NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN INTERLEUKIN-3 VÀ INTERLEUKIN-11 NGƯỜI DƯỚI DẠNG LAI VỚI PelB

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(3se): 94-99 NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN INTERLEUKIN-3 VÀ INTERLEUKIN-11 NGƯỜI DƯỚI DẠNG LAI VỚI PelB Nguyễn Thị Quý, Dương Thu Hương, Lê Ngọc Giang, Lê Thị Thu Hồng, Đỗ Thị Huyền, Trương Nam Hải* Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *tnhai@ibt.ac.vn TÓM TẮT: Interleukin-3 (IL-3) Interleukin-11 (IL-11) cytokine đa chức năng, đóng vai trị điều hịa nhân lên, biệt hóa trưởng thành nhiều loại tế bào máu Gen mã hóa cho protein IL-3 IL-11 người (mã số NM_000588 NM_000641 ngân hàng gen quốc tế) tổng hợp nhân tạo tín hiệu tiết pelB trình tự nhận biết hai enzyme hạn chế NdeI đầu 5' NotI đầu 3', đưa vào vector tách dòng pUC57 Sau tồn đoạn DNA chuyển vào vị trí NdeI- NotI vector biểu pET22b(+) để tiến hành biểu gen il-3, il-11 vi khuẩn E coli BL21 Kết cho thấy 37oC nồng độ chất cảm ứng 0,5 mM IPTG, IL-3 biểu hai dạng: dạng đơn (IL-3 nguyên vẹn cắt bỏ tín hiệu tiết PelB) có kích thước khoảng 15 kDa dạng lai với tín hiệu tiết PelB (khoảng 18 kDa) Protein IL-11 biểu mức độ thấp dạng đơn, có kích thước khoảng 19 kDa với kích thước protein IL-11 chuẩn Từ khóa: Escherichia coli, Interleukin-3, Interleukin-11, Isopropylthio-β-galactoside (IPTG), tín hiệu tiết PelB MỞ ĐẦU Interleukin-11 (IL-11) cytokine thuộc họ Interleukin-6, đóng vai trị điều hịa nhân lên, biệt hóa trưởng thành nhiều loại tế bào máu Theo Souto et al (2012) [6], protein IL-11 người tái tổ hợp sản xuất công nghệ DNA tái tổ hợp từ chủng E coli sử dụng tồn giới để phịng bệnh giảm tiểu cầu sau hóa trị liệu giảm nhu cầu truyền tiểu cầu bệnh nhân bị u tủy ác tính Interleukin (IL-3) cytokine có chất glycoprotein, tham gia vào trình tự đổi sống sót tế bào nguồn tạo máu, nhân lên, biệt hóa tế bào nguồn hoạt hóa chức bạch cầu trưởng thành [3] Trong số hệ biểu protein ngoại lai vi khuẩn Gram âm E coli hệ biểu thu hút nhiều quan tâm chúng có tốc độ sinh trưởng nhanh với mật độ tế bào cao môi chất không đắt tiền đặc điểm di truyền nghiên cứu đầy đủ Hơn nữa, thị trường thương mại nhiều loại vector tách dòng chủng đột biến hệ biểu Protein ngoại lai tổng hợp tế bào chất 94 E coli thường kèm với cuộn xoắn khơng xác tích tụ dạng thể vùi Mặc dù tạo thành thể vùi thuận lợi cho tinh việc tái cấu trúc để đảm bảo chức sinh học chưa hiệu Việc tiết protein vào khoang chu chất có nhiều ưu điểm, giảm phân cắt protein đích, tinh dễ dàng, protein độc với tế bào khu trú khoang chu chất Hầu hết protein tiết khoang chu chất protein dạng tan, có chức sinh học Khoang chu chất tế bào E coli chứa enzyme xúc tác việc tạo thành tái xếp cầu disulfide, protein tái tổ hợp biểu E coli thường định hướng vận chuyển đến [1] Có nhiều chuỗi tín hiệu xuất phát từ protein tiết tự nhiên OmpA, OmpT, PelB, β-lactamase alkaline phosphatase giúp vận chuyển polypeptide ngoại lai qua màng thiết kế dạng lai với chúng Người ta thường