổi đáng kể (có lẽ từ 10 đến 50 lần) Kết quả thử nghiệm trên thiết bị Franz không nhất thiết phải dự đoán hiệu quả của một cấu trúc; mà có thể là xác định liệu cấu trúc đó có tác nhân hoạt động qua da hay không [24].
Tính thấm qua da
1.2.1 Khó khăn khi nghiên cứu khả năng thẩm thấu qua da
Rào cản chính đối với khả năng thẩm thấu qua da là lớp sừng, và sự xâm nhập của một hợp chất được xác định chủ yếu bởi cấu trúc hóa học của nó Ngoài ra có nhiều yếu tố khác đóng vai trò trong việc ảnh hưởng đến sự thẩm thấu qua da bao gồm (i) cách sử dụng hoặc tiếp xúc với các hợp chất trên bề mặt da, (ii) các cách thức làm thay đổi tính chất rào cản của tầng lớp sừng, (iii) quy trình xảy ra trong các mô, (iv) các yếu tố sinh học Lớp sừng nằm trên bề mặt ngoài của da, là một lớp tế bào chết chứa đầy keratin được bao quanh bởi một hệ thống ngoại bào giàu lipid Trong cơ thể người, nó bao gồm 10 và 25 lớp tế bào chết, kéo dài, các tế bào sừng ở trong một hệ thống lipid kộp Lớp sừng chỉ dày 7–16 àm ở hầu hết cỏc vựng của cơ thể nhưng dày 400–600 àm ở lũng bàn tay và bàn chõn Tầng lớp sừng bao gồm 40% protein trong đó 80% là keratin Chủng loại và lượng lipid có trong lớp sừng phụ thuộc vào từng vùng của cơ thể có thể làm ảnh hưởng lớn đến tính thấm qua da [13]
Nhiều nỗ lực đã được thực hiện để phát triển các phương pháp tiếp cận thực nghiệm đo lường sự hấp thu qua da Hầu hết các dữ liệu hiện nay đã thu được bằng các thí nghiệm in vitro, trong khi dữ liệu in vivo thu được bằng các xét nghiệm sinh học Về tỷ lệ chuyển hóa qua da của các loại thuốc khác nhau thì thường được nghiên cứu nhiều nhất bằng cách tiến hành các thí nghiệm trong in vitro, đơn giản hơn nhiều so với các phép đo trên lâm sàng
Mức độ thẩm thấu có thể được đo bằng : i Sự chuyển hóa thuốc trong động vật hoặc người thử nghiệm ii Sử dụng da được cắt bỏ từ người hoặc động vật iii Sử dụng mô hình màng tổng hợp trong thí nghiệm in vitro
Da người có từ nhiều nguồn khác nhau như từ phẫu thuật thẩm mỹ và phẩu thuật cắt bớt, đã được sử dụng trong thí nghiệm in vitro Da từ các loài động vật bao gồm lợn, chuột, lợn, rắn, thỏ và các loài khác được lựa chọn thay thế phù hợp cho da người Trong số các loại, da của lợn và chuột thường được sử dụng phổ biến nhất vì có nhiều điểm chung với da người Mặc dù da động vật cho thấy sự thẩm thấu các hóa chất trong nghiên cứu rất tốt, nhưng nó không có sự phức tạp như lớp sừng ở da người
1.2.2 Các phương pháp đánh giá khả năng thẩm thấu của các chất hóa học qua da
Các phương pháp ex vivo và in vitro để thử nghiệm tính thẩm thấu của da được thiết lập và công bố rộng rãi [2, 3] Chúng được sử dụng phổ biến trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu Da người từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm phẫu thuật thẩm mỹ và phẩu thuật cắt bỏ đã được sử dụng để đánh giá ex vivo về khả năng thẩm thấu qua da [2, 3, 8] Việc sử dụng các loại da động vật
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU gồm lợn, chuột, khỉ, rắn và những loài khác đã được coi như là một sự thay thế thích hợp cho da người [1, 4] Trong đó, da từ lợn và chuột thường được sử dụng rộng rãi nhất, vì chúng có các rào cản tương tự để thẩm thấu các phân tử gần giống với da người [1, 4, 17]
Mặc dù da động vật có thể cung cấp các đặc tính rào cản và tạo ra các đặc điểm thẩm thấu tương tự như da người, nhưng chúng không thể mang đầy đủ tính chất phức tạp của da người nói chung, và đặc tính rào cản của lớp sừng nói riêng Vì vậy, một số nhà nghiên cứu đã nỗ lực phát triển da nhân tạo có đặc điểm tương đương với da người để giảm bớt các vấn đề như vậy
Một số loại da nhân tạo đã được sử dụng thành công trong cấy ghép da và trong điều trị phẫu thuật bỏng [21] Da nhân tạo có các vùng ưa nước và kỵ nước và do đó mang đầy đủ các đặc điểm của lớp sừng trên da người
