NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG MẠNH VỚI NẤM BỆNH FUSARIUM GÂY BỆNH HÉO VÀNG TRÊN CÂY CHUỐI TẠI HUYỆN ĐẠI LỘC, TỈNH QUẢNG NAM

Đỗ Thu Hà 104 NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG MẠNH VỚI NẤM BỆNH FUSARIUM GÂY BỆNH HÉO VÀNG TRÊN CÂY CHUỐI TẠI HUYỆN ĐẠI LỘC, TỈNH QUẢNG NAM A STUDY OF THE SELECTION OF TRICHODERMA STRAINS STRONGLY RESISTANT TO FUSARIUM FUNGUS -THE CAUSE OF YELLOW WILTING ON BANANA TREES IN DAILOC DISTRICT, QUANGNAM PROVINCE Đỗ Thu Hà Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng; dothuha09@yahoo.com Tóm tắt - Trichoderma vi nấm sống chủ yếu đất, diện nhiều vùng sinh thái khác Trichoderma có khả ức chế, tiêu diệt nấm, vi khuẩn gây bệnh mà khơng gây hại cho người trồng Chính vậy, việc khai thác tiềm nấm Trichoderma để phòng trừ bệnh hại trồng nhà khoa học giới Việt Nam quan tâm Sự bảo tồn loài thiên địch tự nhiên “chìa khóa” vững để phịng trừ sâu bệnh hại trồng an toàn hiệu Trong nghiên cứu này, phân lập 22 chủng nấm Trichoderma từ đất trồng chuối, kí hiệu Tri.01 – Tri.22 Các chủng nấm Trichoderma có khả đối kháng với nấm bệnh Fusarium gây bệnh héo vàng chuối Từ 22 chủng nấm Trichoderma, chọn chủng Trichoderma (Tri.01, Tri.05, Tri.07, Tri.11) có khả đối kháng mạnh với nấm Fusarium Sử dụng chủng tiến hành lên men xốp tạo chế phẩm dạng bột, kết kháng nấm Fusarium tốt điều kiện phịng thí nghiệm Abstract - Trichoderma is a fungus found mainly in soil and is present in many different ecological zones Trichoderma can inhibit and kill fungi, antagonistic bacteria without doing harm to humans and plants Therefore, exploiting the potential of Trichoderma fungi to control plant diseases is attracting the interest of scientists in Vietnam and in the world The conservation of natural enemies is the "key" to preventing crop pests safely and effectively In this study, we isolated and selected 22 Trichoderma in the banana planting soil, with the notation of Tri.01 – Tri.22 Most of the isolated strains of Trichoderma can resist to the fungi Fusarium which cause banana trees to wilt (Musa paradisiaca L.) From 22 strains of Trichoderma we selected strains of Trichoderma (Tri.01, Tri.05, Tri.07, Tri.11) which have strong resistance to Fusarium fungal strains The four strains (Tri.01, Tri.05, Tri.07, Tri.11) are used to ferment sponge that creates Trichoderma powder preparations which fight well against the fungi Fusarium in laboratory conditions Từ khóa - Trichoderma; Fusarium; khả đối kháng; chuối; bệnh héo vàng Key words - Trichoderma; Fusarium; resistance capabilities; banana (Musa paradisiaca L.); yellow wilting Đặt vấn đề Biện pháp phòng trừ sâu bệnh hại phương pháp sinh học nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Đáng ý nghiên cứu số loại vi nấm có khả đối kháng với nấm bệnh trồng Nấm đối kháng ngăn chặn số bệnh hại mà cịn khơng gây ảnh hưởng đến loài thiên địch xứ tự nhiên không gây ô nhiễm môi trường Các nhà khoa học giới Việt Nam phát nhiều dịng nấm Trichoderma có khả cơng nấm gây bệnh hại đất cách tiết nhiều loại enzym làm ức chế tăng trưởng, ngăn cản nảy mầm bào tử nấm bệnh Người ta ứng dụng Trichoderma phòng trừ bệnh hại trồng thành công nhiều nơi khác Chuối (Musa paradisiaca L.) loại nhiệt đới quan trọng xếp vị trí thứ tư sau lúa gạo, sữa