PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CHẤT HỮU CƠ VÀ KHÁNG KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 57, Số chuyên đề Thủy sản (2021): 99-106 DOI:10.22144/ctu.jvn.2021.069 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CHẤT HỮU CƠ VÀ KHÁNG KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Phạm Thị Tuyết Ngân*, Vũ Hùng Hải, Vũ Ngọc Út Huỳnh Trường Giang Bộ môn Thủy sinh học ứng dụng, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ *Người chịu trách nhiệm viết: Phạm Thị Tuyết Ngân (email: pttngan@ctu.edu.vn) Thông tin chung: Ngày nhận bài: 22/02/2021 Ngày nhận sửa: 07/05/2021 Ngày duyệt đăng: 01/06/2021 Title: Isolation and selection of actinomycetes capable of biodegradation and antimicrobial activity in aquaculture Từ khóa: Hoạt tính enzyme, kháng khuẩn, phân lập, streptomyces, xạ khuẩn Keywords: Actinomycetes, antimicrobial activity, enzyme activity, isolation, streptomyces ABSTRACT The The study is aimed to isolate and screen potential actinomycetes from shrimp pond sediments that being capable of biodegradation and antimicrobial activity against Vibrio parahaemolyticus in vitro Total of 40 sediment samples were collected in extensive shrimp ponds located in Tra Vinh, Bac Lieu and Ca Mau province Results showed that 161 strains were able to grow on Starch Casein Agar (SCA) medium, in which 54 strains were identified as Streptomyces genus with the characteristics of gram-positive cell, catalase positive, oxidase negative and spore formation Out of the 54 Streptomyces isolates, 12 strains performed the antimicrobial activity against Vibrio parahaemolyticus with a mean inhibition zone ranged from 2.3 to 32.8 mm, especially 04 strains, CM1.1, CM2.4, DH3.4 and TV1.4 possessed the largest zone In addition, DH3.4 strain was greatly potential for the relatively high enzyme activities such as α-amylase, protease and cellulase Therefore, these strains could be used for in vitro and in vivo further experiments in aquaculture TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm phân lập sàng lọc số chủng xạ khuẩn từ bùn đáy ao ni tơm có khả phân hủy hữu kháng Vibrio parahaemolyticus điều kiện in vitro Tổng cộng 40 mẫu bùn thu từ ao nuôi tôm Trà Vinh, Bạc Liêu Cà Mau Kết phân lập 161 chủng có khả phát triển mơi trường Starch Casein Agar (SCA), 54 chủng có đặc điểm nhận dạng giống với giống Streptomyces với đặc điểm hình thái tế bào gram dương, dương tính với catalase, âm tính với oxidase có khả hình thành bào tử Trong số 54 chủng, 12 chủng thể hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticus với đường kính vịng vơ trùng dao động 2,3-32,8 mm, 04 chủng CM1.1, CM2.4, DH3.4 TV1.4 thể hoạt tính kháng cao Bên cạnh đó, chủng DH3.4 coi tiềm với khả sinh hoạt tính enzyme α-amylase, protease cellulase tương đối cao Do đó, chủng sử dụng cho nghiên cứu in vitro and in vivo ứng dụng nuôi trồng thủy sản 99 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 57, Số chuyên đề Thủy sản (2021): 99-106 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp thu mẫu GIỚI THIỆU Thủy sản Việt Nam nói chung Đồng sơng Cửu Long nói riêng ngành đầu tư phát triển mạnh Tuy nhiên năm gần đây, việc thâm canh hóa với mật độ cao kèm khí hậu thay đổi thất thường làm bùng