Các mô hình tương đương với da người (LSEs) cũng được sử dụng để đánh giá khả năng thẩm thấu qua da Chúng bao gồm các màng da như: biểu bì tái tạo được phát triển trong nuôi cấy mô và được sử dụng làm phương pháp thay thế cho các mô động vật Nói chung, các mô này yếu hơn và có ít hơn đáng kể các rào cản như ở da người khi chúng được xây dựng với hàm lượng Ceramide 1 và 3 thấp hơn bình thường ở da người Một số nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng chúng có thể cung cấp các đặc điểm thẩm thấu tương tự cho da người nhưng trong nhiều trường hợp, chúng vượt quá mức ước lượng thấm qua da [10, 11, 22, 28]
Khi không có da người hoặc da động vật, hoặc khi thực hiện thí nghiệm với một số lượng lớn, đặc biệt là đối với các thí nghiệm sàng lọc, màng tổng hợp thường được sử dụng thay thế Các màng nhân tạo hay được sử dụng nhất là polydimethylsiloxan (PDMS) và cellulose axetat Màng PDMS là rào cản đồng nhất đã được chứng minh giống với các đặc tính rào cản của lớp sừng và đã sử dụng phổ biến trong các thí nghiệm [5, 36] Màng cellulose acetate cũng được sử dụng tương tự trong các thí nghiệm để mô phỏng tính thẩm thấu của tế bào Cấu trúc xốp của nó được so sánh như các đường nước và nang trong da mà qua đó các phân tử có thể thẩm thấu [7] Tuy nhiên, các màng này đã được chứng minh thường làm tăng đáng kể khả năng thẩm thấu của các chất nên việc sử dụng chúng đã bị giới hạn Có rất nhiều các cách thức thử nghiệm tính rào cản để xác định khả năng thẩm thấu qua da Để đánh giá mối quan hệ giữa các phương pháp khác nhau, khả năng thẩm thấu tương đối thông qua các màng của cùng một hợp chất sẽ được so sánh Trong thực tế, có ít dữ liệu so sánh cho mục đích này tồn tại Để phá vỡ vấn đề này, mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc-tác dụng dựa trên các dữ liệu có thể được mang ra so sánh Các mối quan hệ định lượng cấu trúc-tác dụng (QSARs) thống kê khả năng thẩm thấu qua da của một loạt các hóa chất ngoại sinh với các thông số hóa lý đã biết khi được xác định bằng thực nghiệm Tuy nhiên, có một số phản đối do những hạn chế của việc phát triển mô hình thống kê, một số thống kê khi xây dựng cần được cân nhắc [25]
1.2.3 Mối quan hệ định lượng cấu trúc-tác dụng (QSAR) và khả năng thẩm thấu qua da
Mô hình QSAR thống kê sự liên hệ giữa hoạt tính sinh học của một loạt các hợp chất với tính chất hóa lý và hoặc cấu trúc của chúng [20] Như vậy, nó cung cấp các mô hình tiên đoán để ước tính hoạt động sinh học được nghiên cứu Trải dài hơn một thế kỷ, phần lớn công việc trong lĩnh vực này đã tập trung chủ yếu vào việc tối ưu hóa hoạt động của thuốc và dự đoán độc tính Với mục đích của luận văn này để nghiên cứu dự đoán khả năng thẩm thấu qua da của các chất [25]
Khả năng thẩm thấu của một hợp chất qua da được xác định bằng nhiều phương pháp Trong đó, đầu tiên có định luật Fick bao gồm lưu lượng và hệ số thấm như sau [25]:
Kp: Hệ số thẩm thấu
∆C m : Chênh lệch nồng độ giữa 2 bên của màng
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
1.2.4 Quá trình phát triển của QSAR trong nghiên cứu tính thấm qua da
Những nghiên cứu liên quan đến tính thấm của các hợp chất qua da đối với tính chất hóa lý của chúng đã được thực hiện trong ít nhất ba mươi năm
Tuy nhiên, đặc biệt trong các nghiên cứu trước đây, hiếm khi các mô hình dự báo định lượng (tức là QSPR) được thực hiện Phần lớn các nghiên cứu dựa trên việc phân tích các chuỗi phân tử tương đồng hoặc có liên quan chặt chẽ
Thông thường chỉ có một số lượng nhỏ các hợp chất được đánh giá Nhiều nghiên cứu trong số này cho thấy mối quan hệ tuyến tính với khả năng kỵ nước, tức là tăng tính kỵ nước có liên quan đến việc tăng cường độ thẩm thấu của da [31, 32] Một số nghiên cứu thì cho thấy mối quan hệ dạng parabol của độ thẩm thấu qua da với tính kỵ nước, đặc biệt là khi lựa chọn các hợp chất bao gồm những chất có tính kỵ nước cao [32] Qua những nghiên cứu này, cho thấy rằng có thể áp dụng được các mô hình QSAR cho độ thẩm thấu qua da, mỗi mô hình được thiết lập riêng cho một nhóm chất hóa học cụ thể, hoặc một loạt các hợp chất
Tập dữ liệu Flynn (1990) và các phân tích QSAR sau đó:
Tổng quan về mối quan hệ định lượng cấu trúc-tác dụng của hợp chất (QSAR)
Tên tác giả Số chất R 2 Mô hình
Potts và Guy 93 0,67 Tuyến tính
Pugh và Hadgraft 24 0,935 Tuyến tính
