TỔNG QUAN
Khái niệm liposome
Liposome thuộc hệ điều trị cao hơn của dạng thuốc kiểm soát giải phóng - hệ mang thuốc hướng đích (targeted drug delivery system) có cấu trúc hình cầu đơn hay đa lớp kép cấu tạo gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn nanomet [3,4]
Thành phần chính của liposome là phospholipid và cholesterol Đây là những chất tương hợp sinh học với cơ thể, có thể phân giải được trong cơ thể nên có ưu việt trong ứng dụng làm chất mang thuốc [3,4,54]
Trong lĩnh vực Dược, liposome được ứng dụng làm hệ mang thuốc và mô hình tế bào nhân tạo Khi sử dụng liposome làm chất mang thuốc, dược chất có thể phân bố trong khoang nước của liposome, phân bố giữa lớp phospholipid kép, tương tác và gắn với đầu không phân cực của phân tử phospholipid hoặc hấp phụ trên bề mặt của lớp phospholidpid kép tùy thuộc vào đặc tính thân dầu nước của dược chất và tương tác hóa lí giữa dược chất với lớp phospholipid kép (hình 1.2) [5,30,43,54]
Hình 1.2: Các cách mang dược chất của liposome: 1- Dược chất trong khoang nước 2- Dược chất nằm giữa lớp lipid kép 3- Dược chất gắn vào đầu phân cực của phospholipid 4- Dược chất liên kết với lớp lipid kép 5- Dược chất liên kết với đầu không phân cực của phân tử phospholipid 6- Dược chất hấp phụ trên bề mặt lớp lipid kép.
Một số dược chất chỉ ổn định trong một số điều kiện nhất định, tuy nhiên môi trường ổn định nhất cho dược chất đôi khi lại không thích hợp với cơ thể do đó làm giảm khả năng điều trị của dược chất Liposome được dùng làm chất mang thuốc do liposome có thể bao gói bên trong lớp lipid kép môi trường tối ưu cho sự ổn định của dược chất nhưng lại được phân tán trong một môi trường có điều kiện tương tự điều kiện sinh lý của cơ thể Do đó liposome được coi là một trong những hệ mang thuốc lý tưởng [24,26,30].
Phân loại
+ Liposome đơn lớp (ULV: Unilamellar vesicle): Vỏ chỉ có một lớp phospholipid
Tùy theo kích thước mà có 4 loại: Loại nhỏ SUV (Small Unilamellar Vesicle) SUV có đường kính từ khoảng 20-50 nm, loại to LUV (Large Unilamellar Vesicle) có đường kính trên 50 nm, loại khổng lồ GLV (Giant Unilamellar Vesicle) có đường kính trên 1000 nm[4,43]
+ Liposome đa lớp (MLV: multilamellar vesicle): Cấu tạo gồm nhiều lớp lipid và nhiều ngăn nước đồng tâm, kích thước 400 - 3.500 nm Gồm 3 loại: OLV (Oligo Lamellar Vesicle) có ít hơn 5 lớp lipid kích thước 100-1000 nm, MLV có 5-25 lớp lipid kích thước trên 500 nm, MVV (Multi Vesicular Vesicle) cấu trúc liposome kép (liposome trong liposome) [4,43]
Hình 1.3: Phân loại liposome dựa trên kích thước và cấu trúc số lớp phospholipid
1.2.2 Phân loại theo thành phần cấu trúc lớp vỏ
Liposome quy ước: là loại liposome được tạo thành từ các phospholipid khác nhau, cholesterol và có thể có các lipid khác nhưng không có sự thay đổi nào trên bề mặt liposome
Nhược điểm: thời gian tồn tại ngắn trong hệ tuần hoàn do dễ bị liên kết protein và bị các tế bào trong hệ thống miễn dịch bắt giữ, khả năng hướng đích kém do cơ chế thụ động, có nguy cơ giải phóng dược chất vào các tế bào bình thường [8,25]
Liposome biến đổi: nhằm khắc phục nhược điểm của liposome qui ước, các nhà khoa học đã nghiên cứu thay đổi cấu trúc của liposome để tăng cường hiệu quả mang thuốc hơn Một liposome mang thuốc hiệu quả phải đạt được các yêu cầu sau:
• Hiệu suất mang thuốc phải cao và ổn định
• Tồn tại lâu trong hệ tuần hoàn
• Có khả năng thoát khỏi lòng mạch máu tại vị trí bị bệnh để đi vào mô bệnh
• Kiểm soát được khả năng giải phóng thuốc vào trong tế bào Để cải thiện sự lưu thông trong hệ tuần hoàn cũng như là đưa, phân phối thuốc hướng đích, bề mặt liposome được thay đổi bằng việc đưa thêm polymer thân nước PEG, các phối tử hướng đích (targeting ligand) như protein, chuỗi peptide, kháng thể đơn dòng, để đạt mục tiêu hướng đích chủ động [35,54]
Bảng 1.1 : Một số phân loại liposome theo thành phần cấu trúc lớp vỏ
Liposome quy ước PL tự nhiên hoặc PL điện tích âm kết hợp với cholesterol
Liposome nhạy cảm với pH
PL được sử dụng như DOPE (dioleoylphosphatidyl ethanolamin)
Lipid tích điện dương bề mặt với DOPE
Liposome tuần hoàn dài Bề mặt được bao bởi polymer thân nước
Bề mặt liposome gắn kháng thể hoặc các nhóm hướng đích có khả năng nhận biết và liên kết với tế bào đích
Có thể phân loại liposome biến đổi theo mục đích bào chế gồm các loại [8,54,55]:
+ Liposome tuần hoàn lâu trong máu (tuần hoàn dài) (Long-circualating liposome): Liposome loại này có bề mặt bao phủ một lớp polyme thân nước, tương hợp sinh học nhằm tạo ra một lớp áo bảo vệ cho liposome tránh khỏi sự nhận diện của quá trình opsonin hóa và do đó làm giảm khả năng thải trừ liposome khỏi hệ tuần hoàn PEG là polyme hay được sử dụng để tạo ra liposome tuần hoàn dài trong máu [7,12, 22, 28,59]
+ Liposome mi n dịch (Immuno liposome): Bề mặt liposome được gắn lên các phân tử có khả năng nhận biết và liên kết với tế bào đích (các nhóm nhận đích - target ligand) Các chất hướng đích đầu tiên được sử dụng là các kháng thể IgG nên liposome này được gọi là liposome miễn dịch Hiện nay đã phát triển thêm nhiều nhóm nhận đích khác mà không phải là các kháng thể nên các liposome đều gọi tên theo nhóm hướng đích được gắn tuy nhiên vẫn được xếp vào loại liposome miễn dịch như: liposome hướng receptor folate, liposome hướng receptor tranferin [12,
+ Liposome mi n dịch tuần hoàn dài (Long-circualating Immunoliposome): Đây là loại liposome kết hợp các ưu điểm của liposome tuần hoàn dài và liposome miễn dịch nhằm cải tiến hơn nữa khả năng mang thuốc tới đích của liposome Đặc điểm cấu tạo của liposome này s có lớp áo polyme bảo vệ ở bên ngoài và các chất hướng đích s được gắn vào đuôi các phân tử polyme bảo vệ hoặc gắn lên vỏ liposome [22,
Hình 1.4: Các dạng liposome biến đổi
Ngoài ra còn một số dạng của liposome đó là:
+ Liposome cảm ứng (sensitive liposome): Là các liposome trong thành phần cấu tạo có chứa một tỉ lệ các chất có khả năng thay đổi cấu trúc vật lý hoặc hóa học dưới các điều kiện đặc biệt, có thể là các phospholipid đặc biệt hoặc các polyme có khả năng bị phân giải cấu trúc về mặt vật lý hoặc hóa học khi nhận được tín hiệu kích thích tại mô đích Tác nhân gây kích thích có thể là thuộc tính đặc trưng tại mô bị bệnh như pH, tác nhân oxy hóa khử, tác nhân phân giải cấu trúc tại môi trường mô bệnh (tác nhân nội) hoặc có thể là do tác động từ bên ngoài như siêu âm, điện từ trường, nhiệt độ (tác nhân ngoại) như: a/ Liposome nhạy cảm nhiệt độ (temperature sensitive liposome): thành phần phospholipid như phosphatidyl ethanolamine, dioleoyl phosphatidyl ethanolamine liposome nhạy cảm với nhiệt độ nhanh chóng giải phóng dược chất khi nung nóng đến 41,3 o C và do đó có khả năng nhắm mục tiêu phân phối hóa trị liệu toàn thể cho mô tế bào khi kết hợp với chứng tăng thân nhiệt [11,18,35,47] b/ Liposome từ tính (magnetic liposome): bề mặt liposome được bao bởi một lớp vỏ polymer có gắn các hạt nano từ tính như oxit sắt Fe 3 O 4 hay sắt dạng oxi hóa như γ-