thiết kế thêm tín hiệu dẫn đường vào đầu N protein đích Chúng định hướng chuyển protein khoang chu chất sau bị cắt peptidase màng trong, phần protein cịn lại có hoạt tính định hướng tới khoang chu chất tế bào Theo Georgiou & Segatori (2005) [2], nhờ Nguyen Thi Quy et al tiến công nghệ biểu thời gian qua, nhiều protein động vật có vú sản xuất đặn dạng tiết, suất lên tới gam/lít Trong báo này, chúng tơi thiết kế tín hiệu tiết PelB trước gen il-3 il-11 để định hướng biểu protein IL-3 IL-11 người tái tổ hợp khoang chu chất E coli, đồng thời tránh gắn không mong muốn methionin vào đầu chuỗi polypeptide tổng hợp VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Gen il-3 il-11 tổng hợp hãng Genscript (Hoa Kỳ) tách dòng vector pUC57 Plasmid pET22b(+) dùng làm vector biểu Chủng E coli DH10b dùng cho mục đích tách dịng gen Chủng E coli BL21 (Invitrogen) dùng làm chủng biểu protein Enzyme hạn chế NotI, NdeI, DNA marker, protein chuẩn hãng Fermentas (Đức) Skimmed milked (Difco), 3,3′,5,5′Tetramethylbenzidine (TMB, Sigma) Protein tái tổ hợp IL-3 người chuẩn (Biovision) IL11 chuẩn (Sigma) dùng làm đối chứng dương Kháng thể kháng IL-3 (Bioworld) IL11 (Abcam) sử dụng cho phản ứng lai western blot Tất hóa chất khác mua từ hãng Merck Phương pháp Thiết kế plasmid mang gen il-3 il-11 Trình tự gen mã hóa protein IL-3 IL-11 người tổng hợp dựa trình tự gen mã số NM_000588 NM_000641 Ngân hàng gen quốc tế, trình tự amino acid IL-11 giống với trình tự amino acid IL-11 thương mại hãng Neumega (khơng có Prolin) Để định hướng protein tiết khoang chu chất đảm bảo methionin cắt khỏi protein đích, gen il-3 il-11 thiết kế thêm đoạn peptide dẫn đường pelB đầu gen Ngồi ra, trình tự nhận biết enzyme hạn chế NdeI NotI đưa vào hai đầu gen để thuận tiện cho việc tách dòng gen Trình tự cassette biểu gen il-3, il-11 gửi sang hãng Genscript để tổng hợp tách dịng vector pUC57 Sau đó, đoạn gen pelBil3, pelBil11 cắt khỏi vector tách dòng NdeI NotI nối vào vector pET22b(+) xử lý hai enzyme hạn chế để tạo thành vector pET22pelBil3, pET22pelBil11 Biểu gen il-3 il-11 Các tế bào E coli mang vector biểu pET22pelBil3, pET22pelBil11 ni cấy mơi trường Luria Broth có ampicillin (LBamp) nồng độ 100 µg/ml qua đêm 37oC, 200 vịng/phút chuyển sang sang môi trường LBamp cho OD600 ban đầu 0,1 Tiếp tục nuôi cấy điều kiện OD600=0,4-0,6 bổ sung 0,5 mM Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) để cảm ứng promoter tổng hợp protein ngoại lai 37oC thu mẫu sau nuôi cấy cảm ứng Tế bào thu lại cách ly tâm hòa lại đệm TrisHCl 20 mM cho OD600=10 Sau đó, tế bào xử lý trực tiếp đệm xử lý mẫu để giải phóng protein tổng số Protein tổng số có chứa protein tái tổ hợp phân tích SDS-PAGE Western blot Tính kháng nguyên IL-3 IL-11 đánh giá thông qua khả liên kết với kháng thể đặc hiệu Mẫu protein điện di biến tính gel SDS-PAGE 15% chuyển màng chuyển màng BioRad giờ, 120 V Màng lấy phủ sữa tách béo 5%, ủ với kháng thể kháng thể kháng IL-3 (hoặc IL-11) người Sau bước rửa đệm TBS 1X, màng tiếp tục ủ với kháng