Lien và Gao 22 0,96 Tuyến tính
Potts và Guy 37 0,94 Tuyến tính
Hostynek and Magee 20 0,80 Tuyến tính
Roy và cộng sự 60 0,64 Tuyến tính
Abraham và cộng sự 53 0,96 Tuyến tính
Gute và cộng sự 60 0,67 Tuyến tính
Minghetti và cộng sự 14 0,749 Tuyến tính
Dearden và cộng sự 91 0,83 Tuyến tính
Poulin và Krishnan 47 0,95 Mô hình dựa trên K p
Ghafourian và Fooladi 39 0,94 Tuyến tính
Gonzalez và Helguera 38 0,92 Tuyến tính
Pannier và cộng sự 37 0,97 Lôgic mờ
Pannier và cộng sự 54 0,95 Lôgic mờ
Degim và cộng sự 38 0,997 ANN
Moody và MacPherson 65 0,89 Tuyến tính
Majumdar và cộng sự 62 0,934 Tuyến tính
1.3 Tổng quan về mối quan hệ định lƣợng cấu trúc-tác dụng của hợp chất (QSAR)
1.3.1 Khái niệm và nguyên lý chung của QSAR
QSAR là một hàm số biểu thị mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc phân tử và hoạt tính sinh học hoặc hóa học của hợp chất có dạng tổng quát
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Y = f1(x1) + f2(x2) + + fn(xn) Trong đó, Y là biến đáp ứng sinh học hoặc hóa học thường thu được từ thực nghiệm và thể hiện bằng giá trị log Kp với Kp là hệ số thẩm thấu qua da
Các biến x1, x 2,… xn là các đại lượng được sử dụng để mô tả cấu trúc phân tử hợp chất gọi là các tham số phân tử (molecular descriptors) Đến nay đã có hàng ngàn tham số phân tử (TSPT) được sử dụng trong nghiên cứu xây dựng mô hình QSAR Các TSPT này thu được bằng thực nghiệm hoặc tính toán bằng lý thuyết bởi các phần mềm chuyên dụng như Dapt, Dragon, Padell, MOE, Hyperchem
Các mô hình QSAR được xây dựng trên nguyên lý cơ bản là cấu trúc của mỗi phân tử chứa các yếu tố quyết định đặc tính sinh học, vật lý, hóa lý của nó; do đó, các hợp chất có cấu trúc giống nhau thường có hoạt tính tương tự nhau [26]
Từ năm 1868, Crum-Brown và Fraser đã đưa ra nhận định tác dụng sinh học là hàm số của cấu trúc hóa học:
f (C) Đến năm 1893, Richet đã rằng sự khác nhau về tác dụng sinh học là do sự thay đổi về tính chất hóa học hay lý hóa [33]:
f (C) Đây là hai tư tưởng nền tảng để thiết lập các mô hình QSAR sau này
Năm 1900, Meyer và Overton tìm ra mối quan hệ tuyến tính giữa mức độ thân dầu và hoạt tính của thuốc gây mê [29]
Và đến năm 1935, phương trình Hammett ra đời, được coi là phương trình đầu tiên biểu diễn mối quan hệ định lượng hoạt tính-cấu trúc [29]:
Với K, Ko là hằng số acid, là hằng số Hammett (thông số hóa lý đặc trưng cho khả năng hút hoặc đấy điện tử của nhóm thế)
Từ những năm 60 của thế kỉ XX, mô hình QSAR thực sự được nghiên cứu bởi Corwin Herman Hansch Mô hình QSAR Hansch là phương trình hồi quy nhiều tham số biểu thị mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và các thông số hóa lý:
Trong đó: C biểu thị đáp ứng sinh học; là hằng số thế kỵ nước; là hằng số thế Hammett; Es là hằng số thế Taft và k1, k2, k3, k4, k5 là các hệ số phân tích hồi quy
Từ đó đến nay, số lượng nghiên cứu về xây dựng các mô hình QSAR được công bố tăng đột biến và các phương pháp xây dựng, ứng dụng mô hình QSAR ngày càng đa dạng
1.3.2 Xây dựng và đánh giá mô hình QSAR
Mô hình QSAR được xây dựng và đánh giá gồm 5 bước như sau:
Bước 1: Chuẩn bị cơ sở dữ liệu
Cơ sở dữ liệu (CSDL) để xây dựng các mô hình QSAR thường là hoạt tính, độc tính, đặc tính dược động học của các hợp chất được công bố trong các nghiên cứu khoa học tạo thành dữ liệu toàn cầu (global database) CSDL cho một mô hình QSAR cụ thể sẽ bao gồm cấu trúc phân tử của dãy chất và hoạt tính của chúng, thường gặp nhất là hoạt tính thu được bằng thực nghiệm in vitro [15]
CSDL ban đầu được chia thành tập huấn luyện (training set) và tập kiểm nghiệm (test set) Tập huấn luyện chiếm khoảng 80-90% CSDL ban đầu và được sử dụng để xây dựng mô hình QSAR [19] Tập kiểm nghiệm được sử dụng để đánh giá mô hình
Bước 2: Tính toán tham số phân tử
Cấu trúc phân tử hợp chất được vẽ bằng các phần mềm như Chemdraw, hoặc bằng chức năng tích hợp trong các phần mềm xây dựng mô hình QSAR chuyên dụng Từ các cấu trúc này, tham số phân tử (TSPT) mô tả thông tin