Fe 2 O 3 Trong một từ trường thay đổi, thay đổi hướng ngẫu nhiên từ hướng song song sang hướng đối cực, cho phép chuyển năng lượng từ thành dạng nhiệt, do đó làm tăng nhiệt độ tại các mô khối u Các mô tại khối u thường nhạy cảm với sự gia tăng nhiệt độ hơn các mô lành, vì thế đây là một hướng điều trị ung thư mới [10,12] c/ Liposome nhạy cảm pH (pH sensitive liposome) : là những liposome có thành phần phospholipid như DOPE, có khả năng hoạt động trong môi trường pH thấp như ở mô khối u khoảng 5,5 [6,8,35,47]
Ngoài ra còn một số dạng của liposome đó là:
+ Liposome tích điện dương (cationic liposome): có khả năng liên hợp với tế bào, màng tế bào, thích hợp dùng làm hệ phân phối thụ động các đại phân tử tích điện như DNA, RNA [35,47]
+ Lipoplexes: gồm phospholipid cationic liên kết với AND (lipofectin) để chuyển gen, điều trị bệnh về gen, không bền và độc ở liều cao [35,47]
+ Virosome: dùng vỏ virus làm chất mang đóng vai trò như một vaccin tạo đáp ứng miễn dịch cho cơ thể [6,8]
+ Proliposome: là liposome ở dạng bột đông khô, khi dùng thêm pha nước hydrat hóa tạo hỗn dịch liposome [47]
+ Ethosome: ngoài thành phần phospholipid còn chứa tỷ lệ lớn alcol (ethanol, isopropanol), bào chế với mục đích tăng thấm thuốc qua da [47]
+ Liposome linh động (flexible liposome): là liposome đơn lớp nhỏ, được bào chế từ phosphatidylcholin với sự có mặt của chất diện hoạt (Tween 80, muối mật, natri cholat,…) và ethanol, có tác dụng tăng thấm thuốc qua da, được ứng dụng nhiều trong mỹ phẩm Liposome linh động có khả năng thấm qua lớp sừng còn được gọi là transferosome [47]
+ Niosome: sử dụng chất diện hoạt không ion hóa thay cho phospholipid như
Span 80, Span 60, Tween 80, Độ ổn định có thể cao hơn, hiệu suất gắn dược chất cao hơn, rẻ tiền hơn so với liposome Niosome gần đây được phát triển như một chất mang thuốc tương tự liposome, cải thiện sinh khả dụng cho các dược chất ít tan, thấm kém, tăng độ ổn định cho các dược chất kém bền [35]
+Arsonoliposome: là dạng liposome sử dụng arsonolipid thay cho phospholipid, dùng trong điều trị ung thư và diệt ký sinh trùng vì khả năng tăng độc tính với tế bào ung thư và đơn bào [35].
Thành phần cấu tạo liposome
Phospholipid (PL) có nhiều trong cơ thể của động vật và thực vật, có nhiều trong dầu thực vật (đậu nành, hạt bông, hạt hướng dương, hạt cải…) và các mô động vật (lòng đỏ trứng, não bò…) PL là loại lipid chứa phospho, một đầu phân cực, một đầu không phân cực nên nó có khả năng tự tạo thành lớp màng kép trong môi trường nước PL là nguyên liệu tách chiết từ tự nhiên hoặc tổng hợp, có cấu trúc tương đồng sinh học với tế bào sống, do đó an toàn, tăng khả năng vận chuyển thuốc, dễ xâm nhập vào các tổ chức đích PL là thành phần chính của liposome
Mục tiêu trong bào chế là sử dụng PL làm hệ mang thuốc có đặc tính tương hợp cao với mô và tế bào, vì vậy sự hình thành các dạng chất mang từ PL có ý nghĩa quan trọng để có thể mang thuốc và ổn định trong quá trình vận chuyển thuốc.Tính lưỡng thân mang lại cho phospholipid sự tự hình thành, khả năng nhũ hoá và thấm ướt
Khi tiếp xúc với dung dịch nước, phần thân nước được hydrat hoá, phần “đuôi” có xu hướng thu nhỏ lại, tạo thành kết tụ kiểu micel (hình 1.1) [3,4,7,12]
Ngoài phospholipid, thành phần không thể thiếu được trong liposome là các phân tử sterol Các sterol là thành phần rất quan trọng trong màng tế bào tự nhiên, vì vậy khi đưa vào liposome mang lại sự thay đổi về đặc tính rất lớn cho chất mang
Cholesterol (CHOL) có vai trò tăng độ cứng, giảm tính thấm của màng (giúp tránh rò rỉ DC trong thời gian bảo quản) và tăng khả năng chịu áp lực thẩm thấu của màng lipid kép CHOL đã được chứng minh trước đây có tính chất chống oxy hóa trong màng sinh học và liposome gián tiếp qua cơ chế dehydrat làm giảm độ ẩm của lớp màng kép, do đó làm giảm hàm lượng nước trong màng khiến suy giảm lượng ion H+ và OH-, dẫn đến làm giảm trực tiếp phản ứng thủy phân PL [8,25,57]
Sara Zalba và các cộng sự (2012) đã nghiên cứu vai trò của CHOL trong cả 3 phương pháp bào chế liposome Oxaliplatin khác nhau là: tráng phim, đông khô và bốc hơi pha đảo Các sterol tăng sự ổn định của màng, hiệu suất gắn Oxaliplatin của liposome có sử dụng CHOL cao hơn 10% so với không sử dụng CHOL trong thành phần vỏ Tuy nhiên, việc giải phóng thuốc trong môi trường tế bào diễn ra chậm hơn khi có mặt CHOL Ngoài ra, các liposome có CHOL cũng có giá trị PDI cao hơn các liposome không có CHOL trong công thức thành phần [56]
Lượng CHOL dùng trong công thức liposome phụ thuộc chủ yếu vào mục đích áp dụng Với tỷ lệ CHOL cao (trên 40%), liposome không liên kết được với phân tử DNA và khó tương hợp được với màng, do vậy không phù hợp với hệ phân phối gen trị liệu Khi thiết kế công thức liposome, thường căn cứ vào tỷ lệ mol giữa các thành phần lipid phối hợp với nhau và giữa dược chất với tổng lipid Liposome thường áp dụng cho hệ mang thuốc với hàm lượng DC không quá cao do nồng độ lipid trong hệ phân tán là có giới hạn, nên giới hạn khả năng mang thuốc [3,4,6,51].
Phương pháp bào chế
Do Bangham [14] đưa ra từ năm 1964, với các bước tiến hành:
- Tạo film: Hoà tan hỗn hợp lipid trong dung môi thích hợp Thường sử dụng tỷ lệ
10-20 mg lipid/1ml dung môi, bốc hơi dung môi bằng thiết bị phù hợp để tạo thành màng mỏng lipid Thường dùng thiết bị cất quay chân không để loại dung môi (có thể thu hồi dung môi) hoặc đông khô lipid vào từng lọ nhỏ Thời gian cất quay để bốc hơi dung môi không chỉ nhằm mục đích làm khô lipid mà với DC thân dầu (nằm ở lớp lipid kép của liposome) thì DC thường được phối hợp và hoà tan vào dung môi hữu cơ cùng với các lipid Như vậy quá trình bốc hơi dung môi cũng tạo điều kiện cho DC liên kết với lipid
- Hydrat hoá: hydrat hoá lipid với nước hoặc dung dịch đệm ở nhiệt độ và thời gian thích hợp kết hợp quay tốc độ cao tăng hòa tan để tạo thành hỗn dịch liposome
Quá trình hydrat hóa nên được tiến hành ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ chuyển pha của lipid T c khoảng 10 o C nhằm đảm bảo tính linh động trong quá trình sắp xếp hệ mang thuốc, thông thường từ 50 – 60 o C Thời gian hydrat hoá phụ thuộc vào loại phospholipid Thời gian đầu (khoảng 1 giờ) phải lắc hoặc quay với tốc độ cao, sau đó lắc hoặc quay tốc độ thấp hơn trong thời gian từ vài giờ
Môi trường hydrat hoá tuỳ theo loại PL và mục đích mang thuốc có thể là nước, dung dịch natri clorid 0,9%, dung dịch đệm (citrat, phosphat, Hepes…), dung dịch đường (glucose,dextrose, sucrose…) Áp suất thẩm thấu của dung dịch đệm thường lựa chọn tương đồng với máu (290 mOsm/kg) để có thể ứng dụng vào in vivo Môi trường hydrat hoá có thể chứa muối, chất ổn định, dược chất, [14,20,43]
Liposome bào chế bằng phương pháp hydrat hoá màng mỏng thường có kích thước lớn và đa lớp Một số PL không có khả năng hydrat cao như phosphatidyl ethanolamin, dễ bị kết tụ lại tạo thành các liposome đa lớp nên cần có biện pháp khuấy trộn phù hợp Với phương pháp hydrat hoá film cần công đoạn tiếp theo là giảm và đồng nhất kích thước.