thể cộng hợp với enzyme peroxidase màu với 3,3′,5,5′Tetramethylbenzidine (TMB) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thiết kế plasmid mang gen il3 il11 để biểu E coli Các gen il-3, il-11 người có kích thước tương ứng 405 bp 537 bp Khi gắn pelB trình tự nhận biết enzyme hạn chế vào đầu 5', kích thước gen tăng lên tương ứng 488 bp 620 bp (hình 1) Do vector có thêm trình tự nhận biết NdeI nên cắt cặp enzyme hạn chế vector bị cắt thành hai đoạn có kích thước khoảng 2,5 kb 0,25 kb (hình 1) 95 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(3se): 94-99 bp M Gen il-3 il-11, pET22b(+) sau xử lý với NdeI NotI phân tách gel agarose tinh kít Qiagen Cả ba đoạn DNA pET22b(+), il3, il11 giới hạn NdeI+NotI có kích thước 5,37 kb, 488 bp, 620 bp cắt tinh hiệu (hình 2) Các đoạn gen il-3, il-11 nối vào vector pET22b(+) để tạo thành vector pET22pelBil3 pET22pelBil11 Sự có mặt gen il-3, il-11 vector biểu kiểm tra cặp enzyme hạn chế NdeI NotI (hình 3) giải trình tự gen (kết khơng trình bày) 10000 6000 4000 3000 2500 2000 1500 1000 750 500 250 Hình DNA plasmid xử lý enzyme hạn chế pUC57pelBil11/NdeI+NotI; 2: pUC57pelBil3/NdeI+NotI; M: DNA marker kb bp M bp M 10000 6000 10000 6000 2500 2000 2500 2000 1500 1500 1000 1000 750 750 500 500 250 250 Hình pET22b(+), gen pelBil3 pelBil11 tinh sau xử lý NotI NdeI Hình Cắt kiểm tra vector biểu mang gen enzyme hạn chế pET22b(+)/NdeI+NotI; 2: pelBil3/NdeI+NotI; 3: pelBil11/NdeI+NotI; M: DNA marker 1kb (fermentas) pET22pelBil3/NdeI+NotI; 2: pET22pelB il11/NdeI+NotI; M: DNA marker kb (fermentas) a kDa 116, 66,2 45,0 35,0 M DC K b kDa M P DC K 70 55 40 35 25 25,0 18,4 14,4 15 10 Hình Kiểm tra protein biểu từ dòng E coli BL21 mang pETpelBil3 Coomassie (a) phản ứng lai western blot (b) 1-6 dịng mang pETpelBIL-3; DC: chủng đối chứng khơng mang gen; K chủng mang gen không cảm ứng IPTG; M1 thang protein chuẩn (Fermentas); M2 thang protein màu chuẩn (Fermentas); P: protein chuẩn hIL3 (Biovision) 96 Nguyen Thi Quy et al Biểu gen il-3 il-11 E coli Vector tái tổ hợp mang gen pelBil-3 il-11 biến nạp vào tế bào biểu E coli BL21 Các dịng biến nạp ni cấy mơi trường LBamp cảm ứng với IPTG Dịch phá tế bào điện di biến tính gel SDSPAGE 15% để kiểm tra có mặt protein quan tâm (hình 5) Kết nhuộm Coomassie hình 4a cho thấy sau cảm ứng, tất dòng biến nạp (16) biểu protein ngoại lai, thể với băng protein có kích thước khoảng 15 kDa tương ứng với kích thước protein IL-3 băng protein khác có kích thước khoảng gần 18 kDa, dòng đối chứng âm (đường chạy DC) dòng mang vector pET22b(+) dòng mang gen không cảm ứng IPTG (đường chạy K) không cho hai băng protein Theo lý thuyết, đoạn peptide tín hiệu PelB có kích thước khoảng 2,42 kDa Sự xuất băng protein có kích thước khoảng 18 kDa điện di đồ cho băng protein IL-3 gắn với PelB trình biểu phần protein IL-3 cắt khỏi đoạn peptide tín hiệu Để chứng minh lập luận trên, phản ứng lai western blot dựa liên kết đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể thực Kết phân tích miễn dịch