lúa mì giá trị kinh tế Chuối loại thương mại hóa rộng rãi, đứng vị trí thứ hai giới, sau cam Tuy nhiên, số khu vực trồng chuối tỉnh Quảng Nam, tình hình dịch bệnh chuối ngày gia tăng làm giảm suất chất lượng nông sản Trong có huyện Đại Lộc khu vực có diện tích chuyên canh chuối lớn tỉnh bị ảnh hưởng nặng nề Xuất phát từ sở trên, tiến hành nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm Trichoderma có khả đối kháng mạnh với nấm bệnh Fusarium gây bệnh héo vàng chuối (Musa paradisiaca L.) huyện Đaị Lộc – tỉnh Quảng Nam Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng - Các chủng nấm Trichoderma phân lập từ mẫu đất (đất thịt nhẹ, đất thịt trung bình, đất cát pha,…) đất trồng chuối huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam - Nấm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối phân lập huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp thu thập mẫu đất [2], [8] Các điểm lấy mẫu phải phân bố ngẫu nhiên diện tích đất điều tra, theo phương pháp lấy điểm theo đường chéo Mẫu đất bỏ túi nilon đem cột chặt để hạn chế thoát nước làm giảm độ ẩm Các mẫu tiến hành phân tích ngày bảo quản tủ lạnh không 24 - Phương pháp phân lập chủng vi nấm Trichoderma [2], [8] Sử dụng phương pháp phân lập Egorov môi trường PDA - Phương pháp giữ giống - Để bảo quản giống cho nghiên cứu tiếp theo, thực theo phương pháp Egorov Ống giống giữ nhiệt độ – 6oC [9], tháng cấy lại lần - Phương pháp thử tính đối kháng nấm Trichoderma chủng nấm gây bệnh [3] Thực phương pháp cấy đối xứng đĩa petri ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 3(88).2015 105 điều kiện phịng thí nghiệm theo công thức: CT1: TR NB cấy đồng thời; CT2: NB cấy độc lập (đối chứng) Mỗi công thức thực với lần lặp lại, nhiệt độ 25oC Theo dõi tốc độ sinh trưởng phát triển Trichoderma chủng nấm gây bệnh thực vật - Phương pháp lên men môi trường xốp [6] Phương pháp lên men dạng rắn với thành phần chất làm môi trường gồm: cám trấu - Phương pháp khảo sát khả đối kháng chế phẩm Trichoderma nấm bệnh [4], [5], [6] Thí nghiệm thực môi trường giá đỗ Các đĩa đối chứng: nấm bệnh cấy chấm đĩa peptri Các đĩa thí nghiệm: nấm bệnh cấy chấm đĩa peptri Sau ngày, lấy chế phẩm Trichoderma rắc xung quanh cách nấm bệnh khoảng 0,5 cm Quan sát đường kính khuẩn lạc nấm bệnh sau 24, 48, 72, 96, 120 sau rắc chế phẩm - Phương pháp xử lí số liệu Hình Khuẩn lạc số chủng nấm Trichoderma thuộc nhóm sau ngày ni cấy môi trường giá đỗ 3.2 Phân lập xác định chủng nấm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối Từ 15 mẫu bệnh chuối thu thập mẫu đất khu vực có chuối nhiễm bệnh phận rễ, thân, lá, chuối có triệu chứng nhiễm bệnh héo vàng thơn Lộc Bình, xã Đại Hòa, huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam Áp dụng khóa phân loại nấm mốc Bùi Xuân Đồng (1984) [3] khóa phân loại nấm bệnh hại trồng Vũ Triệu Mân (2007) [4] Kết hợp với tài liệu tham khảo trình quan sát cuống sinh bào tử bào tử kính hiển vi, phân lập xác định chủng nấm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối Các số liệu thu thập phân tích thống kê phần mềm SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) Tính Analysis of variance (ANOVA) sử dụng phép thử Ducan để kiểm định mức độ có ý nghĩa trung bình nghiệm thức Kết nghiên cứu biện luận 3.1 Phân lập chủng nấm