Hình 1.5: Sơ đồ quá trình bào chế liposome bằng phương pháp hydrat hóa màng film
1.4.2.1 Phương pháp tiêm etanol Được Batzri và Korn mô tả năm 1973, còn được gọi là phương pháp pha loãng ethanol hay tiêm ethanol Quy trình bào chế gồm các bước: hòa tan phospholipid và các thành phần tạo màng vào ethanol, bơm nhanh dung dịch này vào môi trường nước cất hoặc hệ đệm TRIS - HCl, kết hợp khuấy trộn Do thay đổi dung môi s tạo thành các SUV có kích thước khoảng 25 nm Sử dụng siêu lọc để loại ethanol và tinh chế liposome Liposome thu được có kích thước nhỏ (30-110 nm) khá đồng nhất mà không phải trải qua quá trình siêu âm Ưu điểm của phương pháp này dung môi không quá độc như etanol và dễ dàng mở rộng quy mô [3,4,8,21,42]
Hòa tan dược chất trong nước, đun cách thủy để duy trì nhiệt độ khoảng 55 –
65 o C Hòa tan các thành phần tạo màng liposome vào ete hoặc dietyl ete/ metanol
Bơm từ từ dung dịch ete vào dung dịch nước từ phía đáy, khi tiếp xúc với pha nước, ether s bốc hơi dưới áp suất giảm tạo thành liposome không đồng nhất có kích thước 200 – 1000 nm Phương pháp tiến hành nhanh nhưng hiệu suất tạo liposome thấp, dược chất phải tiếp xúc với nhiệt độ và dung môi, có thể ảnh hưởng tới độ ổn định của chế phẩm [41,42,43]
1.4.3 Phương pháp bốc hơi pha đảo (Reverse – phase evaporation method)
Phương pháp bốc hơi pha đảo sử dụng các dung môi hữu cơ như diethyl ete / isopropyl ete hoặc hỗn hợp của diethyl ete: chloroform (1: 1 v/v) và hỗn hợp của chloroform: methanol (2: 1 v/v) hòa tan phospholipid Tiến hành bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm Hòa tan trở lại hỗn hợp các thành phần bằng một dung môi không trộn lẫn được với nước Để tạo mixel đảo, thêm pha nước và siêu âm trong khoảng thời gian thích hợp cho đến khi tạo thành hệ phân tán dạng nhũ tương nước trong dầu Các mixel đảo có cấu trúc gồm phospholipid đơn lớp bao quanh nhân nước Sau đó, bốc hơi từ từ dưới áp suất giảm để loại dung môi hữu cơ, khi đó các mixel sát nhập vào nhau, hệ chuyển sang trạng thái gel Tiếp tục quá trình bốc hơi dung môi, khi đạt tới điểm giới hạn, trạng thái gel bị bẻ gẫy, các mixel bị phá vỡ phospholipid tái sắp xếp tạo cấu trúc lipid kép và hình thành liposome Ưu điểm chính của phương pháp này là tỷ lệ đóng gói dược chất cao, phù hợp để bào chế liposome mang các chất có cấu trúc phân tử cồng kềnh, kích thước lớn như albumin Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là tạo ra các liposome có kích thước lớn, không đồng nhất, trong quá trình bào chế sử dụng nhiều dung môi hữu cơ, cần có biện pháp loại và kiểm soát dung môi tồn dư và những khó khăn để mở rộng quy mô [42,60]
Hình 1.6: Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo
1.4.4 Phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn (supercritical reverse phase evaporation method)
Chất lỏng siêu tới hạn là chất lỏng không ngưng tụ, rất dày đặc ở nhiệt độ và áp suất nhất định bằng hoặc vượt quá điểm tới hạn Khi đó sự khác biệt giữa pha lỏng và pha khí không tồn tại, pha lỏng và pha khí nằm cân bằng tạo thành một pha duy nhất- chất lỏng siêu tới hạn Chất lỏng siêu tới hạn có nhiều đặc tính khác biệt so với các chất lỏng truyền thống Đáng chú ý là carbon dioxide siêu tới hạn (scCO 2 ) là một chất thay thế dung môi hữu cơ với những ưu điểm như chi phí thấp, không độc và không dễ cháy, nhiệt độ và áp suất tương đối thấp (31°C và 73,8 bar) với các tính chất hòa tan tương tự như các dung môi không phân cực
Năm 2001, Otake và các cộng sự [16] lần đầu tiên đưa phương pháp bào chế bằng phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn sử dụng scCO 2 làm dung môi để hòa tan lipid Nhiệt độ tăng lên để đạt được cả nhiệt độ chuyển pha của phospholipids và nhiệt độ siêu tới hạn của CO 2 Áp suất cũng được giữ trên giá trị siêu tới hạn Sau vài giây để đạt được cân bằng, một dung dịch nước của dược chất được đưa vào trong bình chịp áp suất lớn qua bơm cao áp ( bơm HPLC), cho đến khi đạt được đủ dung dịch Cuối cùng, áp suất giảm xuống để giải phóng CO 2 và sự phân tán liposome đồng nhất được hình thành [10,16,20,32,60]
Hình 1.7: Hệ thống phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn
Ngoài ra còn có thể bào chế liposome theo một số phương pháp khác:
- Phương pháp đông khô (freeze –dryzing/ lyophylization method) [14,39,42,60]
- Phương pháp dùng chất diện hoạt không ion hóa (niosome) [39,42,43,60]
- Phương pháp màng tiếp hợp (membrane contactor method) [39,42,43,60]
- Phương pháp loại nước và bù nước (dehydration and rehydration) [41,43,60].