phát dịch bệnh động vật thủy sản, chất lượng nước môi trường nuôi bị ô nhiễm làm giảm sản lượng nuôi Mặt khác, việc sử dụng thuốc kháng sinh để trị bệnh động vật thủy sản thường xuyên khơng liều lượng tạo số dịng vi khuẩn kháng thuốc Các ao nuôi tôm thuộc khu vực tỉnh Trà Vinh, Bạc Liêu, Cà Mau chọn để thu mẫu Mẫu bùn thu dụng cụ PVC ( 49 mm) theo mô tả Somsiri et al (2006) Hỗn hợp bùn thu dụng cụ ống PVC loại bỏ nước thông qua lỗ thân ống, sau lớp bùn mặt có độ dày 2-5 cm thu vào túi nhựa Mẫu bùn thu 4-5 điểm xung quanh ao, sau trộn mẫu lại với để đồng mẫu bảo quản thùng lạnh, vận chuyển phòng thí nghiệm để tiến hành xử lý phân lập 2.2 Phân lập nhận dạng xạ khuẩn Vì vậy, cần phải có giải pháp cải thiện chất lượng môi trường nuôi mà không ảnh hưởng đến động vật thủy sản người Hiện nay, việc sử dụng vi sinh vật hữu ích vào ni trồng thủy sản nhằm khắc phục vấn đề giải pháp ứng dụng rộng rãi Theo Bao and Shen (2005), hệ thống nuôi thủy sản bền vững cần có diện nhóm vi khuẩn có lợi (beneficial microorganisms), nhóm vi khuẩn khơng chứa độc tố, không hiệu ứng phụ, không tồn lưu không kháng kháng sinh, nhiên nhóm vi khuẩn hiệu việc cải thiện môi trường tăng hệ miễn dịch vật ni, giảm stress trì trạng thái cân hệ sinh thái thủy vực Xạ khuẩn biết đến đối tượng quan trọng sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học (Sanglier, 1993; Mitra et al., 2008) Xạ khuẩn nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi đất, chúng tham gia vào trình phân giải hợp chất hữu đất nhờ hoạt chất enzyme protease, amylase, cellulase, góp phần khép kín vịng tuần hồn vật chất tự nhiên (Prakash, 2013) Đặc tính cịn ứng dụng trình chế biến phân huỷ rác Trong trình sống xạ khuẩn tiết nhiều chất có hoạt tính sinh học cao có khả kháng lại loài vi sinh vật khác bao gồm nấm vi khuẩn Trong số 23,000 hợp chất có hoạt tính sinh học sản xuất từ vi sinh vật, 10,000 hợp chất phân lập từ xạ khuẩn (Watve et al., 2001) Trong khoảng 8.000 chất kháng sinh biết giới có 80% số có nguồn gốc từ xạ khuẩn Việc tìm kiếm chủng xạ khuẩn có khả ứng dụng cao nuôi trồng thủy sản tìm loại mơi trường để chúng phát triển tối ưu phục vụ cho ao nuôi tôm, cá cần thiết Để nghiên cứu việc ứng dụng chủng xạ khuẩn thủy sản, đề tài “Phân lập tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có khả phân hủy chất hữu kháng khuẩn ứng dụng nuôi trồng thủy sản” tiến hành Một gram mẫu bùn ao pha loãng (10-1, 10-2, 10-3) với nước muối sinh lý tiệt trùng (0,85% NaCl) trải môi trường đĩa thạch SCA (Starch Casein Agar) (bổ sung 1,5% NaCl) bổ sung nystatin (25 μg/mL) nalidixic acid (20 μg/mL) để hạn chế phát triển nấm vi khuẩn khác (Takizawa et al., 1993) Đĩa thạch ủ 30 C khoảng ngày Sau đó, khuẩn lạc với hình dạng kích thước khác chọn để tách rịng mơi trường thạch SCA đến thu khuẩn lạc thuần, tiến hành nhuộm Gram (Hucker & Conn, 1923) kiểm tra phản ứng với catalase, oxidase Các đặc điểm sinh lý sinh hóa xác định dựa theo cẩm nang Cowan and Steels (Barrow & Feltham, 1993) kết hợp với sử dụng kit API 20E (BioMerieux, France) Các chủng Gram (+) dương tính với Catalase, Oxidase âm tính, chọn ni tăng sinh trữ lạnh -80⁰C với 25% glycerol cho nghiên cứu sau 2.3 Sàng lọc chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn Thí nghiệm khảo sát khả