Hình 4b cho thấy có hai băng màu xuất đánh dấu mũi tên, băng protein IL-3 (khoảng 15 kDa) IL-3 liên kết với PelB (khoảng 18 kDa) Kết liên kết a kDa 116, 66,2 45,0 35,0 25,0 18,4 14,4 K DC P M1 miễn dịch hoàn toàn thống với kết phân tích SDS-PAGE Như đề cập trên, để protein biểu dạng tiết người ta thường thiết kế thêm tín hiệu tiết vào đầu N protein đích Tuy nhiên, hiệu suất biểu thường thấp nhiều tất protein biểu tiết vào khoang chu chất mà cịn tìm thấy mơi trường, tế bào chất màng nguyên sinh chất [1, 7] Kết biểu protein IL-3 từ chủng E coli tái tổ hợp thiết kế giống trường hợp Mặc dù thiết kế gắn thêm pelB vào đầu gen phần protein biểu cắt khỏi PelB phần lại gắn với tín hiệu tiết Theo Mergulhao et al (2005) [5], kích thước protein ảnh hưởng đến hiệu tiết Thành phần amino acid peptide tín hiệu protein đích đóng vai trị quan trọng Tốc độ vận chuyển protein ngoại lai khoang chu chất bắt nguồn từ khả tiết hạn chế máy vận chuyển E coli Khi khả bị lấn át phần lớn protein biểu dạng thể vùi Vì việc tối ưu mức độ biểu điều quan trọng Tương tự vậy, dòng biến nạp với gen il-11 nuôi cấy cảm ứng với IPTG để phân tích biểu protein IL-11 người tái tổ hợp dịch phá tế bào Sự biểu protein ngoại lai phân tích gel SDS-PAGE phản ứng lai western blot (hình 5) b kDa K DC P M2 DC 170 70 55 40 35 25 15 10 Hình Kiểm tra protein biểu từ dòng E coli BL21 mang pETpelBil11 Coomassie (a) phản ứng lai western blot (b) 1-5 dòng mang vector pETpelBil11; ĐC chủng đối chứng không mang gen; K chủng mang gen không cảm ứng IPTG; P: protein chuẩn human IL-11 (Sigma); M1 thang protein chuẩn (Fermentas); M2 thang protein màu chuẩn (Fermentas) 97 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(3se): 94-99 Kết nhuộm Coomassie hình 5a cho thấy so với dịng đối chứng (ĐC) dịng khơng cảm ứng IPTG (K) dịng cịn lại khơng quan sát thấy băng protein khác biệt kết lai với kháng thể kháng IL-11 người (hình 5b) cho băng bắt màu yếu, tương ứng với kích thước protein IL-11 chuẩn (đường chạy P, mũi tên) dòng số 1, 3, Như IL-11 biểu chủng chủ dạng đơn, không giống trường hợp IL-3 Mức độ biểu yếu IL-11 chủng tái tổ hợp liên quan đến cấu trúc gen il-11 tính chất protein tạo Thành phần nucleotide gen liên quan đến mã ba mã hóa cho amino acid Khi phân tích phù hợp gen il-11 chủng chủ thấy thành phần GC gen lên tới 71,13% số phù hợp codon 0,61 Thông thường để gen biểu tốt chủng chủ số phù hợp codon lớn 0,8 thành phần GC nằm ngưỡng 30-70% Mức độ biểu protein ngoại lai chủng chủ phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác Theo Mehlin at el (2006) [4], phù hợp gen, kích thước phân tử, điểm đẳng điện (PI) protein đích E coli liên quan mật thiết đến khả biểu chủng chủ KẾT LUẬN Gen il-3 il-11 thiết kế gắn với tín hiệu tiết pelB đưa vào vector biểu pET22b(+) biểu tế bào E coli BL21 Protein IL-3 tái tổ hợp tạo dạng đơn dạng lai với tín hiệu tiết PelB protein IL-11 biểu dạng đơn Phân tích miễn dịch cho thấy protein IL-11 biểu mức độ thấp, thể tín hiệu yếu với kháng thể kháng IL-11 Lời cảm