Ảnh hưởng của đặc tính tiểu phân đến tới chất lượng liposome
1.5.1.1 Ảnh hưởng của KTTP đến tác dụng
Kích thước tiểu phân là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lưu thông trong tuần hoàn máu, sự tích tụ tập trung tại mô (hiệu ứng EPR), ngoài ra còn ảnh hưởng đến quá trình phóng thích thuốc, động học invivo giải phóng thuốc của liposome do đó ảnh hưởng tới tác dụng sinh học, hiệu quả đưa thuốc tới đích cũng như hiệu quả lâm sàng Seynhaeve A.L và các cộng sự, đã nghiên cứu hiệu quả điều trị khối u rắn đã nhận thấy liposome có kích thước gần
100 nm có khả năng tập trung vào khối u rắn hơn 5-6 lần khi sử dụng liposome kích thước 400 nm Ngoài ra liposome có kích thước nhỏ hơn 200 nm có khả năng lưu hành máu lâu hơn liposome kích thước lớn [6,21,54,57,58]
1.5.1.2 Ảnh hưởng của KTTP đến độ ổn định Độ ổn định của liposome giảm theo sự tăng kích thước, tối ưu với kích thước từ 80 đến 200 nm[17,46] do kích thước tiểu phân nhỏ dẫn đến động năng nhỏ, không đủ lớn để vượt qua hàng rào năng lượng (lực đẩy), ngăn cản các tiểu phân không tiến lại gần nhau Mặt khác theo phương trình Stock thì tốc độ sa lắng tỉ lệ thuận với bình phương bán kính do đó tiểu phân kích thước lớn xu hướng tập hợp, liên hợp lại tạo thành hệ không ổn định Các liposome kích thước lớn hơn 400 nm s nhanh chóng bị hệ thống thực bào đơn nhân và hệ thống RES nhận biết và loại bỏ Để đạt sự phóng thích thuốc vào khối u hiệu quả do hiệu ứng EPR [23,50,58] và cũng lưu hành trong máu lâu hơn thì kích thước liposome nên nhỏ hơn 200 nm [36,58] Các nghiên cứu chỉ ra rằng các hạt có đường kính khoảng 80 - 120 nm là phù hợp nhất để thu được chế phẩm chống khối u hiệu quả, có độ ổn định tốt, duy trì nồng độ thuốc đến đích, ngăn ngừa sự rò rỉ thuốc tới các mô lành xung quanh [17,43,53,57,58]
Hình 1.8: Sự giải phóng thuốc khi có một kích thích bên ngoài với cấu trúc đa lớp và đơn lớp
Liposome với cấu trúc đa lớp MLV không được sử dụng nhiều do cấu trúc nhiều ngăn cứng và không xác định vì thế sự giải phóng dược chất s kéo dài và có thể một phần thuốc không được giải phóng ra khi cần thiết Trong khi đó các liposome đơn lớp ULV với cấu trúc đặc trưng là một lớp lipid kép, khi một tác nhân kích thích, sự giải phóng thuốc s cùng một thời điểm Do đó mà các liposome đơn lớp, đồng nhất về cấu trúc s là mục tiêu của bào chế [22]
1.5.2 Ảnh hưởng điện thế zeta đến độ ổn định
Hầu hết các hạt phân tán trong môi trường nước s thu được một lượng điện thế bề mặt do sự ion hóa của các nhóm bề mặt và sự kết tập điện tích Điện thế zeta được gọi là điện thế động, do độ lớn của điện thế này quyết định tốc độ di chuyển của các hạt tiểu phân keo dưới tác động của điện trường Độ lớn của điện thế cho thấy mức độ đẩy lùi điện tử giữa các hạt tích điện lân cận, tương tự nhau trong môi trường phân tán Đối với các hạt kích thước đủ nhỏ và giá trị điện thế zeta cao s cho hệ ổn định do sự hòa tan, phân tán chống lại sự kết tập Đối với một hệ có giá trị điện thế zeta nhỏ, lực hút điện tử vượt quá lực đẩy có thể đẫn đến sự kết tập và keo tụ lại Một hệ keo ổn định nên có trị tuyệt đối giá trị điện thế zeta lớn 30 mV [22,41].
Phương pháp giảm kích thước tiểu phân
Liposome đa lớp kích thước lớn có thể phân chia và tái tạo thành các liposome đơn lớp kích thước nhỏ nhờ năng lượng siêu âm [4,5,9] Có 2 loại thiết bị siêu âm áp dụng giảm kích thước liposome dựa trên nguyên tắc trực tiếp và gián tiếp Thiết bị siêu âm trực tiếp là đưa đầu/que vào hỗn dịch, còn nguyên tắc dán tiếp là cho hỗn dịch liposome vào ống hay cốc rồi đặt vào bể hoặc đổ hỗn dịch vào bể siêu âm Siêu âm trực tiếp cho hiệu quả cao nhưng chỉ tác dụng với thể tích nhỏ và dễ làm nóng hoặc đưa tạp vào mẫu, còn bể siêu âm có thể áp dụng cho lượng lớn mẫu nhưng hiệu quả giảm và đồng nhất kích thước không cao do khó kiểm soát được thông số sóng siêu âm Phương pháp siêu âm có rất nhiều các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước và độ ổn định của liposome như cường độ và biên độ sóng siêu âm, nhiệt độ (trên T c của PL), thể tích mẫu, bề dày hệ phân tán so với đầu phát siêu âm… [30,39]
1.6.2 Phương pháp nén/ đẩy qua màng
Nguyên tắc của phương pháp là nén/ đẩy liposome qua màng (polycarbonat) có kích thước lỗ xốp phù hợp đó là liposome đa lớp lớn có thể biến dạng và trở thành liposome đơn lớp hoặc nanoliposome tuỳ theo kích thước của màng Thông thường cần đẩy nhiều chu kỳ và sử dụng màng có kích thước từ lớn đến nhỏ dần Ở qui mô nhỏ, sử dụng thiết bị cầm tay (Hình1.9) Với quy mô lớn, sử dụng thiết bị nén áp suất cao với khí trơ Đồng nhất hoá áp suất cao dựa trên nguyên tắc sử dụng áp suất làm nhiễu loạn dòng chảy của hệ phân tán, tăng tốc độ va chạm của các giọt dẫn tới các tiểu phân được phân chia nhỏ hơn [39,42]
So sánh giữa phương pháp siêu âm và phương pháp đẩy qua màng với thể tích nhỏ cho thấy phương pháp siêu âm có thể nhanh chóng cho kích thước nhỏ, còn phương pháp đẩy qua màng cần lặp lại nhiều chu kỳ mới giảm được kích thước nhưng độ đồng nhất cao hơn [6] Tuy nhiên phương pháp siêu âm sử dụng đầu dò kim loại có thể giải phóng các hạt titanium vào các mẫu
Hình 1.9: Thiết bị đùn bằng tay mini extruder và thiếtbị nén/ đẩy dưới áp suất cao
1.6.3 Phương pháp đông lạnh - giải đông (freeze- thawed)
Liposome kích thước lớn được làm lạnh nhanh sau đó được rã đông từ từ, quá trình này lặp đi lặp lại nhiều lần tạo thành các liposome kích thước nhỏ hơn.Nguyên lí của phương pháp dựa trên sự phá vỡ cấu trúc màng của liposome khi bị đông lạnh và tan chảy liên tục [39,42,60]
1.6.4 Phương pháp vi hóa lỏng (microfluidization)
Phương pháp vi hóa lỏng lần đầu tiên được đưa ra bởi Mayhew và cộng sự vào năm
1984 áp dụng quy mô sản xuất công nghiệp Phương pháp này cho phép đồng nhất hóa hệ phân tán liposome MLV bằng cách cho chảy qua phễu lọc kích thước lỗ khoảng 5 micromet dưới áp suất cao (10000 psi) trong một buồng tương tác Sau đó các tiểu phân s di chuyển qua hai ống nhỏ ở tốc độ cao trên 500 m/s rồi đổ dồn về cùng một buồng chứa Sự va chạm tạo nên quá trình sản sinh, chuyển đổi năng lượng cao, làm bẻ gãy các tiểu phân MLV thành SUV có kích thước đồng nhất Sau 5-10 chu kì s thu được các SUV có kích thước khoảng 100 nm [39,42,60].