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Một số phần mềm thường được sử dụng để tính toán các TSPT hiện nay là Dragon, Padell, MOE, Hyperchem, Cùng với sự phát triển của QSAR, ngày càng nhiều nhóm TSPT được tính toán để mô tả chi tiết, chính xác hơn cấu trúc của hợp chất Phiên bản cập nhật Dragon 7.0 (2017) có thể tính toán được đến 5270 TSPT
Các TSPT có thể được phân loại thành 3 nhóm như sau:
Tham số phân tử 1D: Những TSPT có thể thu được từ công thức tổng quát của hợp chất (khối lượng phân tử, số nhóm thế, số nguyên tử C hoặc là những TSPT tính toán từ sự tổng hợp các nguyên tử thành phần như chỉ số khúc xạ, độ phân cực Trong đó hệ số phân bố n-octal/nước là tham số thường sử dụng để đánh giá sinh khả dụng, khả năng thấm qua màng tế bào của hợp chất
Tham số phân tử 2D: Những TSPT để mô tả hình dạng, trật tự liên kết của các nguyên tử trong cấu trúc của hợp chất Ví dụ số liên kết -, số vòng thơm, số liên kết H
Tham số phân tử 3D: Những TSPT mô tả cấu trúc không gian hợp chất, được xác định bằng hệ trục tọa độ nguyên tử thành phần, bao gồm các TSPT như mô men lưỡng cực (dipole moment), diện tích bề mặt cực (polar surface area), thể tích van der Waals
Bước 3: Xử lí số liệu Để xây dựng được một mô hình QSAR một cách thuận tiện và đảm bảo tính tin cậy, dữ liệu ban đầu cần được xử lí sơ bộ Công việc này có thể bao gồm loại bỏ các giá trị nằm ngoài (outlier), chuẩn hóa đơn vị, chuyển đổi hàm thức (logarit hóa, mũ hóa, nghịch đảo, ) Những công việc này giúp loại bỏ các TSPT gây nhiễu khi xây dựng mô hình
Bước 4: Xây dựng mô hình QSAR
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Cơ sở dữ liệu (CSDL): gồm 93 hợp chất lựa chọn từ dữ liệu trên các bài báo đã được công bố [6, 9, 12, 16, 27, 30]
Bảng 2.1 Giá trị log K p các hợp chất xây dựng mô hình QSAR
- Phần mềm vẽ cấu trúc hóa học: Marvin Sketch 17.27, ChemDraw Pro 8.0
- Phần mềm tính toán TSPT: Dragon 6.0
- Phần mềm xây dựng mô hình QSAR: MobyDigs Professional 1.1
- Phần mềm xử lý số liệu: SPSS 22.0, Excel 2010.
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Tính toán tham số mô tả phân tử
Tham số mô tả phân tử là kết quả của một quá trình toán học và logic chuyển đổi thông tin được mã hóa trong cấu trúc hóa học thành một số có khả năng đặc trưng cho phân tử đấy Để thực hiện tính toán, tất cả các cấu trúc của CSDL được chuyển đổi thành hệ thống đơn giản hóa với đầu vào được biểu diễn dưới dạng dòng SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry System) bằng việc sử dụng phần mềm ChemDraw Pro 8.0 Căn cứ vào các mã code, 3764 mô tả phân tử thuộc họ 0D, 1D và 2D được tính toán bằng phần mềm Dragon phiên bản 6.0 [35]
Tham số mô tả phân tử là một số thu được từ một quá trình toán học và lôgic chuyển đổi thông tin được mã hóa trong cấu trúc hóa học [35] Trong nghiên cứu này, các tham số được tính toán sử dụng phần mềm Dragon [35]
Dragon là một phần mềm được phát triển bởi công ty Talete của Italia vào năm 1993, được sử dụng rất rộng rãi hiện nay trong các nghiên cứu hóa tin và thiết kế thuốc Dragon tính toán được hơn 5000 TSPT khác nhau Các mô tả phân tử thường được phân loại dựa vào chiều thông tin mô tả cấu trúc (i) Tham số 0D mô tả thành phần cấu tạo nên cấu trúc, còn được gọi là các tham số đếm nguyên tử, như số lượng C, N (ii) Tham số 1D mô tả cấu trúc dưới dạng chuỗi, như vân tay cấu trúc (fingerprint), hay số lượng các mảnh cấu trúc, như số lượng nhân thơm, nhóm carboxylic (iii) Tham số 2D mô tả cấu trúc dưới dạng hình học topo, cho phép xác định chính xác thứ tự, vị trí của nguyên tố hay mảnh cấu trúc trong phân tử Các tham số 2D thường được tính toán dựa trên lý thuyết về graph (iii) Tham số 3D mô tả đặc điểm cấu trúc
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU các phương pháp lý thuyết như MoRSE, GETAWAY, tính toán lượng tử, mô tả bề mặt hoặc thể tích phân tử
Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn tham số phân tử 2D để mô tả cấu trúc các hợp chất Bởi so với các mô tả phân tử 3D thì mô tả phân tử 2D không cần tới các thông tin về cấu trúc 3D của phân tử, có tính ổn định cao hơn do các hợp chất được mô tả dưới dạng 3D thường có độ linh động về cấu dạng