Trichoderma Từ 40 mẫu đất trồng chuối lấy huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam, phương pháp phân lập môi trường PDA Dựa vào hình thái khuẩn lạc mơi trường ni cấy, hình thái hệ sợi, quan sát kính hiển vi dựa vào khóa phân loại M.A Rifai [ 9]; phân lập 22 chủng Trichoderma kí hiệu từ Tri.01 đến Tri.22 Các chủng nấm Trichoderma phân lập chia thành nhóm: - Nhóm 1: gồm chủng Trichoderma (Tri.01, Tri.05, Tri.06, Tri.07, Tri.08, Tri.11, Tri.12, Tri.13, Tri.14, Tri.16, Tri.19, Tri.20, Tri.21) có hệ sợi phát triển mạnh khơng sinh sắc tố môi trường nuôi cấy PDA môi trường giá đỗ Hình Khuẩn lạc số chủng nấm Trichoderma thuộc nhóm sau ngày ni cấy mơi trường giá đỗ - Nhóm 2: gồm chủng nấm Trichoderma (Tri.02, Tri.03, Tri.04, Tri.09, Tri.10, Tri.15, Tri.17, Tri.18, Tri.22) có hệ sợi nấm sinh trưởng yếu môi trường nuôi cấy PDA môi trường giá đỗ Các chủng nấm Trichoderma phân lập có chung đặc điểm sau: khuẩn ty vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều; cuối nhánh phát triển thành khối tròn mang bào tử trần, khơng có vách ngăn, khơng màu; khuẩn lạc có màu lục trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm Hình Bệnh héo vàng chuối nấm Fusarium * Đặc điểm ni cấy, hình thái nấm Fusarium gây bệnh chuối Kết nghiên cứu đặc điểm ni cấy, hình thái chủng nấm Fuasarium gây bệnh chuối thể qua Bảng sau: Bảng Thành phần đặc điểm chủng nấm bệnh chuối Chi nấm Fusarium Triệu chứng Thối thân, thối cuống bẹ lá, thối bó mạch thân Đặc điểm hình thái Khuẩn lạc có màu trắng sợi nấm mảnh phát triển mạnh, cành bào tử ngắn, có khơng có vách ngăn ngang Bào tử Bào tử lớn suốt, hình lưỡi liềm, có – vách ngăn, bào tử nhỏ hình bầu dục, có khơng có vách ngăn Sau tinh sạch, chủng nấm giữ ống thạch nghiêng môi trường Czapek PDA sử dụng làm vi sinh vật kiểm định Bảng2 Đường kính nấm bệnh Fusarium môi trường PDA Czapek Môi trường Czapek PDA Đường kính trung bình khuẩn lạc(mm) Sau Sau Sau Sau Sau ngày 13±3 31±2 45±3 47±5 52±3 31±2 64±4 96 ±0,4 - Nhận xét: Từ Bảng nhận thấy, môi trường PDA nấm Fusarium phát triển nhanh mạnh Đỗ Thu Hà 106 môi trường Czapek Sau ngày nuôi cấy, môi trường PDA nấm bệnh mọc kín đĩa, môi trường Czapek sau ngày nuôi cấy, đường kính đạt 52±3mm Như vậy, môi trường PDA môi trường cho nấm bệnh phát triển tốt Hình Khuẩn lạc, cuống sinh bào tử bào tử nấm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối 3.3 Tuyển chọn chủng nấm Trichoderma có khả đối kháng mạnh chủng nấm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối Chúng tiến hành xác định khả đối kháng 22 chủng vi nấm Trichoderma phân lập từ đất trồng chuối huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam với chủng nấm bệnh Fusarium Thí nghiệm thực đồng loạt đĩa petri (đường kính 10cm), chủng nấm nuôi chủng môi trường giá đỗ, điều kiện phịng thí nghiệm Hình Biểu đồ mức độ đối kháng chủng nấm Trichoderma với nấm bệnh Fusarium Ghi chú: 1+: bào tử Trichoderma mọc lấn sang khuẩn lạc nấm bệnh Hệ sợi nấm bệnh đồng thời bị ức chế tàn lụi dần Hiệu quả ức chế 40 - 60% [1]; 2+: tương tự (1+), hiệu quả ức chế 60 - 80%; 3+: tương tự (1+), hiệu quả ức chế 80 - 90%; 4+: tương tự (1+), hiệu quả ức chế > 90%; -: hiệu quả ức chế < 40% Sau tiến hành xác định khả đối kháng chủng nấm Trichoderma nấm Fusarium thu kết mức đối kháng thể qua