Ứng dụng của liposome
Liposome như một hệ vận chuyển thuốc tới đích mang tiềm năng lớn, với những ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược phẩm, tiêu biểu đó là:
1 Bảo vệ các phân tử thuốc nhạy cảm (DNA, RNA, oligo-nucleotide)
2 Tăng cường sự hấp thu nội bào (chống ung thư, kháng khuẩn) [52]
3 Thay đổi dược động học và phân bố sinh học (giải phóng kéo dài với những thuốc có thời gian bán thải ngắn như insulin [29]
4 Nâng cao sự hấp thu thuốc (Amphotericin B, Minoxidil, Paclitaxels [31], Cyclosporins) [20]
Trong đó một số lĩnh vực đã thu được các kết quả đáng khả quan như:
Hóa trị liệu ung thư, bào chế liposome phun mù, kháng sinh trị liệu, enzyme trị liệu, vận chuyển DNA trong liệu pháp gene, ứng dụng trong miễn dịch trị liệu sản xuất vaccine và kháng nguyên, các thuốc dùng trong nhãn khoa, [2,4,11,40,45]
1.7.1 Ứng dụng của liposome trong điều trị ung thư
Ung thư đang trở thành mối nguy hại đe dọa đến sức khỏe con người
Hiện nay trên thế giới có khoảng 23 triệu người đang sống chung cùng căn bệnh này và Việt Nam đang nằm trong 50 nước thuộc top 2 của bản đồ ung thư (WHO) Các điều trị lâm sàng nhằm tiêu diệt cũng như ngăn ngừa sự phát triển, lan rộng của khối u hiện nay phổ biến đó là phẫu thuật, xạ trị và hóa trị liệu
Những biện pháp này có thể loại bỏ hoàn toàn tế bào ung thư nhưng cũng có nguy cơ gây tổn thương các cơ quan và các mô lành xung quanh, gây ra các tác dụng phụ không mong muốn
Các thuốc sử dụng điều trị ung thư cũng là mối quan tâm lớn hiện nay Đáng kể đến là các hoạt chất như: doxorubicin, cerubidin, fucoidan, Tuy nhiên, một số rào cản sinh lý có thể ngăn các tác nhân tích lũy tại vị trí các khối u dẫn đến hiệu quả phân phối thấp, hiệu quả điều trị không cao Ngoài ra sự phân phối không chọn lọc của các thuốc điều trị này đến các mô ung thư và các mô thường.Vì vậy mà các phân tử thuốc tự do không thể đưa tập trung vào các mô khối u, đạt nồng độ hiệu quả để có tác dụng Ví dụ chỉ có dưới 0.1% phân tử thuốc tiêm được tìm thấy trong 1 gam mô khối u càng cho thấy sự phân phối không hiệu quả của chúng Khi các phân tử này được đóng gói trong cấu trúc liposome thì sự tích tụ tại khối u tăng gấp 2-3 lần Các thuốc được đóng gói trong liposome dễ dàng tăng khả năng tuần hoàn trong máu đồng thời tăng cường lắng đọng tại các khối u, bảo vệ thuốc tránh các quá trình chuyển hóa cũng như là phân phối thuốc đến các mô ung thư, hạn chế đến các mô lành, tăng cường hấp thu trong các cơ quan giàu đơn bào, đại thực bào đơn nhân và hệ thống lưới nội môi (gan, lá lách, tủy xương) và giảm hấp thu tại thận, cơ tim và não [38,40] Để đạt mục tiêu là các khối u, liposome phải tồn tại lâu trong vòng tuần hoàn máu, tiếp cận khối u theo cơ chế thụ động bằng cách đi qua các khe hở thành mạch của các mô ung thư và cuối cùng là tập trung tại các mô đích
Khả năng tập trung tại mô đích của các liposome này được gọi là hiệu ứng tăng tính thấm và tính lưu giữ (enhance permeability and retention effect – EPR) [23,50]
Hình 1.10: Khả năng tập trung tại mô đích của liposome dựa trên hiệu ứng
Hiệu ứng EPR dựa trên sự khác biệt giữa cấu trúc của các mô ung thư và các mô thường Các khối u thường chứa một lượng lớn các mao mạch giữa các tế bào nội mô Các mạch máu nuôi khối u thường có hình dạng bất thường và có những khe hở Các khe hở của lớp tế bào lót màng trong mạch máu thường có đường kính vượt quá 400 nm Các phân tử thuốc liposome có đường kính nhỏ hơn 400nm s vượt qua được những khe hở này đi vào khối u và phóng thích thuốc Kích thước các khe hở ở những mạch máu của các mô bình thường có đường kính nhỏ hơn 10 nm, không cho các phân tử thuốc liposome đi qua, vì vậy ngăn chặn thuốc đến các mô lành và gây hại Chính nhờ đặc tính này mà các hạt kích thước nano có thể dễ dàng thoát mạch và tích tụ tại khối u Ngược lại các mô bình thường các tế bào nội mô kết hợp chặt ch dẫn đến ngăn ngừa sự khuếch tán của các hạt nano bên ngoài các mạch máu [23,50,57]
Hình 1.11: Sự khác biệt giữa mạch máu ở mô bình thường và mô ung thư
Một số ví dụ về các loại thuốc ung thư có hiệu quả và độc tính thấp hơn so với các chế phẩm không liposome hóa của DC doxorubicin (tên thương mại:
Doxil®/ Caelyx®), daunorubicine liposome (tên thương mại là DaunoXome®) và liposomal cytosine b-arabinoside (tên thương mại là DepoCyte®) Trong đó, Doxil® là thuốc tiêm được biết đến nhiều nhất khi mà công nghệ nano ra đời như một sự đổi mới cho mục tiêu khối u Doxorubicin là thuốc chỉ định trong điều trị ung thư như ung thư vú, u xương ác tính, ung thư đường tiết niệu và sinh dục: ung thư tử cung, bàng quang, tinh hoàn Đây là hoạt chất có độc tính cao, có thể ảnh hưởng đến không chỉ khối u mà còn đến tim và thận Việc bào chế doxorubicin dưới dạng liposome nhằm cải thiện chỉ số điều trị bằng việc đưa thuốc tới mô khối u, giảm tác dụng phụ Doxil® là thuốc được Cục Quản lý Dược và Thực phẩm Mỹ (FDA) và Cơ quan Dược phẩm Châu Âu (EMA) phê duyệt năm 1995 [22]
1.7.2 Ứng dụng đưa thuốc tới mắt
Mắt là một tổ chức nhỏ có cấu trúc phức tạp Khi các yếu tố như vi khuẩn, virus, nấm tác động vào s gây ra một số bệnh về mắt ở vùng mi mắt, giác mạc, võng mạc như nhiễm khuẩn, lẹo mắt,viêm giác mạc, viêm kết mạc,… Hiện nay có nhiều dạng bào chế khác nhau, tuy nhiên các dạng thuốc này gặp phải một số yếu tố cản trở hấp thu của thuốc như rào cản sinh lí của hệ thống nước mắt, bản chất cấu tạo của các lớp mô vùng giác mạc và kết mạc Nói chung sinh khả dụng của các thuốc nhãn khoa quy ước rất thấp, chỉ khoảng 1-3% lượng dược chất trong liều thuốc có thể thấm qua giác mạc và phân bố đến nơi tác dụng tại các khoang mắt Một trong những hướng nghiên cứu để cải thiện và nâng cao sinh khả dụng của các chế phẩm đó là bào chế các tiểu phân mang thuốc, chúng s khó bị rửa trôi bởi quá trình động học của nước mắt do đó dược chất s dễ dàng hấp thu vào các mô giác mạc và kết mạc đem lại hiệu quả điều trị [24,43]
Fernando A và các cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome mang DC voriconazole (VOR), một thuốc kháng nấm nhóm azole được chỉ định trong các trường hợp viêm giác mạc, có KTTP đạt 116.6 ± 5.9 nm, giá trị PDI hẹp 0.17 ± 0.06, thế zeta đạt -7 mV, EE 80%, có độ ổn dịnh 30 ngày trong dung dịch và 90 ngày sau đông khô với thành phần công thức VOR: PC tỉ lệ 7.2: 40 mM Đánh giá hiệu quả trên invivo nhận thấy sản phẩm không gây kích ứng trong thử nghiệm HET-CAM’s và có khả năng phân phối khoảng 47,85 ± 5,72 g / cm 2 VOR vào giác mạc lợn sau 30 phút thử nghiệm thẩm thấu, nồng độ này cao hơn nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) các loài nấm được phân lập từ những ca lâm sàng viêm giác mạc [24]
Yaganesh V và cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome chứa DC Latanoprost (LOP) giúp giải phóng kéo dài nhằm tăng hiệu quả điều trị bệnh glocom (tăng nhãn áp) Liposome có KTTP 109 ± 18 nm, PDI = 0.19 ± 0.04, EE đạt 94% ± 5%, có độ ổn định trên 6 tháng ở 4 o C và 1 tháng ở 25 o C Đánh giá hiệu quả giảm áp lực trong mắt trên thỏ giữa dạng thuốc liposome và dạng thuốc chứa LOP thông thường dạng tự do trong 90 ngày nhận thấy hiệu quả giảm áp lực lần lượt là 4.8 ± 1.5 và 2.5 ± 0.9 mmHg [56]
1.7.3 Ứng dụng đưa thuốc tới phổi
Hơn 80% trường hợp ung thư phổi không đáp ứng với hóa trị liệu Một trong những hạn chế đó là sự đề kháng của cơ thể đối với các tác nhân lạ gây độc tế bào hiện đang được sử dụng trong điều trị ung thư phổi, do đó nồng độ thuốc tại vị trí khối u là rất thấp Không những thế, các loại thuốc trị liệu với liều lượng cao còn có thể gây độc cho các mô, cơ quan khỏe mạnh Paclitaxel (PTX) là một thuốc chỉ định trong ung thư phổi Tuy nhiên hạn chế của thuốc đó là kém tan trong nước, hơn nữa cấu trúc biểu mô ở phổi mỏng dẫn đến sự tích lũy thuốc của các dạng thuốc hít là rất nhỏ Phát triển các hệ thống phân phối thuốc đến đích là các khối u như liposome là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn bằng việc đưa trực tiếp thuốc vào phổi trong trường hợp ung thư phổi do hiệu ứng tăng tính thấm và tính dẫn lưu (EPR) của những hạt kích thước nhỏ
(100 nm) Koshkina và cộng sự đã so sánh hiệu quả điều trị giữa PTX liposome đường tiêm tĩnh mạch và dạng phun mù với cùng liều lượng ở chuột Kết quả cho thấy PTX có độ thanh thải chậm hơn và nồng độ cao hơn trong phổi ở dạng phun mù so với đường dùng tĩnh mạch [31].