2.2.2 Phân chia tập huấn luyện / Tập kiểm tra
Sau khi tính toán mô tả phân tử, 93 chất có trong CSDL được chia ngẫu nhiên thành tập huấn luyện (Tr - training set) và tập kiểm tra (Te – test set)
Tập huấn luyện gồm 77 chất (chiếm 83,8% CSDL) được sử dụng cho việc xây dựng (huấn luyện) mô hình Tập huấn luyện cho phép phát hiện mối quan hệ có khả năng dự đoán Còn tập kiểm tra bao gồm các phân tử mà mô hình chưa bao giờ gặp được sử dụng để đánh giá độ mạnh và khả năng ngoại suy của các mô hình xây dựng được
2.2.3 Xây dựng mô hình QSAR
Xây dựng các mô hình QSAR trên các nhóm chất khác nhau, các đích tác dụng khác nhau cơ bản đều trải qua năm bước được tóm tắt như hình 2.1 [40]
Hình 2.1 Các bước xây dựng mô hình QSAR
Tập huấn luyện gồm 83,8% số hợp chất trong CSDL được lựa chọn ngẫu nhiên để xây dựng mô hình QSAR Các hợp chất còn lại được xếp vào tập kiểm nghiệm để đánh giá mô hình Các mô hình được xây dựng bằng các
Chuẩn bị cơ sở dữ liệu
Tính toán tham số phân tử
Xây dựng mô hình QSAR Đánh giá mô hình QSAR phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính (MLR) sử dụng phần mềm SPSS 22.0, lựa chọn TSPT bằng phương pháp thuật giải di truyền (Genetic algorithm) sử dụng phần mềm MobyDigs Professional 1.1, sau đó đánh giá để lựa chọn mô hình tốt nhất
Lựa chọn tham số phân tử bằng phương pháp thuật giải di truyền sử dụng phần mềm MobyDigs Professional 1.1 Sau đó xây dựng mô hình QSAR trên tập huấn luyện bằng phương pháp MLR sử dụng phần mềm SPSS 22.0 để xác định tương quan hoạt tính ức chế với tham số mô tả phân tử Dragon
Lựa chọn TSPT thích hợp: tất cả các biến không phải được đưa hết vào mô hình Mặc dù việc thêm biến độc lập vào làm tăng hệ số tương quan R 2 , nhưng nó chỉ tốt khi chúng có liên hệ mạnh với biến phụ thuộc Mô hình được chọn ứng với mô hình có Q 2 cao nhất Thực hiện thuật giải di truyền để chọn mô hình có các biến tối ưu bằng phần mềm MobyDigs Professional 1.1
Thuật giải di truyền dựa trên cơ chế của chọn lọc tiến hóa trong tự nhiên: “Trong mọi thế hệ, một tập mới các sinh vật được tạo ra bằng cách lai ghép những nhân tố thích hợp nhất với môi trường của những sinh vật trong thế hệ cũ cùng với sự xuất hiện đột biến ngẫu nhiên của các cá thể trong thế hệ mới” Vận dụng cơ chế này, đầu tiên thuật toán sẽ mã hoá tất cả các tham số của cấu trúc ban đầu trong một nhiễm sắc thế - biểu diễn bằng một vec tơ
Từ nhiễm sắc thể ban đầu này, tạo ngẫu nhiên một quần thể Quần thể này được đánh giá và từ đó các nhiễm sắc thể thích nghi nhất (tức là có hàm mục tiêu Q 2 cao nhất) được chọn làm khung để tạo ra quần thể tiếp theo Quy trình này làm tăng Q 2 của toàn bộ nhiễm sắc thể bằng cách truyền các đặc tính cấu trúc thuận lợi từ một quần thể này sang một quần thể khác Sau một số chu kỳ tìm kiếm và đánh giá, cuối cùng ta sẽ tìm được một nhiễm sắc thể (mô hình) phù hợp với giá trị Q 2 cao nhất
Các bước thực hiện thuật giải di truyền:
(1): Khởi tạo một quần thể ban đầu (file đầu vào được lưu dưới dạng file.mdd chứa các dữ liệu về tên, các mô tả phân tử được tính toán bằng phần mềm Dragon 6.0, giá trị log K p của các hợp chất trong tập huấn luyện)
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
(2): Xác định hàm mục tiêu (fitness) cho mỗi cá thể trong quần thể
Hàm mục tiêu trong nghiên cứu này là giá trị Q 2
(3): Tạo ra quần thể mới bằng cách lai ghép chéo (crossver) từ các cá thể hiện tại có chọn lọc (selection), đồng thời tạo ra các đột biến (mutation) trong quần thể mới theo một xác suất nhất định Quá trình này thực hiện thông qua cài đặt giải thuật di truyền (Genetic Algorithm set up)
(4): Các cá thể trong quần thể mới được sinh ra thay thế cho các cá thể trong quần thể cũ
(5): Nếu điều kiện dừng, giải thuật dừng lại và trả về cá thể tốt nhất cùng với giá trị hàm mục tiêu của nó
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả
3.1.1 Mô hình toán học thu được