Bảng Hình Qua kết thu từ Bảng Hình cho thấy chủng nấm Trichoderma phân lập từ đất trồng chuối hầu hết có khả đối kháng với nấm bệnh Fusarium Tuy nhiên, có khác biệt hiệu ức chế chủng nấm nghiên cứu nấm bệnh Cụ thể: chủng Tri.04 có khả đối kháng thấp mức -, chiếm 4,54%; chủng Tri.13 có khả đối kháng mức 1+ chiếm 4,54%; 11 chủng nấm Trichoderma có khả đối kháng mức 2+ chủng nấm Trichoderma có khả đối kháng mạnh nhất, hiệu ức chế nấm bệnh đạt 80% Trong chủng (Tri.02, Tri.03, Tri.06, Tri.08, Tri.19) đạt hiệu ức chế mức 3+ chiếm 22,73%, chủng (Tri.01, Tri.05, Tri.07, Tri.11) có khả kháng nấm bệnh mạnh đạt mức 4+ chiếm 18,18% Hình Khả đối kháng số chủng nấm Trichoderma nấm bệnh Fusarium sau ngày nuôi cấy Như vậy, qua trình nghiên cứu quan sát thí nghiệm, chúng tơi nhận thấy chủng nấm Trichoderma (Tri.01, Tri.05 Tri.07, Tri.11,) có khả phát triển hệ sợi nhanh, tốc độ kí sinh tiêu diệt nấm bệnh cao Chúng tuyển chọn chủng nấm Trichoderma có khả đối kháng mạnh nấm bệnh Fusarium (hiệu đối kháng >90%) làm đối tượng tiếp tục nghiên cứu Bảng Khả đối kháng nấm Trichoderma với nấm Fusarium Mức độ đối kháng Trichoderma Hiệu ức chế > 90% Hiệu ức chế 80 – 90% Hiệu ức chế 60 – 80% Hiệu ức chế 40 – 60% Hiệu ức chế < 40% Số chủng 11 Tên chủng Tri.01, Tri.05, Tri.07, Tri.11 Tri.02, Tri.03, Tri.06, Tri.08, Tri.19, Tri.09, Tri.10, Tri.12, Tri.14, Tri.15, Tri.16, Tri.17, Tri.18, Tri.20, Tri.21, Tri.22 Tỉ lệ số chủng (%) 18,18 22,73 50 Tri.13 4,54 Tri.04 4,54 Cuống sinh bào tử, bào tử Cuống sinh bào tử, bào tử chủng Tri.01 chủng Tri.07 Hình Cuống sinh bào tử, bào tử chủng Tri.01, Tri.07 3.4 Kết trình lên men xốp chủng nấm Trichoderma có khả đối kháng mạnh với chủng nấm bệnh Kết quan sát sinh trưởng phát triển nấm Trichoderma môi trường lên men xốp cho thấy sau ngày bào tử nấm Trichoderma bắt đầu xuất rãi rác; sang ngày thứ bào tử nấm Trichoderma phủ kín khắp mơi trường lên men xốp ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 3(88).2015 Bảng So sánh khả phát triển nấm Trichoderma qua công thức Công thức CT - 15g trấu + 15g cám gạo CT2 - 15g trấu + 15g cám bắp 107 Trichoderma nấm bệnh Fusarium thể qua Hình Bảng 5: Khả sinh trưởng 70% 100% 40% 80% Qua Bảng cho thấy tỉ lệ cám, trấu loại cám thành phần giá thể dùng để lên men xốp có ảnh hưởng đến số lượng bào tử nấm Trichoderma chế phẩm thu Trấu thành phần tạo bề mặt thơng thống, tạo điều kiện hiếu khí cho phát triển sinh bào tử nấm Trichoderma Tuy nhiên, tỷ lệ trấu nhiều có ảnh hưởng làm giảm số lượng bào tử chế phẩm Đồng thời, nấm Trichoderma phát triển tốt môi trường cám gạo so với cám bắp Cám bắp làm giảm độ thơng thống chất so với cám gạo, đưa dịch cấp vào môi trường trấu Cám bắp, chất có độ kết dính cao nên làm giảm khả phát triển nấm Trichoderma, sau ngày, bào tử nấm phát triển bao phủ 40% mơi trường Do đó, lựa chọn công thức CT1: - 15g trấu + 15g cám gạo để lên men xốp tao chế phẩm kháng nấmFusarium gây bệnh chuối Hình Khả đối kháng chế phẩm nấm Trichoderma nấm bệnh Fusarium theo ngày Bảng Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh Fusarium sau rắc chế phẩm nấm Trichoderma Ngày ni Hình Chế phẩm Trichoderma dạng bột sản xuất phương pháp lên men xốp theo công thức Chế phẩm Trichoderma dạng bột gồm chủng nấm Trichoderma: 5×106 bào tử/gam, chất hữu cơ: 50%; độ ẩm