Ưu điểm và nhược điểm của liposome
- Do đặc tính của phospholipid rất gần với cấu trúc màng tế bào, liposome là hệ mang thuốc an toàn, tương đồng có khả năng thâm nhập tốt vào mô và tế bào đích
- Liposome có thể mang đồng thời cả dược chất (DC) thân nước và thân dầu
Dược chất có thể phân bố ở các vị trí khác nhau tùy thuộc đặc tính thân dầu thân nước và tương tác lý hóa của dược chất với lớp phospholipid [49]
- Cấu tạo tương tự màng sinh học nên liposome dễ dàng thấm qua tế bào làm tăng sinh khả dụng của DC, có thể mang DC tới nội bào để chữa bệnh nội bào
Hoặc đưa DC tới đích nhờ gắn các ligand (ví dụ các mảnh kháng thể) trên màng liposome [47]
- Làm thay đổi phân bố sinh học của một số DC có độc tính cao, dùng liều thấp như: thuốc điều trị ung thư, thuốc kháng khuẩn, kháng nấm… Làm giảm phân bố thuốc tại cơ quan lành, tăng phân bố tại đích so với DC tự do, làm giảm độc tính và tác dụng không mong muốn, tăng hiệu quả điều trị, tiết kiệm DC….[47,49]
- Thể hiện ưu điểm của dạng siêu vi nang: bảo vệ dược chất tránh tác động bất lợi của ngoại môi trong quá trình bảo quản hay trên đường vận chuyển tới vị trí tác dụng trong cơ thể: pH, enzym, tác nhân oxy hóa… làm tăng độ tan của DC hoặc kéo dài tác dụng của thuốc [43,55]
Mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng hiện nay chưa có nhiều chế phẩm ứng dụng hệ vận chuyển thuốc liposome trên thị trường do một số nhược điểm sau:
- Phospholipid không bền về mặt hóa học nên ảnh hưởng tới độ ổn định của liposome Liposome dễ bị thanh thải bởi hệ thực bào, thời gian tuần hoàn khó kéo dài Tỷ lệ liposome hóa của nhiều DC còn thấp đặc biệt với DC có phân tử lượng lớn
- Phospholipid chủ yếu được chiết tách từ nguồn nguyên liệu tự nhiên do đó rất khó kiểm soát mức độ tinh khiết của nguyên liệu Phospholipid có thể lẫn các lysophospholipid hoặc các sản phẩm khác của quá trình oxy hóa phospholipid [37]
- Hầu hết các phương pháp bào chế liposome đều chỉ thích hợp với quy mô phòng thí nghiệm, khó triển khai trên quy mô lớn
- Một số phương pháp bào chế liposome sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid gây tác động bất lợi đến môi trường.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu nghiên cứu
Bảng 2.1: Các nguyên liệu sử dụng
TT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Phosphatidylcholin dầu đậu nành đã hydrogen hóa (HSPC)
4 Natri acetat Trung Quốc TKHH
5 Acid citric Trung Quốc TKHH
N’-2-ethanesulfonic acid) Sigma Aldrich TCCS
7 Kali dihydrophosphat Trung Quốc TKHH
8 Dinatri hydrophosphat Trung Quốc TKHH
9 Acid acetic Trung Quốc TKHH
10 Túi thẩm tích Spectra/Por 4,
Molecular weight cut off :12-14 kD
11 Natri hydroxid Trung Quốc TKHH
12 Natri clorid Trung Quốc TKHH
13 Nước cất pha tiêm Việt Nam DĐVN
14 Amoni sulfat Trung Quốc TKHH
15 Dung dịch tiêm truyền glucose 5% Việt Nam DĐVN
17 Etanol tuyệt đối Trung Quốc TKHH
18 Dung dịch NaCl 0.9% Việt Nam DĐVN
Phương tiện nghiên cứu
- Máy cất quay ROTAVAPOR R-210 của Buchi – Đức
- Máy đo kích thước tiểu phân và đo thế zeta ZETASIZER ZS 90 (Malvern –Anh)
- Bể điều nhiệt Buchi – Đức
- Thiết bị đồng nhất hóa áp suất cao EmulsiFlex (Avestin Canada)
- Tủ sấy hút chân không
- Cân kĩ thuật, máy đo pH InoLab, tủ lạnh
- Cân phân tích Satorius BP 121S.
Phương pháp nghiên cứu
Tạo lớp film lipid: Hòa tan HSPC: Chol (250mg: 50mg) trong 50ml Cloroform
Tiến hành bốc hơi dung môi trên thiết bị cất quay ở nhiệt độ 40 o C trong điều kiện chân không, tốc độ quay 50 vòng/phút Thời gian cất quay khoảng 1 giờ sau đó đưa vào tủ sấy chân không, sấy trong khoảng 12-18 giờ
Hydrat hóa: Tăng tốc độ quay lên 80 vòng/phút, tăng nhiệt độ lên 60 o C, sử dụng các dung dịch khác nhau để hydrat hóa
Tiến hành hydrat hóa trong khoảng 2 giờ s thu được hỗn dịch liposome màu trắng đục
+ Công thức đệm citrat: hòa tan 3.15g acid citric và 0.7g NaOH hòa tan trong
100 ml nước cất pha tiêm điều chỉnh tới pH 4.0 bằng dung dịch NaOH 10% Lọc qua màng cellulose acetate 0.2 μm
+ Công thức đệm amoni sulfat: hòa tan 1.68g (NH 4 ) 2 SO 4 vào 100 ml nước cất pha tiêm điều chỉnh tới pH 5.5 bằng dung dịch NaOH 10% Lọc qua màng cellulose acetate 0.2 μm
+ Công thức đệm acetat: hòa tan 2.36g natri acetat và 8 ml dung dịch
CH 3 COOH 0.2 M trong 100ml nước cất pha tiêm, điều chỉnh pH 4.0 bằng dung dịch NaOH 10% Lọc qua màng cellulose acetate 0.2 μm
+ Công thức đệm PO 4 /NaCl: hòa tan 0.144g Na 2 HPO 4 và 0.024g KH 2 PO 4 trong 100 ml dung dịch NaCl 0.9% Lọc qua màng cellulose acetate 0.2 μm
2.4.2 Nghiên cứu quy trình làm giảm và đồng nhất kích thước tiểu phân
Sử dụng thiết bị nén áp suất cao EmulsiFlex (Avestin - Canada) với khí nén nitơ nối với tủ tách ẩm Nén lặp lại nhiều chu kỳ ở điều kiện nhiệt độ là 60 o C và áp suất thích hợp đến khi đạt kích thước và phân bố kích thước mong muốn Sau cùng lọc hỗn dịch qua màng 0.2 àm để loại cỏc tiểu phõn kớch thước lớn
Khảo sát và thu lại mẫu khi nén lần lượt qua 10, 20, 30 chu kì tại hai áp suất lần lượt là 500 bar và 1000 bar để tìm ra quy trình phù hợp cho mỗi mẫu
2.4.3 Đánh giá ảnh hưởng của môi trường bên trong và bên ngoài đến đặc tính tiểu phân của liposome
Tiến hành đổi môi trường bên ngoài liposome của các hệ môi trường đã bào chế trên bằng việc sử dụng phương pháp lọc túi lọc thẩm tích Hút 5 ml dung dịch cho vào trong túi thẩm tích, đặt trong 500 ml các môi trường ngoài khác nhau cần khảo sát, để khoảng 3giờ ở nhiệt độ 4-8 o C, sau đó lại tiếp tục tiến hành đổi môi trường bằng các dung dịch trước đó để loại hoàn toàn môi trường ban đầu Quy trình thẩm tích mất khoảng 1 ngày để đổi hoàn toàn môi trường bên ngoài liposome Đổi môi trường bên ngoài liposome thành các môi trường như sau:
Môi trường trong liposome Môi trường ngoài liposome
Dung dịch hydrat hóa Đệm HEPES/ NaCl pH 7,4 (HBS) Đệm HEPES/ Glucose pH 7,4 (HBG) Nước cất
+ Công thức đệm HEPES/ NaCl pH 7.4 (HBS) : hòa tan 20mM Hepes vào trong 500ml dung dịch NaCl 0,9%
+ Công thức đệm HEPES/ Glucose pH 7.4 (HBG): hòa tan 20mM Hepes vào trong 500ml dung dịch glucose 5%
Hình 2.1: Phương pháp thẩm tích sử dụng túi Spectra/ Por 4
Tổng hợp ta có sơ đồ quy trình các bước tiến hành nghiên cứu sau:
Hình 2.2: Sơ đồ quy trình các bước tiến hành nghiên cứu.