Mô hình QSAR là mô hình biểu thị mối liên hệ định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất Mô hình QSAR được biểu diễn dưới dạng một phương trình toán học QSAR sử dụng các TSPT, các kỹ thuật xác suất thống kê và trí tuệ nhân tạo để xây dựng các mô hình QSAR được xây dựng dựa trên giả thuyết là cấu trúc của một phân tử phải chứa những đặc điểm cấu trúc liên quan tới tính chất hóa học, vật lý, sinh học và dựa trên khả năng các mô tả phân tử Bởi các mô hình QSAR, hoạt tính sinh học của một phân tử mới hoặc chưa được kiểm nghiệm có thể được suy ra từ cấu trúc của các hợp chất tương tự trong đó tính chất của chúng đã được kiểm nghiệm[34]
Phương pháp QSAR xây dựng các mô hình toán học nhằm dự đoán hoạt tính của các hợp chất dựa trên cấu trúc hóa học của chúng, là các kỹ thuật nhằm dự đoán các kết quả trước khi các thử nghiệm được tiến hành trong phòng thí nghiệm QSAR cung cấp thông tin dự đoán về kết quả có thể có của một thử nghiệm nào đó và khả năng mới này cung cấp các yếu tố liên quan để thiết lập thứ tự ưu tiên cho một chất mới cho các thử nghiệm[34]
Các mô hình QSAR được xây dựng từ 93 hợp chất trong CSDL Cấu trúc hóa học được trình bày tại phụ lục và giá trị log Kp của 93 hợp chất trong CSDL được trình bày tại bảng 2.1 Sử dụng phần mềm Dragon 6.0 tính toán được 3764 TSPT cho mỗi phân tử trong CSDL Sau khi xử lí loại bỏ TSPT gây nhiễu, 1152 TSPT còn lại được kiểm tra quan hệ phi tuyến với biến đáp ứng log Kp Sử dụng chức năng lựa chọn ngẫu nhiên của phần mềm SPSS 22.0, 77 hợp chất được lựa chọn vào tập huấn luyện, 16 hợp chất còn lại được lựa chọn vào tập kiểm nghiệm Xây dựng các mô hình QSAR trên tập huấn luyện lần lượt bằng các phương pháp MLR, GA thu được kết quả như sau:
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Kết quả mô hình MLR xây dựng được như sau:
Log Kp = -2.49869 - 3.18926 x nR07 - 0.06478 x CATS2D_04_LL - 0.97246 x B03[O-O] + 1.25602 x B06[N-O] - 0.19308 x F02[C-N] + 0.50869 x MLOGP Đơn vị Kp: cm/h
Thông số thống kê của 10 mô hình tốt nhất được tóm tắt trong bảng 3.1
Bảng 3.1 Thông số thống kê của các mô hình QSAR log K p
Ký hiệu mô hình R 2 Q 2 Q 2 ext
Nhận xét: Cả 10 mô hình đều có các thông số R 2 , Q 2 , Q 2 ext thỏa mãn yêu cầu thống kê Trong đó mô hình M2 có độ chính xác và độ bền vững cao với các giá trị R 2 , Q 2 , Q 2 ext cao nhất (đánh giá ngoại tốt), vừa đảm bảo tính chính xác, độ bền vững cao, vừa có kết quả đánh giá ngoại đáng tin cậy
Thông số mô hình M2 tốt nhất:
Ta có R 2 = 0,84 chứng tỏ độ chính xác của mô hình khá cao vượt xa trên mức yêu cầu tối thiểu là 0,6, Q 2 = 0,79 cho thấy mô hình có độ ổn định tốt cũng như khả năng dự đoán nội tốt Khả năng dự đoán ngoại 73,56% cho thấy mô hình có khả năng dự đoán hoạt tính tốt
Như vậy mô hình thoả mãn các tiêu chí đánh giá nội và ngoại về độ chính xác, độ ổn định và khả năng dự đoán tốt
3.1.3 Đánh giá mô hình theo 5 tiêu chí của OECD
Tiêu chí 1: Có đích cụ thể
Mục đích của tiêu chí này để đảm bảo mô hình QSAR xây dựng nhằm dự đoán một giá trị cụ thể log Kp trên một tác dụng, hoạt tính cụ thể, trong một điều kiện cụ thể Áp dụng đánh giá: Các mô hình được xây dựng nhằm dự đoán giá trị log Kp thể hiện khả năng thẩm thấu qua da của các chất dựa trên cấu trúc phân tử, với đơn vị của giá trị Kp là cm/h
Tiêu chí 2: Thuật toán rõ ràng
Tiêu chí này nhằm đảm bảo mô hình QSAR được xây dựng dựa trên một thuật toán cụ thể Tính lặp lại cuả mô hình phụ thuộc vào điều kiện này
Một số mô hình mang tính chất thương mại hóa không được công bố thuật toán sử dụng Tuy nhiên, đây có thể trở thành vấn đề rào cản pháp lý bởi kết quả của mô hình không thể được công bố độc lập mà không có thuật toán trình bày cụ thể Áp dụng đánh giá: Các TSPT tính toán bởi phần mềm Dragon 6.0 được liệt kê và định nghĩa đầy đủ Các mô hình được xây dựng bằng thuật toán MLR Thuật toán này là thuật toán thống kê thường quy được áp dụng phổ biến trong xây dựng các mô hình QSAR
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Tiêu chí 3: Miền cấu trúc ứng dụng xác định Để đạt được khả năng dự đoán tốt trong sàng lọc ảo, việc xác định được miền ứng dụng của mô hình QSAR là vô cùng cần thiết Miền ứng dụng là khoảng không gian cấu trúc bao gổm trong mô hình Chỉ những dự đoán đối với các hợp chất có cấu trúc nằm trong miền cấu trúc này mới đáng tin cậy