sinh hoạt tính kháng khuẩn phương pháp cấy vệt vng góc theo mơ tả trước Chythanya et al (2002) Das et al (2010) Cụ thể, chủng xạ khuẩn phân lập cấy vào trung tâm đĩa thạch NA (bổ sung 1% NaCl) đường thẳng (rộng khoảng 0,5 cm), ủ đĩa 30C ngày Chủng vi khuẩn gây bệnh V parahaemolyticus sử dụng nghiên cứu phân lập từ tôm bị bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) lưu trữ phịng thí nghiệm Vi sinh vật hữu ích- Bộ mơn Thủy sinh học Ứng dụng Khoa Thủy sản – Trường Đại học Cần Thơ phục hồi môi trường NA (bổ sung 1,5% NaCl) Sau cấy chủng vi khuẩn Vibrio đường vng góc 90 với vệt cấy xạ khuẩn Quan sát khả đối kháng sau 24 30C cách đo đường vô 100 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 57, Số chuyên đề Thủy sản (2021): 99-106 trùng chủng xạ khuẩn với chủng vi khuẩn Vibrio Mức độ kháng đánh giá thơng qua đường kính vịng vô trùng so với tiêu chuẩn Lorian (1995) (Kháng: ≤ mm; Trung bình: ≥ 10 – 13 mm; Nhạy: ≥ 14 mm) 2.4 Đánh giá hoạt tính enzyme ngoại bào g/L KCl; 1,0 g/L NaNO3; 1,0 g/L K2HPO4; 0,5 g/L MgSO4; 0,5 g/L yeast extract; 10 g/L NaCl) bổ sung 1% Sodium carboxymethyl cellulose (Na-CMC) Sau ngày nuôi, thu dịch CFS phương pháp ly tâm để xác định hoạt tính enzyme theo mơ tả Ghose (1987) có điều chỉnh Phản ứng bao gồm 0,5 mL dung dịch 1% Sodium carboxymethyl cellulose (được chuẩn bị dung dịch đệm Citrate 0,05 M; pH 5,0) 0,5 mL dịch enzyme vi khuẩn ủ 50C 30 phút, sau Thêm 1,5 mL dung dịch thuốc thử DNS (Miller, 1959) vào phản ứng đun nóng 100C 10 phút Sau đó, đo độ hấp thụ bước sóng 540 nm phương pháp so màu quang phổ Một unit enzyme xác định lượng enzyme phóng thích mol glucose điều kiện chuẩn 2.5 Phương pháp xử lý số liệu Các chủng xạ khuẩn kháng V parahaemolyticus chọn để tiến hành đánh giá hoạt tính enzyme ngoại bào điều kiện in vitro: Hoạt tính protease: chủng xạ khuẩn chọn lọc ni mơi trường khống (bao gồm glucose 0,5 g/L; KNO3 0,6 g/L; peptone 10 g/L; MgSO4.7H2O 0,5 g/L, NaCl 10 g/L; CaCl2 1,0 g/L K2HPO4 0,5 g/L) bổ sung 1% casein (Abdullah Al-Dhabi et al., 2020) Sau ngày nuôi 30℃ tiến hành thu dịch (Cell-free supernatant, CFS) phương pháp ly tâm lạnh vận tốc 8.500 vòng 10 phút 4℃ xác định hoạt tính enzyme protease dựa theo mô tả Huynh et al (2018) sau: 100 L dịch CFS ủ với 100 L dung dịch 1% casein (pha dung dịch đệm Tris-HCl, pH 7,0) 10 phút 37C 500 L dung dịch 5% Trichloroacetic acid thêm vào để ngừng phản ứng Sau 20 phút, hỗn hợp ly tâm tốc độ 3.000 rpm 10 phút 4C thu phần dịch bên để xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Lowry (1951) Một unit (UI) enzyme tương ứng với lượng enzyme phóng thích g tyrosine điều kiện chuẩn Số liệu tính giá trị trung bình độ lệch chuẩn chương trình Excel phân tích thống kê ANOVA nhân tố sử dụng phép thử Duncan chương trình SPSS 16,0 mức ý nghĩa thống kê (p0,05) hai chủng TV1.4 CM1.1 Kết ghi nhận hoạt tính cellulose cho thấy chủng CM2.4 DH3.4 đạt giá trị 119±7,6 U/mL, 84±7,7 U/mL, cao có ý nghĩa (p0,05) Sau kiểm tra khả kháng V parahaemolyticus, chủng có kết hoạt tính cao (CM1.1, CM2.4, DH3.4, TV1.4) chọn để kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào (Hình 3) Kết đánh giá cho thấy hoạt tính protease chủng TV1.4 (183,9±10,5 U/mL) DH3.4 (174,9±8,5 U/mL) cao khác biệt có ý nghĩa so với chủng cịn lại (p