ơn: Cơng trình thực từ nguồn kinh phí đề tài độc lập cấp nhà nước “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao dùng y học (điều trị)” giai đoạn 2013-2015 Cơng trình có sử dụng trang thiết bị Phịng 98 thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Gen TÀI LIỆU THAM KHẢO Baneyx F., 1999 Recombinant protein expression in Escherichia coli Curr Opin Biotechnol., 10(5): 411-21 Georgiou G., Segatori L., 2005 Preparative expression of secreted proteins in bacteria: status report and future prospects Curr Opin Biotechnol., 16(5): 538-545 Kaushansky K., Shoemaker S G., Broudy V C., Lin N L., Matous J V., Alderman E M., Aghajanian J D., Szklut P J., VanDyke R E., Pearce M K., 1992 Structurefunction relationships of interleukin-3 An analysis based on the function and binding characteristics of a series of interspecies chimera of gibbon and murine interleukin-3 J Clin Invest., 90(5): 1879-1888 Mehlin C., Boni E., Buckner F S., Engel L., Feist T., Gelb M H., Haji L., Kim D., Liu C., Mueller N., Myler P J., Reddy J T., Sampson J N., Subramanian E., Van Voorhis W C., Worthey E., Zucker F., Hol W G., 2006 Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum: results from 1000 genes Mol Biochem Parasitol., 148(2): 144-160 Mergulhao F J M., Summers D K., Monteiro G A., 2005 Recombinant protein secretion in Escherichia coli Biotechnology Advances 23: 177-202 Souto R B., Stamm F P., Ribela M T., Bartolini P., Calegari G Z., Dalmora S L., 2012 Validation of a stability-indicating RP-LC method for the assessment of recombinant human interleukin-11 and its correlation with bioassay Anal Sci., 28(3): 215-220 http://www.embl.de/pepcore/pepcore_servic es/protein_expression/ecoli/improving_prot ein_solubility/ Nguyen Thi Quy et al DESIGNING RECOMBINANT ESCHERICHIA COLI STRAIN FOR EXPRESSION OF INTERLEUKIN-3 AND INTERLEUKIN-11 IN FUSION FORM WITH PelB Nguyen Thi Quy, Duong Thu Huong, Le Ngoc Giang, Le Thi Thu Hong, Do Thi Huyen, Truong Nam Hai Institute of Biotechnology, VAST SUMMARY Interleukin-3 Interleukin-11 are multifunctional cytokine, which modulates the proliferation, differentiation and maturation of various types of hematopoietic cells Genes coding for IL-3 and IL-11 (NM_000588 and NM_000641 from GenBank) linked with pelB leader and restriction sequences of NdeI (5’end), NotI (3’end) were synthesized and then introduced into a cloning vector pUC57 The gene cassets were incorporated into pET22b(+) at restriction sites for expression of il3 and il11 genes in E coli BL21 Following induction with 0.5 mM IPTG at 37oC, a band of 15 kD, corresponding to the size of IL-3 protein (cleavage of PelB signal sequence) and another band of about 18 kD, corresponding to the size of IL-3 protein in fusion with PelB IL-11 protein was expressed with a very faint band of about 19 kD, corresponding to the human IL-11 size Keywords: Escherichia coli, Interleukin-3 Interleukin-11, Isopropylthio-β-galactoside (IPTG), pelB leader Ngày nhận bài: 30-6-2013 99