Phương pháp đánh giá liposome tạo thành
So sánh độ đục trong của các hỗn dịch liposome tạo thành và sự lắng cặn, kết tập của hỗn dịch nếu có
2.5.2 Phương pháp đánh giá hình thái, cấu trúc liposome
Sử dụng phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền qua (transmission electron microscopy – TEM) để xác định hình thái, cấu trúc liposome tạo thành
2.5.3 Phương pháp đánh giá đặc điểm hóa lí của hệ có môi trường trong và ngoài khác nhau
1 Xác định KTTP trung bình và phân bố KTTP Đánh giá KTTP và phân bố KTTP dựa vào giá trị đo đường kính trung bình (Z-average), chỉ số đa phân tán (PDI), đo lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình
2 Xác định điện thế zeta (zeta potential)
Tráng film Sấy chân không
Giảm và đồng nhất kích thước Đổi môi trường bên ngoài
(HSPC: CHOl%0:50 mg) + 50ml Cloroform v= 50v/p
Pha loãng mẫu liposome 100 lần (sao cho count rate đạt khoảng 200-400 kcps) bằng nước cất rồi đo giá trị điện thế zeta bằng kĩ thuật tán xạ ánh sáng động (DLS) trên thiết bị Zetasizer ZS90 Tiến hành đo lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình
3 Đánh giá sự ổn định của hệ Đánh giá sự ổn định của liposome bào chế thông qua việc so sánh KTTP, PDI và thế zeta của các mẫu tạo thành qua thời gian lần lượt là 1 ngày, 3 ngày, 7 ngày, 14 ngày và 1 tháng tại điều kiện bảo quản là 4 o C Đánh giá môi trường bên ngoài phù hợp nhất để bảo quản mẫu liposome với các hệ môi trường hydrat hóa khác nhau.
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN
Hình thái, cấu trúc liposome
Hình 3.1: Hình ảnh chụp TEM của mẫu liposome lần lượt là H 2 O và Acetat
Kết quả hình ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử truyền qua (hình 3.1) cho thấy các mẫu liposome có kích thước khá đồng nhất, các hạt tiểu phân liposome có kích thước cỡ từ 70- 110 nm Các hạt tiểu phân có dạng hình cầu, đơn lớp, lớp vỏ khá mỏng.
Đánh giá quy trình giảm và đồng nhất KTTP
Đánh giá quy trình giảm kích thước tiểu phân đối với mỗi hệ môi trường hydrat khác nhau tại 2 áp suất lần lượt là 500 bar và 1000 bar Tại mỗi áp suất, đánh giá KTTP, PDI và zeta các mẫu sau lần lượt 10, 20 và 30 chu kì
3.2.1 Hệ môi trường hydrat nước (H 2 O)
Bảng 3.1: Kết quả đo KTTP, PDI và điện thế zeta của hệ môi trường hydrat là nước
Số chu kì nén Áp suất nén
Với dung dịch hydrat hóa là nước cất, khi so sánh khả năng làm giảm và đồng nhất kích thước liposome ở 2 áp suất tăng dần từ 500 đến 1000 bar nhận thấy:
- Tại áp suất cao hơn là 1000 bar, các mẫu liposome có kích thước, giá trị phân bố kích thước PDI giảm nhanh hơn áp suất nén 500 bar chứng tỏ khi áp suất tăng, KTTP giảm và có độ đồng nhất tốt hơn
- Khi nén qua 20 chu kì liên tiếp tại áp suất 1000 bar, mẫu liposome có KTTP trung bình đạt 70.8 nm, PDI nhỏ nhất trong các mẫu và giá trị tuyệt đối điện thế zeta cao nhất Do đó có thể nhận định rằng các mẫu nén qua 20 chu kì cho mẫu đồng nhất và độ ổn định cao nhất
Từ đó ta chọn ra quy trình nén ở áp suất là 1000 bar và nén qua 20 chu kì là quy trình phù hợp để làm giảm và đồng nhất kích thước
3.2.2 Hệ môi trường hydrat: đệm acetat pH 4.0 Bảng 3.2: Kết quả đo KTTP, PDI và thế zeta của hệ môi trường hydrat: đệm acetat pH 4.0
Số chu kì nén Áp suất nén
Với dung dịch hydrat hóa là đệm acetat, khi so sánh khả năng làm giảm và đồng nhất kích thước liposome ở 2 áp suất là 500 bar và 1000 bar nhận thấy:
- Tại áp suất cao hơn là 1000 bar, các mẫu liposome có kích thước, PDI giảm nhanh hơn chứng tỏ khi áp suất tăng, KTTP giảm nhanh hơn và có độ đồng nhất tốt hơn
- Khi nén qua 20 chu kì cho mẫu liposome có KTTP, PDI nhỏ nhất (KTTP trung bình đạt 74.3 nm, PDI đạt 0.152) và giá trị thế zeta là -32 mV Vì thế có thể nhận định rằng các mẫu nén qua 30 chu kì cho mẫu đồng nhất và độ ổn định cao nhất
Do đó quy trình nén ở áp suất là 1000 bar và nén qua 30 chu kì là quy trình phù hợp nhất để giảm và đồng nhất kích thước
3.2.3 Hệ môi trường hydrat: đệm citrat pH 4,0
Bảng 3.3: Kết quả đo KTTP, PDI và thế zeta của hệ môi trường hydrat: đệm citrate pH 4.0
Số chu kì nén Áp suất nén
Với dung dịch hydrat hóa là dung dịch đệm citrate pH 4.0, ta nhận thấy:
- Các mẫu khi nén với áp suất 500 bar đều cho KTTP khá lớn, giá trị PDI cao, thế zeta nhỏ gần 0 Điều này cho thấy đây là những hệ không ổn định
- Khi nén áp suất cao hơn là 1000 bar, các mẫu cho KTTP nhỏ hơn, PDI cũng giảm xuống, đặc biệt khi nén qua 20 chu kì cho KTTP đạt 123.7 nm và PDI đạt 0.189
Chọn ra quy trình nén qua 20 chu kì ở áp suất 1000 bar là quy trình phù hợp để giảm và đồng nhất kích thước
3.2.4 Hệ môi trường hydrat: đêm amoni pH 5.5 Bảng 3.4: Kết quả đo KTTP, PDI và thế zeta của hệ môi trường hydrat: đệm amoni pH 5.5
Số chu kì nén Áp suất nén
Với dung dịch hydrat hóa là dung dịch đệm amoni, khi so sánh khả năng làm giảm và đồng nhất kích thước liposome ở 2 áp suất là 500 bar và 1000 bar nhận thấy:
- Khi nén ở áp suất 500 bar, các mẫu liposome đều có kích thước phù hợp yêu cầu, nhưng giá trị PDI đều cao hơn 0.3 và giá trị thế zeta gần 0 cho thấy đây là các hệ không đồng nhất và ổn định
- Tại áp suất cao hơn là 1000 bar, các mẫu liposome có kích thước, PDI giảm dần và đều nhỏ hơn 0.2 hơn chứng tỏ khi áp suất tăng, KTTP giảm và có độ đồng nhất tốt hơn Đặc biệt là khi nén qua 30 chu kì cho KTTP đạt 89.54 nm và PDI đạt 0.160, thế zeta cao nhất trong tất cả các mẫu
Do đó chọn ra quy trình nén qua 30 chu kì tại áp suất 1000 bar là quy trình phù hợp để làm giảm và đồng nhất kích thước
3.2.5 Hệ môi trường hydrat: dung dịch Glucose 5%
Bảng 3.5: Kết quả đo KTTP, PDI và thế zeta của hệ môi trường hydrat: dung dịch Glucose 5%
Số chu kì nén Áp suất nén
Với dung dịch hydrat hóa là dung dịch glucose 5%, đây là dung dịch có độ nhớt khá cao so với các dung dịch khác nên KTTP của các mẫu khá lớn, do đó cần một lực nén ở áp suất cao và số chu kì nén lớn
- Tại áp suất nén là 500 bar, các mẫu liposome đều có KTTP, giá trị PDI cao
- Khi áp suất nén cao hơn là 1000 bar, các mẫu liposome có sự giảm dần về KTTP cũng như giá trị PDI Đặc biệt khi nén qua 30 chu kì cho thế zeta cao nhất và đây là hệ đồng nhất và ổn định nhất