Miền ứng dụng được xây dựng dựa trên mối quan hệ giữa phần dư chuẩn (Standardized Residual) và giá trị “đòn bẩy” (Leverage) (ký hiệu là h) tính được cho từng hợp chất Biểu đồ dưới đây (Hình 3.1) cho thấy mối quan hệ giữa phần dư chuẩn và giá trị h Chỉ số h cho biết một chất có ảnh hưởng tới không gian cấu trúc của biến như thế nào Giá trị giới hạn của h gọi là h*, h* là một ngưỡng quan trọng để tham chiếu các dự đoán bởi mô hình QSAR cho hợp chất trong Tr và Te được tính toán theo công thức: h* = 3p/N, trong đó p là số biến độc lập trong mô hình (3.1), N là số lượng quan sát trong tập huấn luyện Miền ứng dụng được xác định là phần giới hạn bởi khung vuông ± 3 phần dư chuẩn đối và h* bằng 0.6
Standerized residuals (Te) Standerized residuals (Tr)
Stan d er iz e d R es idua ls
Hình 3.1 Miền ứng dụng của mô hình QSAR đối với các chất Áp dụng đánh giá: Sau khi tính toán tập huấn luyện, ta thấy 77/77 hợp chất đều nằm trong miền ứng dụng Với tập kiểm tra, toàn bộ 16 hợp chất đều nằm trong miền ứng dụng, do đó có thể thấy các dự đoán của mô hình đối với tập kiểm tra là hoàn toàn đáng tin cậy
Tiêu chí 4 : Có thước đo phù hợp để đánh giá độ chính xác, độ bền vững, khả năng dự đoán Đây là tiêu chí chung, có tính chất bao hàm một số tiêu chí khác Các giá trị R 2 , Q 2 và khả năng dự đoán nội, khả năng dự đoán ngoại, chính là những thước đo phù hợp và phổ biến để đánh giá chất lượng mô hình QSAR được các nhà nghiên cứu QSAR đề xuất sử dụng Áp dụng đánh giá: Từ kết quả đã trình bày, các mô hình xây dựng được không chỉ đạt yêu cầu thống kê, đảm bảo tính chính xác và bền vững (R 2 0.8438, Q 2 = 0.7894) mà còn có độ chính xác dự đoán nội, dự đoán ngoại cao (Q 2 ext =0.7356)
Tiêu chí 5 : Giải thích cơ chế tác dụng nếu có thể Đây là tiêu chí không bắt buộc Theo quan điểm của các nhà nghiên cứu QSAR, không phải bao giờ mô hình QSAR cũng đưa ra được một hay nhiều cơ chế tác dụng Điều này không có nghĩa là mô hình đó không có khả năng ứng dụng Tiêu chí này đưa ra không phải để loại bỏ các mô hình không chỉ rõ cơ chế tác dụng, mà chỉ nhằm đảm bảo nếu mô hình có chỉ ra được cơ chế tác dụng cụ thể nào đấy, thì cơ chế này cần được chỉ ra cùng với sự công bố của mô hình Áp dụng đánh giá: Mục tiêu của nghiên cứu này là xây dựng các mô hình QSAR dự đoán khả năng thẩm thấu qua da dựa trên cấu trúc phân tử, không nhằm mục đích phân tích cơ chế tác dụng.
Bàn luận
QSAR hiện nay đang là một kỹ thuật được ứng dụng trong rất nhiều các lĩnh vực như dược phẩm, y học, hóa học… Kỹ thuật này sử dụng các TSPT, các kỹ thuật xác suất thống kê và trí tuệ nhân tạo để xây dựng các mô
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU chọn tham số phân tử bằng giải thuật di truyền Phương pháp này giúp tối ưu hóa mô hình nhằm tìm ra mô hình biểu thị tốt nhất mối quan hệ giữa biến đáp ứng là các tham số phân tử [34]
Từ mô hình xây dựng được chúng ta có thể giảm được tôi đa thời gian cũng như chi phí trong việc nghiên cứu và phát triển thuốc Dựa trên CSDL các hợp chất đã được công bố, có thể nhanh chóng tìm ra các hợp chất phù hợp cho mục tiêu nghiên cứu tiếp theo
Bên cạnh đó xây dựng mô hình QSAR còn môt số hạn chế như CSDL thu thập được từ nhiều bài báo khác nhau, do đó có thể gặp sai số trong xây dựng mô hình QSAR; việc giải thích các biến TSPT đôi khi gặp phải khó khăn vì cơ chế của chúng phức tạp đòi hỏi những hiểu biết chuyên sâu về hóa lượng tử; bên cạnh đó chưa có nhiều tài liệu tham khảo, do đó chưa đủ cơ sở để giải thích
Nhược điểm của phương pháp này là khai thác mối tương quan tuyến tính giữa cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học của các hợp chất, nhưng đôi khi sự tương quan đó không phải là tuyến tính (đường thẳng) mà nó có thể phi tuyến tính Đã có một số nghiên cứu khai thác mối tương quan phi tuyến tính về tính thấm qua da và đã thu kết quả tương đối tốt