- Tại áp suất nén là 500 bar, các mẫu liposome đều có KTTP, giá trị PDI cao
Chọn ra quy trình thích hợp để giảm và đồng nhất kích thước đó là nén ở áp suất 1000 bar và nén qua 30 chu kì liên tiếp
3.2.6 Hệ môi trường hydrat: dung dịch saccarose 10%
Bảng 3.6: Kết quả đo KTTP, PDI và thế zeta của hệ môi trường hydrat: dung dịch saccarose 10%
Số chu kì nén Áp suất nén
Với dung dịch Saccarose 10% sử dụng để hydrat hóa, khi tiến hành nén đẩy qua thiết bị ta thấy KTTP cũng như giá trị PDI đo được của các mẫu cao Khi tăng số chu kì nén lên thì KTTP và PDI cũng tăng lên, một thế zeta gần 0 cho thấy sự không ổn định của các hệ liposome này
Đánh giá độ ổn định của mỗi hệ liposome với các thành phần môi trường
3.3.1 Môi trường bên trong là nước Đối với hệ có môi trường bên trong và bên ngoài là nước, tiến hành thẩm tích đổi môi trường bên ngoài liposome thành các đệm HBG và HBS, ta có các hệ môi trường khác nhau:
Các hệ Môi trường trong và ngoài liposome
H 2 O/ H 2 O Môi trường trong là nước và ngoài liposome là nước
H 2 O/ HBG Môi trường trong là nước và ngoài liposome là đệm HBG
H 2 O/ HBS Môi trường trong là nước và ngoài liposome là đệm HBS Đánh giá ảnh hưởng của môi trường trong và ngoài liposome đến sự thay đổi KTTP và giá trị PDI của các hệ ta có bảng sau:
Bảng 3.9: Sự thay đổi KTTP, PDI qua thời gian của hệ môi trường hydrat: nước trước và sau khi đổi môi trường bên ngoài
Dựa vào bảng ta nhận thấy:
- Không có sự thay đổi nhiều về KTTP ngay sau khi tiến hành thẩm tích đổi môi trường bên ngoài
- Sự thay đổi KTTP của mẫu có môi trường trong và ngoài liposome là H 2 O không nhiều sau thời gian bảo quản 1 tháng, dao động trong khoảng từ 70.8 nm đến 73.36 nm và PDI thay đổi từ 0.145- 0.158
- Khi thay đổi môi trường bên ngoài liposome sang đệm HBS và HBG thì các mẫu có sự bất ổn định thể hiện qua giá trị đo KTTP và PDI tăng dần trong thời gian bảo quản Điều này càng rõ hơn khi đánh giá sự thay đổi điện thế zeta giữa các mẫu ở đồ thị 3.2
Hình 3.2: Sự thay đổi về điện thế zeta theo thời gian của các mẫu liposome có môi trường hydrat là H 2 O
Dựa vào đồ thị ta nhận thấy:
- Mẫu có môi trường trong và ngoài liposome là nước cất không có sự thay đổi đáng kể giá trị đo thế zeta trong thời gian bảo quản Sau 30 ngày thế zeta đo được là 27.5 mV, cho thấy đây là hệ khá ổn định
- Khi thay đổi môi trường bên ngoài liposome, thế zeta đo được của các mẫu H 2 O/
HBS và H 2 O/ HBG nằm trong khoảng không ổn định, giảm dần trong thời gian bảo quản chỉ còn lần lượt -9.9 mV và -6.8 mV
Do vậy với liposome có môi trường bên trong và ngoài là nước s ổn định nhất
3.3.2 Môi trường bên trong là đệm acetat pH 4.0 (AB –acetat buffer) Đối với hệ có môi trường bên trong và bên ngoài là đệm acetat pH 4.0, tiến hành thẩm tích đổi môi trường bên ngoài liposome thành môi trường nước cất, đệm HBG và HBS, ta có các hệ môi trường khác nhau đó là:
Các hệ Môi trường trong và ngoài liposome AB/ AB Môi trường trong và ngoài liposome là đệm acetat
AB/ H 2 O Môi trường trong là đệm acetat và ngoài liposome là nước
AB/ HBG Môi trường trong là đệm acetat và ngoài liposome là đệm HBG
AB/ HBS Môi trường trong là đệm acetat và ngoài liposome là đệm HBS Đánh giá ảnh hưởng của môi trường trong và ngoài liposome đến sự thay đổi KTTP và PDI ta có bảng sau:
Bảng 3.10: Sự thay đổi KTTP, PDI qua thời gian của hệ môi trường hydrat: đệm acetat pH 4,0 trước và sau khi đổi môi trường bên ngoài
AB/ AB AB/ HBS AB/ HBG AB/ H 2 O
- Mẫu có môi trường trong và ngoài liposome là đệm acetat có KTTP tăng dần theo thời gian từ 74.3 nm lên 102.3 nm, giá trị PDI thay đổi bất thường có thể là do các hạt tiểu phân kích thước lớn rơi xuống đáy lọ, lơ lửng trên là các hạt có kích thước nhỏ hơn
- Sau khi tiến hành đổi môi trường bên ngoài liposome ta nhận thấy: với hệ đệm bên ngoài là HBS KTTP tăng dần theo thời gian Hệ đệm HBG và nước cất không tăng nhiều, KTTP dao động trong khoảng 88 nm, và giá trị PDI đều trong khoảng 0.2 sau
30 ngày bảo quản cho thấy đây là các hệ khá ổn định Điều này càng thể hiện rõ qua việc đánh giá sự ổn định của các hệ thông qua việc đo điện thế zeta
Hình 3.3: Sự thay đổi điện thế zeta theo thời gian của các mẫu có hệ môi trường hydrat là đệm Acetat (AB)
Dựa vào đồ thị ta nhận thấy:
- Mẫu có môi trường trong và ngoài là đệm acetat có thế zeta giảm dần từ +32.4 mV xuống +27.5 mV cho thấy hệ không ổn định theo thời gian bảo quản Điều này có thể giải thích là do ở môi trường pH quá thấp s làm gia tăng sự thủy phân phospholipid làm hệ kém ổn định
- Khi thay đổi môi trường bên ngoài liposome từ đệm acetat sang các môi trường khác nhận thấy có sự thay đổi về điện tích từ dương sang âm chứng tỏ bề mặt liposome đã hấp phụ nhiều ion (-) làm thay đổi điện tích bề mặt của chúng
- Với môi trường bên ngoài là đệm HBS, mẫu đo được có thế zeta giảm dần theo thời gian
- Với môi trường bên ngoài liposome là đệm HBG và nước thì sự thay đổi điện thế là không đáng kể, các mẫu đều có giá trị trong khoảng -30 mV cho thấy đây là các hệ khá ổn định Đánh giá ảnh hưởng môi trường bên ngoài đến đặc tính tiểu phân liposome ta có thể khẳng định với môi trường bên trong là đệm acetat thì môi trường bên ngoài là nước và đệm HBG s ổn định Trong đó nước là môi trường thích hợp nhất
3.3.3 Môi trường hydrat: đệm citrat pH 4.0 (CB- citrat buffer) Đối với hệ có môi trường bên trong và bên ngoài là citrat, tiến hành thẩm tích đổi môi trường bên ngoài liposome thành nước cất, đệm HBG và HBS, ta có các hệ môi trường khác nhau như sau:
Các hệ Môi trường trong và ngoài liposome CB/ CB Môi trường trong và ngoài liposome là đệm citrate
CB/ H 2 O Môi trường trong là đệm citrat và ngoài liposome là nước
CB/ HBG Môi trường trong là đệm citrat và ngoài liposome là đệm HBG
CB/ HBS Môi trường trong là đệm citrat và ngoài liposome là đệm HBS Đánh giá ảnh hưởng của môi trường trong và ngoài liposome đến sự thay đổi KTTP và PDI ta có bảng sau:
Bảng 3.11: Sự thay đổi KTTP, PDI qua thời gian của hệ môi trường hydrat: đệm citrat pH 4.0 trước và sau khi đổi môi trường bên ngoài
CB/ CB CB/ HBS CB/ HBG CB/ H 2 O