Trên thế giới, mặc dù đã có nhiều nghiên cứu liên quan QSAR về khả năng thẩm thấu qua da dựa trên cấu trúc phân tử nhưng theo các tài liệu thu thập được, lần đầu tiên tại Việt Nam, các mô hình QSAR dự đoán khả năng thẩm thấu qua da dựa trên cấu trúc phân tử được xây dựng và đánh giá Các mô hình này đảm bảo tính chính xác, bền vững và khả năng dự đoán tốt đồng thời thỏa mãn các tiêu chí bắt buộc do Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế thế giới (OECD) đã đề ra để đánh giá mô hình QSAR
3.2.2 Về kết quả của thu được
Mô hình log K p thu được sau quá trình tính toán:
Log Kp = -2.49869 - 3.18926 x nR07 - 0.06478 x CATS2D_04_LL - 0.97246 x B03[O-O] + 1.25602 x B06[N-O] - 0.19308 x F02[C-N] + 0.50869 x MLOGP
Mô hình QSAR có sự tham gia của 6 biến, là các tham số phân tử 2D
Tham số phân tử 2D biểu diễn các cấu trúc theo kích thước, độ phân nhánh, và hình dạng tổng thể Các tham số phân tử 2D trong mô hình bao gồm: nR07; CATS2D_04_LL; B03[O-O]; B06[N-O]; F02[C-N]; MLOGP.Trong đó:
nR07: Số vòng 7 cacbon có trong hợp chất
CATS2D_04_LL: CATS2D Lipophilic-Lipophilic tại khoảng cách tôpô
B03[O-O]: Sự hiện diện / vắng mặt của liên kết O-O tại khoảng cách tôpô 3
B06[N-O]: Sự hiện diện / vắng mặt của liên kết N-O tại khoảng cách tôpô 6
F02[C-N]: Tần số C - N ở khoảng cách tôpô 2
MLOGP: Hệ số phân chia octanol – nước Moriguchi
Các dấu (+) ở TSPT B06[N-O] và MLOGP thể hiện sự có mặt nhiều liên kết N-O và hệ số phân chia octanol – nước Moriguchi sẽ làm tăng khả năng thẩm thấu qua da của hợp chất Nhưng hệ số của TSPT MLOGP là trung bình (0.50869) nên sẽ không là yếu tố quyết định làm thay đổi đến log Kp cũng như kết quả của mô hình
Các dấu (-) ở các TSPT còn lại nR07, CATS2D_04_LL, B03[O-O], F02[C-N] cho thấy biến gắn với tham số âm làm ảnh hưởng ngược chiều tới giá trị log Kp.Số liên kết N-C với hệ sô nhỏ (-0.19308) ảnh hưởng ít nhất lên tính thấm, trong khi đó hợp chất có vòng chứa 7 carbon với hệ số rất cao (- 3.18926) dường như có ảnh hưởng mạnh nhất lên tính thấm của một hợp chất Điều này có thể được giải thích một phần thông qua khả năng phân cực, các vòng thơm thường có mật độ electron cao, dễ gây phân cực trong phân tử, bản chất màng phospholipid của da là không phân cực nên các hợp chất này sẽ khó có thể đc thẩm thấu qua màng Trong khi đó hệ số phân bố dầu nước Log
K p lại là một chỉ số của khả năng thân dầu, một hợp chất có tính thân dầu sẽ
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
3.2.3 So sánh với các mô hình khác trên thế giới
Nghiên cứu đã đánh giá mô hình xây dựng được theo các nguyên tắc của OECD với R 2 =0.84, Q 2 = 0.79 và khả năng dự đoán ngoại 73,56% Như vậy mô hình thoả mãn các tiêu chí đánh giá nội và ngoại về độ chính xác, độ ổn định và khả năng dự đoán tốt
So với các mô hình khác trên thế giới thì lượng hợp chất trong CSDL nghiên cứu tương đối lớn, nhiều hơn so với hầu hết các mô hình đã được nghiên cứu và công bố trước đây thể hiện qua bảng 1.2 [6, 25, 27] Điều đó cho thấy được tính khái quát của mô hình, cũng như khả năng dự đoán đối với nhiều hợp chất hơn Khả năng dự đoán ngoại 73,56% cũng đã cho thấy được điều đó Có thể áp dụng để phát triển mô hình trong các nghiên cứu thuốc điều trị qua da, điều trị tại chỗ, các hóa mỹ phẩm,…
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu đã trình bày trên đây chúng tôi rút ra các kết luận sau:
Nghiên cứu đã xây dựng thành công mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc và khả năng thẩm thấu qua da dựa trên 93 hợp chất có trong CSDL:
Với R 2 =0.84, Q 2 = 0.79 và khả năng dự đoán ngoại 73,56% Như vậy mô hình thoả mãn các tiêu chí đánh giá nội và ngoại về độ chính xác, độ ổn định và khả năng dự đoán Mô hình xây dựng được hoàn toàn phù hợp các nguyên tắc của OECD và có tính ứng dụng cao
So với các mô hình khác trên thế giới thì lượng dữ liệu là khá lớn, lớn hơn hầu hết các mô hình nghiên cứu trước đây Do đó, mô hình sẽ có tính ứng dụng và khái quát cao hơn
KIẾN NGHỊ Để tiếp tục phát triển các kết quả nghiên cứu của khóa luận xây dựng mô hình toán học dự đoán khả năng thẩm thấu qua da dựa trên cấu trúc phân tử, chúng tôi xin đưa ra các đề xuất sau:
