(LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tính an toàn và tác dụng kháng u sarcoma 180 của cốm cây sói rừng sarcandra glabra (thunb ) nakai trên thực nghiệm

TỔNG QUAN

UNG THƯ VÀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRONG UNG THƯ

Ung thư là thuật ngữ chung chỉ một nhóm bệnh gồm 200 loại khác nhau, có nguyên nhân, tiến triển, phương pháp điều trị và tiên lượng khác nhau Tất cả các loại ung thư đều có điểm chung là khả năng xâm lấn, phát triển và tồn tại trong các cơ quan khác của cơ thể Đây là bệnh ác tính, trong đó các tế bào ung thư tăng sinh nhanh chóng, vô tổ chức và thường xâm lấn vào các mô xung quanh, gây rối loạn chức năng của các cơ quan.

Ung thư không phải là kết quả của một nguyên nhân duy nhất, mà mỗi loại ung thư lại có những nguyên nhân riêng biệt Các nguyên nhân gây ung thư có thể được phân chia thành hai nhóm chính: nguyên nhân bên ngoài và nguyên nhân bên trong.

1.1 2.1 Các nguyên nhân từ bên ngoài

Tác nhân vật lý như tia phóng xạ từ các chất phóng xạ tự nhiên hoặc nhân tạo, cũng như tia cực tím từ ánh nắng mặt trời, có thể ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp lên DNA Chúng tạo ra nhiều gốc tự do, dẫn đến sự thay đổi cấu trúc DNA, từ đó làm tăng nguy cơ hình thành các bệnh di truyền và ung thư.

Tác nhân hóa học bao gồm các hóa chất được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, chiến tranh và thực phẩm hàng ngày Chúng có mặt trong các chất bảo quản thực phẩm như thịt, cá, lạp xưởng, jămbon, cũng như trong các sản phẩm thực phẩm ướp muối Ngoài ra, các tác nhân hóa học còn tồn tại dưới dạng chất thải môi trường, bao gồm khói thuốc lá, thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu, amiăng, dioxin và các gốc tự do.

Tác nhân sinh học, chủ yếu là virus, đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của ung thư Các loại virus được nghiên cứu nhiều nhất bao gồm virus viêm gan B và C, virus gây u nhú ở người (HPV) và virus Epstein – Barr (EBV) Bên cạnh đó, sán Schistosoma và vi khuẩn Helicobacter Pylori (HP) cũng được xem là nguyên nhân gây ra một số loại ung thư như ung thư bàng quang và ung thư dạ dày.

Nội tiết tố có thể làm tăng nguy cơ ung thư, đặc biệt là estrogen, thường được sử dụng để giảm triệu chứng mãn kinh và nguy cơ bệnh tim mạch Tuy nhiên, việc sử dụng estrogen lại liên quan đến việc tăng nguy cơ ung thư nội mạc tử cung.

Enzym và chất vi lượng đóng vai trò quan trọng trong cơ thể; tuy nhiên, nồng độ cao của một số ion như Fe++ và Cu++ có thể dẫn đến hiện tượng tách nước, hình thành gốc superoxid gây độc hại Sự suy giảm hoạt động của enzym SOD cũng có thể làm tăng nguy cơ ung thư.

Các gốc tự do có khả năng hoạt hóa hóa học mạnh mẽ và phản ứng nhanh chóng với các phân tử sinh học, dẫn đến tổn thương DNA và tạo điều kiện cho sự hình thành ung thư.

Yếu tố di truyền đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của ung thư, với khoảng 5% - 10% các loại ung thư có nguồn gốc từ đột biến gen di truyền từ cha mẹ Một số hội chứng ung thư nổi bật liên quan đến yếu tố di truyền bao gồm bệnh đa u tuyến nội tiết, hội chứng Li-Fraumeni và hội chứng Turcot.

Suy giảm miễn dịch và AIDS làm tăng nguy cơ nhiễm virus, bao gồm cả những virus có khả năng gây ung thư như EBV và CMV Người nhiễm HIV, đặc biệt trong giai đoạn AIDS, có nguy cơ cao mắc các loại ung thư như sarcom Kaposi, u lympho không Hodgkin, ung thư vòm họng và ung thư cổ tử cung.

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh ung thư: cơ chế bệnh sinh của ung thư còn nhiều điểm chưa được sáng tỏ Đa số ung thư là do đột biến DNA ở tế bào gốc khi tế bào tiếp xúc với các yếu tố gây ung thư và do sai lệch sự tái sao chép DNA bên trong tế bào Có bốn nhóm gen liên quan đến quá trình phát sinh, phát triển của bệnh ung thư:

Nhóm gen gây ung thư (oncogenes) là tập hợp các gen có khả năng thúc đẩy sự hình thành và phát triển bệnh ung thư khi hoạt động quá mức Những oncogen này phát sinh từ các tiền gen ung thư (pro-oncogen), vốn là các gen bình thường chỉ hoạt động trong giai đoạn phôi và có vai trò trong việc khởi động sự phát triển và biệt hóa tế bào Chức năng chính của tiền gen sinh ung là điều hòa tín hiệu tế bào, giúp tế bào nhận biết các kích thích cần thiết cho sự phân bào và chết theo lập trình Khi tiền gen này bị đột biến, nó sẽ dẫn đến sự tăng sinh tế bào không kiểm soát, biến thành gen sinh ung thư Hiện nay, đã có hơn 50 loại gen sinh ung thư được phát hiện, bao gồm các gen như APC, myc, ras.

Gen ức chế ung thư (tumor suppressor genes) mã hóa cho các protein kiểm soát chu kỳ phân bào, thường dừng lại ở pha G1, và có vai trò trong việc biệt hóa tế bào cũng như kích thích quá trình chết theo chương trình Khi các gen này bị đột biến, chúng có thể biến đổi tế bào lành thành tế bào ác tính Một số gen ức chế ung thư đã được phát hiện bao gồm BRCA-1, BRCA-2, NF-1, NF-2, WT-1, Rb và p53.

Nhóm gen điều hòa chết tế bào theo chương trình đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng giữa tế bào mới và tế bào già trong cơ thể người trưởng thành Khi cơ chế này bị rối loạn, có thể dẫn đến ung thư do sự phân chia tế bào không giới hạn và thiếu biệt hóa Một số gen như bcl-2, bcl-xL, bax, bad, bcl-xS, p53 và myc đã được xác định có liên quan đến quá trình này Cụ thể, p53 khi được kích hoạt thúc đẩy tế bào vào quá trình apoptosis, trong khi đột biến gen myc kích thích sự phân chia tế bào Sự chết theo chương trình của tế bào không chỉ điều chỉnh sự phát triển của khối u mà còn góp phần ngăn chặn hoặc làm chậm tiến triển của nhiều bệnh, bao gồm cả AIDS.

Nhóm gen sửa chữa DNA đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sự toàn vẹn của bộ gen bằng cách sửa chữa các thương tổn do tác nhân gây hại từ môi trường Mặc dù các gen này không trực tiếp gây ra ung thư, nhưng chúng có thể tạo điều kiện cho sự xuất hiện đột biến trong các gen khác trong quá trình phân chia tế bào bình thường.

QUAN NIỆM VỀ UNG THƯ TRONG Y HỌC CỔ TRUYỀN

Trong y học cổ truyền (YHCT), danh từ “Ung thư” dùng để chỉ các loại ung nhọt phát sinh cấp tính (ung), hoặc mạn tính (thư) [50] Trong các sách

Khái niệm “Linh khu” và “Chư bệnh nguyên hậu luận” đã được mô tả qua các thuật ngữ như “thạch thư” liên quan đến ung thư xương và “thạch ung” dùng để chỉ ung thư hạch.

Sau triều đại Kim Nguyên ở Trung Quốc cho đến nay thường dùng cụm từ

"Thũng lựu" là thuật ngữ chỉ các loại ung thư nói chung, trong khi "Nham" (đá núi) được dùng để chỉ ung thư ác tính do đặc điểm bờ khối u nham nhở và cứng như đá Do đó, ung thư trong y học hiện đại được xem là nham chứng trong YHCT.

Ngoại nhân là sáu yếu tố thời tiết trong môi trường xung quanh, có thể tác động mạnh mẽ đến con người, đặc biệt khi cơ thể suy yếu Những yếu tố này, được gọi là lục dâm, bao gồm phong, hàn, thử, thấp, táo và hỏa, có khả năng xâm nhập vào cơ thể và gây ra bệnh.

Lục dâm gây trở ngại cho kinh lạc, dẫn đến khí huyết bị ứ trệ Nếu tình trạng này kéo dài mà không được giải tỏa, kinh lạc sẽ bị tắc nghẽn, tạo điều kiện cho tà độc tích tụ và phát sinh bệnh tật.

Theo "Linh khu – Cửu châm luận", gió từ tám hướng có thể xâm phạm kinh lạc và dẫn đến ung bướu Sách "Y tông kim giám" chỉ ra rằng hỏa ứ trệ sẽ hình thành độc tố gây bệnh Thêm vào đó, "Linh khu – Bách bệnh sử sinh thiên" nhấn mạnh rằng sự ứ trệ thường do hàn gây ra, và nếu tình trạng này kéo dài, sẽ hình thành u.

Sự phát sinh và phát triển của Nham chứng có mối liên hệ chặt chẽ với các yếu tố di truyền, virus, vi lượng, dinh dưỡng và ô nhiễm môi trường Những yếu tố này hoàn toàn phù hợp với quan điểm của YHHĐ, nhấn mạnh rằng hoàn cảnh sống và thói quen sinh hoạt đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành khối u Các tác nhân như bức xạ mặt trời, hóa chất độc hại, chất phóng xạ, và thực phẩm nhiễm độc từ thuốc trừ sâu, chất phụ gia, và chất bảo quản đều có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh.

Nội nhân bao gồm 7 trạng thái tình cảm: hỉ, nộ, ưu, tư, bi, kinh, khủng, và khi phát triển quá mức, chúng có thể gây bệnh Trong YHCT, các trạng thái này được gọi là thất tình Bên cạnh đó, nội nhân còn liên quan đến sự suy nhược của chính khí, rối loạn âm dương, sự vận hành bất thường của khí huyết, và sự suy yếu của công năng tạng phủ.

YHCT nhấn mạnh rằng chứng nham do nội nhân gây ra, với chính khí suy nhược tạo điều kiện cho ngoại tà xâm nhập vào kinh lạc và tạng phủ, ảnh hưởng đến chính khí và lưu thông khí huyết, dẫn đến khí trệ, huyết ứ, và đàm ngưng Độc tích tích tụ lâu ngày có thể hình thành u cục Theo y văn cổ, nguyên nhân gây ung thư vú (Nhũ nham) là do tình chí lo lắng, cáu giận lâu dài khiến tỳ khí tiêu hao, can khí tích trệ, tạo thành hạch Sách Cảnh nhạc toàn thư cũng chỉ ra rằng u thực quản hình thành do ưu tư, uất kết bên trong Quan điểm này tương đồng với y học hiện đại, cho rằng tâm lý bất lợi kéo dài có thể làm suy giảm chức năng miễn dịch, tạo điều kiện cho sự hình thành mầm mống ung bướu.

1.2.2.3 Yếu tố bất nội ngoại nhân

Y học cổ truyền (YHCT) nhấn mạnh rằng bên cạnh các yếu tố bên ngoài và bên trong, việc ăn uống không điều độ là một nguyên nhân quan trọng có thể dẫn đến ung thư ác tính.

Sách “Tố vấn - Dị pháp phương nghi luận” nhấn mạnh rằng việc tiêu thụ nhiều thực phẩm có tính hỏa có thể dẫn đến sự tích tụ nhiệt trong cơ thể, từ đó gây ra các bệnh tật, đặc biệt là các loại ung nhọt.

Trong sách “Y môn pháp luật”, một nguyên nhân gây ế cách và phản vị được chỉ ra là do uống rượu quá nhiều Còn theo “Y học thống chỉ”, ung thư thực quản và dạ dày có thể do ăn uống đồ cay nóng và thực phẩm khó tiêu, dẫn đến tích trệ trong dạ dày và tổn thương trường vị Nghiên cứu dịch tễ học hiện nay cũng đã chứng minh mối liên quan giữa việc tiêu thụ thực phẩm nóng trong thời gian dài và sự phát triển ung thư thực quản.

1.2.3 Cơ chế bệnh sinh của nham chứng

Y học cổ truyền xác định cơ chế bệnh sinh của chứng nham bao gồm bốn yếu tố chính: độc, ứ, đàm và hư Những yếu tố này phản ánh sự tương tác giữa các tác nhân gây bệnh, giúp hiểu rõ hơn về nguồn gốc và diễn biến của bệnh lý.

Nhiệt tà xâm phạm vào cơ thể, lâu ngày sẽ uất kết lại thành nhiệt độc

Nội thương tình chí bị uất kết có thể dẫn đến hỏa, theo sách ‘Đinh cam nhâm y án’ cho rằng nguồn gốc bệnh xuất phát từ tình chí uất kết, gây ra uất hỏa và ứ huyết, làm tổn thương khí và tạng phủ Hỏa nhiệt tích tụ lâu ngày có thể tạo thành khối, gây bế tắc khí huyết và đàm trọc trong kinh lạc, dẫn đến bệnh tật Nhiệt độc thường gặp trong các loại ung thư như ung thư gan, ung thư máu và ung thư lưỡi.

Khí huyết là yếu tố quan trọng trong việc duy trì sự sống và chức năng sinh lý của cơ thể Khi công năng của khí bị mất cân bằng, sẽ dẫn đến tình trạng khí uất, khí trệ, và khí tụ, lâu dần gây huyết ứ trệ và hình thành khối, được gọi là nham chứng Theo sách “Kim Quỹ thiên ngũ tạng phong hàn”, tích là bệnh liên quan đến tạng, không di chuyển, gây đau ở một chỗ và thường liên quan đến huyết do huyết ứ không thông.

Trong "Y lâm cải thác", có nêu rõ rằng: "Huyết gặp phản tắc ngưng kết thành khối, huyết gặp nhiệt tắc tạo thành khối" Điều này chứng minh rằng sự hình thành khối u có liên quan mật thiết đến tình trạng khí trệ và huyết ứ.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ UNG THƯ CỦA CÁC THUỐC YHCT

Trạng thái miễn dịch của cơ thể ảnh hưởng lớn đến sự hình thành và phát triển của khối u Khi hệ miễn dịch suy yếu, tỷ lệ khối u xuất hiện tăng cao và các khối u hiện có có thể phát triển nhanh chóng Do đó, các loại thuốc y học cổ truyền (YHCT) có khả năng kích thích hệ miễn dịch thường được kết hợp trong điều trị ung thư.

Trên toàn cầu, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về các loại thuốc kích thích miễn dịch từ thảo mộc, đặc biệt phổ biến ở các quốc gia như Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ và Hàn Quốc.

Nghiên cứu thử nghiệm in vitro của các nhà khoa học Trung Quốc cho thấy nhiều thảo mộc có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư Cụ thể, cây Gordonia longicarpa thuộc họ Theaceae cho thấy hoạt tính gây độc tế bào với năm dòng tế bào ung thư ở người, bao gồm HCT-8, Bel-7402, BGC-823, A549 và A2780 Cây Palhinha cernua thuộc họ Lycopodiaceae cũng có tác dụng gây độc tế bào với ba dòng tế bào ung thư K562, SMMC-7721 và SGC-7901, với giá trị IC50 lần lượt là 20,3; 34,0 và 22,5 µg/ml Đặc biệt, Pterocarpus soyauxii thể hiện hoạt tính độc tế bào mạnh trên dòng tế bào ung thư phổi A549 với giá trị IC50 là 16,07 µg/ml.

Nghiên cứu của Kim K và cộng sự (2012) chỉ ra rằng triterpenoid chiết xuất từ cây Berberis koreana thuộc họ Berberidaceae có khả năng gây độc cho dòng tế bào A549 và SK-MEL-2, với giá trị IC50 lần lượt là 7,17 và 90,67 µg/ml.

Tại Ấn Độ, Senthilnathan P và cộng sự thấy dịch chiết của sâm Ấn Độ

Withania somnifera (L.) Dunal có tác dụng làm thay đổi các tế bào miễn dịch, bổ thể và globulin miễn dịch trên động vật bị gây ung thư phổi [80]

Trần Nhuệ Thâm đã áp dụng các vị thuốc YHCT Trung Quốc để điều trị cho bệnh nhân ung thư phổi, cho thấy rằng những phương pháp này có khả năng cải thiện hệ miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng và kéo dài thời gian sống cho người bệnh.

Nghiên cứu của Liu J và cộng sự đã tiến hành so sánh ngẫu nhiên 43 bệnh nhân ung thư đại tràng sau phẫu thuật, trong đó 21 bệnh nhân được điều trị bằng hóa trị liệu đơn thuần và 22 bệnh nhân được điều trị bằng hóa trị liệu kết hợp với thuốc Kiện tỳ hóa ứ trong vòng 3 tháng Kết quả cho thấy tỷ lệ tái phát và hiệu quả điều trị ở nhóm hóa trị liệu kết hợp cao hơn, với 39,5% tái phát và 72,1% hiệu quả, so với nhóm hóa trị liệu đơn thuần chỉ đạt 33,3% và 19,0%.

Phan Mẫn Cầu đã sử dụng Phế phụ phương, bao gồm các thành phần như Bách hợp, Thục địa, Sinh địa, Nguyên sâm, Mạch môn, Đương quy, Bạch thược, Sa sâm, Tang bạch bì, Hoàng cầm, Mẫu đơn, Tằm sa và Bạch hoa xà thiệt thảo, để điều trị cho 40 bệnh nhân ung thư tế bào vảy giai đoạn III - IV Kết quả cho thấy thời gian sống thêm của nhóm bệnh nhân sử dụng thuốc YHCT có sự cải thiện đáng kể và có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng được điều trị bằng hóa trị liệu.

Nguyễn Thị Thu Hằng đã tiến hành nghiên cứu trên 90 bệnh nhân trên 65 tuổi được chẩn đoán mắc ung thư phổi không phải tế bào nhỏ Trong nghiên cứu, bà chia các bệnh nhân thành 3 nhóm, trong đó có một nhóm sử dụng bài thuốc YHCT đơn thuần với các thành phần gồm Đẳng sâm 25g, Phục linh 25g, Miêu trảo thảo 30g, Chỉ xác 15g, Tam thất 10g, Tỳ bà diệp 10g và Tiên hạc thảo 15g.

Nghiên cứu sử dụng bài thuốc YHCT kết hợp với hóa trị liệu cho thấy hiệu quả cải thiện triệu chứng lâm sàng, giảm tác dụng phụ không mong muốn của hóa trị, và nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

Một trong những nguyên tắc điều trị ung thư trong YHCT là phù chính khu tà Sự phát triển của khối u và quá trình điều trị bằng các liệu pháp YHHĐ như xạ trị, hóa trị thường làm suy nhược cơ thể người bệnh Việc kết hợp thuốc YHCT với các biện pháp YHHĐ trong điều trị ung thư không chỉ nâng cao khả năng miễn dịch mà còn giảm thiểu phản ứng phụ từ hóa chất và xạ trị YHCT Việt Nam đã phát triển nhiều bài thuốc và phương thuốc quý, được chứng minh bởi các nghiên cứu YHHĐ, có tác dụng nâng cao công năng của hệ thống miễn dịch một cách khoa học.

Trần Ngọc Dung (2000) đã nghiên cứu viên M chế từ dịch chiết cây Nhàu, cho thấy hiệu quả trong việc hỗ trợ điều trị bệnh nhân ung thư vòm họng sau xạ trị Nghiên cứu này nhấn mạnh tiềm năng của cây Nhàu trong việc cải thiện sức khỏe cho những người đang điều trị ung thư.

M có tác dụng phục hồi số lượng các tế bào miễn dịch và kéo dài đời sống của các bệnh nhân này so với đối chứng [88]

Bài thuốc “Thập toàn đại bổ” đã được chứng minh là có khả năng làm giảm độc tính cho bệnh nhân ung thư vú trong quá trình điều trị hóa chất Nhiều chế phẩm từ thảo dược cũng đã được nghiên cứu và ứng dụng hiệu quả trong việc hỗ trợ điều trị ung thư.

Phylamin, chế phẩm từ bèo hoa dâu, đã được áp dụng cho bệnh nhân ung thư vòm họng, phổi và hạch, cho thấy sự cải thiện rõ rệt trong thể trạng bệnh nhân và thời gian sống kéo dài hơn so với nhóm chứng.

- Aslem: sản phẩm tổng hợp glycyl Funtumin được phân lập từ cây

Funtumia Apocynaceae, có tác dụng kích thích không đặc hiệu đối với hệ miễn dịch [91]

Salamin, được chiết xuất từ Hải tảo và Côn bố, có tác dụng tăng cường số lượng tế bào TCD4 và TCD8, đồng thời gia tăng số lượng hồng cầu và bạch cầu ở bệnh nhân ung thư vú đang trong quá trình xạ trị.

Viên Angala chứa polysaccharide chiết xuất từ rễ cây đương quy Nhật Bản, có tác dụng hạn chế giảm số lượng hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu, đồng thời làm tăng số lượng tế bào lympho TCD4 và TCD8 Điều này giúp kích thích tăng cường miễn dịch tế bào cho bệnh nhân ung thư vú đã phẫu thuật và đang điều trị hóa xạ trị.

TỔNG QUAN VỀ CÂY SÓI RỪNG

Cây sói rừng, với tên khoa học là Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai, thuộc họ Hoa sói Chloranthaceae, được biết đến ở Việt Nam với nhiều tên gọi khác như sói láng, sói nhẵn, cửu tiết kim túc lan, cửu tiết trà, cửu tiết phong, trúc tiết trà, tiếp cốt liên, thảo sách hồ, và tiếp cốt mộc.

Sói rừng là cây bụi nhỏ cao từ 1 đến 2m, có nhánh tròn và không lông Lá cây mọc đối, có phiến dài xoan bầu dục, kích thước từ 7 đến 18cm chiều dài và 2 đến 7cm chiều rộng, với đầu nhọn và mép có răng nhọn Cây có 5 cặp gân phụ và cuống lá ngắn từ 5 đến 8mm Hoa của cây nhỏ, màu trắng và không có cuống, thường nở vào tháng 6 - 7, trong khi quả nhỏ, gần tròn và có màu đỏ gạch khi chín, xuất hiện vào tháng 8 - 9.

Theo Võ Văn Chi [101] cây Sói rừng phân bố ở nhiều nước như: Trung

Quốc gia như Triều Tiên, Nhật Bản, Ấn Độ, Việt Nam và Malaixia có cây mọc hoang hoặc được trồng để làm trà và thuốc Tại Việt Nam, cây thường xuất hiện tự nhiên ở vùng núi đất, bìa rừng và ven đồi ẩm, đặc biệt là ở các khu vực như Cao Bằng.

Lạng Sơn, Thái Nguyên, Hòa Bình đến Kon Tum, Lâm Đồng

Thu hái toàn cây vào mùa hạ, thu, dùng tươi hay phơi khô trong râm

Rễ thu hái quanh năm, rửa sạch cắt đoạn, phơi trong râm hoặc cũng có thể dùng tươi.

Cây có vị đắng, cay, tính hơi ấm và có độc, có tác dụng hoạt huyết, chỉ thống, khu phong, trừ thấp, thanh nhiệt giải độc, kháng virus, kháng khuẩn và kháng u Tại Trung Quốc, cây được sử dụng để chữa trị nhiều bệnh như ung thư tụy, dạ dày, trực tràng, gan, lỵ, gãy xương, thấp khớp, đau lưng, cảm mạo và kinh nguyệt không đều, với liều dùng từ 20 – 40g, có thể đun sôi uống hoặc tán bột uống với rượu Hoa của cây còn được dùng để ướp trà Ở Việt Nam, vị thuốc này mới được sử dụng trong dân gian; rễ cây ngâm rượu uống giúp chữa đau tức ngực, trong khi lá tươi giã đắp có tác dụng chữa rắn cắn, gãy xương, bong gân và mụn nhọt Liều dùng cho dạng thuốc sắc cũng là 20 - 40g/ngày.

1.4.4 Các nghiên cứu về cây sói rừng

Các nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học từ Trung Quốc, Mỹ và Nhật Bản đã chỉ ra rằng thành phần hóa học của cây thuốc này rất đa dạng và có nhiều tiềm năng ứng dụng trong y học.

Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai là sesquiterpen, coumarin, flavonoid, triterpenoid, saponin, caroten, chất béo, polysaccharide Trong đó saponin, coumarin, sesquiterpen và flavonoid là các nhóm chất chính [103], [104],

Nghiên cứu tại Trung Quốc đã chỉ ra rằng Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai có khả năng tăng cường hệ miễn dịch không đặc hiệu, chống lại virus, giảm viêm và ức chế sự phát triển của u bướu Đồng thời, loại thảo dược này cũng giúp nâng cao sức đề kháng và ngăn ngừa sự giảm bạch cầu cũng như tiểu cầu trong cơ thể.

Các nghiên cứu in vitro cho thấy dịch chiết từ sói rừng có khả năng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư người, bao gồm Hep-A549, HCT-29 và BGC-823.

Nghiên cứu của Wen J và cộng sự (2003) cho thấy dịch chiết từ Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai có tác dụng kháng u hiệu quả Khi tiêm dịch chiết vào chuột cấy ghép tế bào ung thư gan Hep-A22, tác giả đã quan sát thấy sự giảm đáng kể sự phát triển của tế bào ung thư này cả trong môi trường in vitro và in vivo.

Năm 2014, nghiên cứu của Triệu Ích đã chỉ ra rằng tiêm dịch chiết sói rừng cho chuột mang khối u Hep-H22 với liều 1,5g/kg và 3g/kg thể trọng có hiệu quả ức chế khối u Cụ thể, tỷ lệ ức chế khối u đạt 26,84% ở nhóm tiêm sói rừng liều thấp, 44,74% ở nhóm tiêm liều cao, 30,70% ở nhóm tiêm 5-Fluorouracil, và cao nhất là 58,39% ở nhóm tiêm kết hợp cả hai loại thuốc.

Các tác giả Kang M, Tang A và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của dịch chiết sói rừng trên chuột "nude" cấy dòng tế bào gây ung thư biểu mô mũi-họng Kết quả cho thấy dịch chiết này có khả năng ngăn chặn sự phát triển khối u in vivo bằng cách làm ngừng chu kỳ tế bào ở pha G1, đồng thời tỷ lệ biểu hiện gen Bax, liên quan đến quá trình chết tế bào theo chương trình, cũng tăng lên so với nhóm đối chứng.

Nghiên cứu của Zhenzhen Z cho thấy chất SGP-2, một polysaccharide chiết xuất từ cây Sacandra glabra, có khả năng ức chế sự tăng sinh và di căn của tế bào ung thư MG-63 trong môi trường in vitro Kết quả này mở ra hướng nghiên cứu mới cho các thành phần có hoạt tính sinh học trong cây sói rừng trong việc chống ung thư Bên cạnh việc ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư, các nhà khoa học cũng đang khám phá tác dụng của cây sói rừng đối với hệ miễn dịch, như được nêu bởi He R (2009) và Sun W (2015).

Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai có tác dụng tích cực lên hệ miễn dịch của chuột, giúp cân bằng tế bào T và tăng cường khả năng diệt tự nhiên Nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ Sarcandra glabra cải thiện tỷ lệ và số lượng tế bào miễn dịch, đồng thời làm tăng trọng lượng lách và tuyến ức, cũng như số lượng bạch cầu ở chuột bị ung thư.

Trong một nghiên cứu của tác giả Từ Quốc Lượng và cộng sự (2005), dịch chiết từ cây sói rừng đã cho thấy khả năng làm tăng trọng lượng lách, tuyến ức và số lượng tiểu cầu ở chuột bị xuất huyết giảm tiểu cầu Tiếp theo, Chen S và cộng sự (2009) đã nghiên cứu tác động của cây sói rừng trong điều trị giảm tiểu cầu do hóa trị liệu, khi tiêm Cytoxan với liều 15mg/kg kết hợp với dịch chiết sói rừng 36mg/kg cho chuột cấy truyền tế bào ung thư S-180.

Nghiên cứu cho thấy sự kết hợp giữa tiêm Cytoxan và dịch chiết sói rừng không chỉ nâng cao tỷ lệ ức chế sự phát triển của khối u mà còn giúp ngăn ngừa tình trạng giảm tiểu cầu và tế bào lympho do Cytoxan gây ra.

Trên bệnh nhân ung thư biểu mô mũi họng, việc kết hợp điều trị tia xạ với việc uống cao Sói rừng đã giúp giảm bớt một số tác dụng phụ do tia xạ gây ra, so với việc chỉ điều trị bằng tia xạ đơn thuần.

Các nghiên cứu trong nước về cây sói rừng chưa có nhiều

C HẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 CHẤT LIỆU NGHIÊN CỨU

Thuốc nghiên cứu

Thuốc nghiên cứu là cốm tan được sản xuất tại Khoa Dược, Bệnh viện Y học cổ truyền Cao Bằng, từ cây Sói rừng Quy trình sản xuất bao gồm rửa sạch, thái lát, phơi khô và chiết xuất toàn phần trong nước Cốm cây Sói rừng đạt tiêu chuẩn cơ sở, đảm bảo chất lượng cho nghiên cứu.

Chiết xuất và bào chế cốm cây sói rừng được thực hiện bằng cách sử dụng 10kg dược liệu, cho vào nồi nấu với 10 lít nước sạch Sau đó, dùng vỉ ép chặt và đun trong 120 phút để thu được nước sắc lần 1 Tiếp tục, đổ thêm 10 lít nước sạch vào dược liệu, đun sôi thêm 120 phút để chiết xuất nước sắc lần 2.

Gộp nước sắc lần 1 và 2 để tạo ra cao đặc đạt tiêu chuẩn DĐVN IV Sau đó, thêm 0,15% chất bảo quản Nipagin pha trong cồn tuyệt đối và phân tán đều vào cao đặc.

+ Tạo cốm: Cao đặc trộn với Lactose theo tỷ lệ (1: 2) tạo được khối ẩm vừa phải, sấy ở nhiệt độ 50°C trong khoảng 1 giờ lấy ra sát hạt qua rây số 1000

Sau khi sấy ở nhiệt độ 60°C cho đến khi cốm đạt độ ẩm ≤ 5%, tiến hành rây qua rây số 1600 Cốm này sẽ được sử dụng để thử nghiệm các tác dụng trên động vật thực nghiệm.

Thuốc đối chứng dương Purinethol (6-MP) là viên nén 50mg mercaptopurine, được sản xuất bởi công ty GlaxoSmithKline, và được sử dụng để điều trị nhiều loại ung thư, đặc biệt là các dạng ung thư mô liên kết.

Sơ đồ 2.1 Quy trình chiết xuất cốm cây sói rừng

Sát hạt qua rây số 1000

Sát hạt qua rây số 1600 Cốm Ảnh 2.1 Cốm cây sói rừng

Hóa chất nghiên cứu

- Kit định lượng các chỉ số hóa sinh trong máu: ALT, AST, Albumin, Cholesterol, Bilirubin, Creatinin của hãng Hospitex Diagnosics (Italy) và hãng Dialab GmbH (Áo)

-Dung dịch xét nghiệm máu ABX Minidil LMG cho chuột của hãng ABX – Diagnostics

-Kít định lượng IL-2 (mã: RAB0287-1KT), TNF-α (mã: REF KMC3011) cho chuột của hãng Invitrogen (Mỹ)

-Kháng thể kháng TCD3, TCD4, TCD8 cho chuột của hãng Invitrogen (Mỹ).

Phương tiện, dụng cụ

- Máy xét nghiệm huyết học VETABC TM Animal Blood Counter của hãng Ugo Basile (Italy)

- Máy xét nghiệm hóa sinh máu Screen Master của hãng Hospitex Diagnosics (Italy)

- Máy ELISA của hãng Bio-Rad (Mỹ)

- Máy đếm kỹ thuật dòng chảy FACS Canto II của hãng Becton Dickinson (Mỹ)

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

-Chuột nhắt trắng chủng Swiss (Mus musculus), cả hai giống, khỏe mạnh, cân nặng từ 20 – 22 gam, do Viện Vệ sinh dịch tễTrung ương cung cấp

-Thỏ chủng Newzealand White, lông trắng, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 1,8 - 2,2kg do Trung tâm nghiên cứu dê và thỏSơn Tây cung cấp

Tất cả các động vật trong nghiên cứu đều được nuôi dưỡng trong điều kiện tối ưu, bao gồm đầy đủ thức ăn, nước uống, độ ẩm, thông khí và ánh sáng thích hợp Nghiên cứu này được thực hiện tại khu nghiên cứu động vật thực nghiệm của Nhóm nghiên cứu ung thư thực nghiệm, thuộc bộ môn Sinh học tế bào, Khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, cùng với sự hợp tác từ bộ môn Dược lý, trường Đại học Y Hà Nội.

Dòng tế bào u sarcoma 180 (S-180) là dòng tế bào sống, được nuôi cấy in vitro, có nguồn gốc từ chuột nhắt trắng Mus musculus chủng Swiss Webster bị ung thư mô liên kết Dòng tế bào này được cung cấp bởi ATCC và hiện đang được hoạt hóa cũng như nhân nuôi tại Nhóm nghiên cứu Ung thư Thực nghiệm, bộ môn Sinh học tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học.

Quốc gia Hà Nội Ảnh 2.2 Tế bào ung thư mô liên kết Sarcoma -180 (100x4.6)

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1.1 Xác định độc tính cấp

Thử nghiệm độc tính cấp và xác định LD50 được thực hiện theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon, sử dụng chuột nhắt trắng có trọng lượng từ 20 – 22 gam, chia thành các lô 10 con Mỗi lô chuột được cho uống cốm cây sói rừng với liều lượng tăng dần, từ liều cao nhất không gây chết đến liều thấp nhất gây tử vong toàn bộ Thể tích uống được cố định là 0,2ml/10g trọng lượng cơ thể cho mỗi lần uống (0,4ml/chuột), với tần suất 2 lần trong 24 giờ Chuột được nhịn ăn 12 giờ trước khi uống thuốc và được cho ăn trở lại sau 2 giờ kể từ lần uống thứ hai Tình trạng chung của chuột và số lượng chuột chết trong mỗi lô được theo dõi cẩn thận.

72 giờ Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng chung của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc nghiên cứu

Trong nghiên cứu, cần xác định số lượng chuột chết trong 72 giờ đầu tiên Dựa vào số chuột chết này, chúng ta sẽ xây dựng phương trình tương quan tuyến tính giữa liều lượng sử dụng và tỷ lệ chuột chết, nhằm xác định LD50.

2.3.1.2 Xác định độc tính bán trường diễn của cốm cây sói rừng

- Thử độc tính bán trường diễn của thuốc theo đường uống [130]:

Thỏ khỏe mạnh cả hai giống được nuôi trong môi trường nghiên cứu ổn định trước khi cho uống thuốc Chúng được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 10 con, và mỗi con được nhốt riêng trong chuồng Trong 8 tuần liên tiếp, thỏ được cho uống nước hoặc thuốc thử một lần mỗi sáng.

Lô chứng : uống nước cất 3 ml/kg/ngày

Lô trị 1 : uống cốm cây sói rừng liều 0,6 g/kg/ngày (liều có tác dụng tương đương liều dùng trên người, tính theo hệ số 3)

Lô trị 2 : uống cốm cây sói rừng liều 3,0 g/kg/ngày

- Các chỉ tiêu theo dõi: được kiểm tra vào trước lúc uống thuốc, sau 4 tuần và sau 8 tuần uống thuốc

+ Tình trạng chung của thỏ: hoạt động tự nhiên, tình trạng ăn uống, thể trọng của thỏ

Đánh giá chức năng tạo máu được thực hiện thông qua các chỉ số như số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu.

+ Đánh giá chức năng gan: thông qua định lượng hoạt độ ALT, AST, bilirubin toàn phần, albumin và cholesterol

+ Đánh giá chức năng thận: thông qua định lượng creatinin huyết thanh

Sau 8 tuần điều trị bằng thuốc, thỏ được tiến hành mổ để quan sát các cơ quan một cách tổng quát Đồng thời, cấu trúc vi thể của gan và thận của 30% số thỏ trong mỗi lô cũng được kiểm tra ngẫu nhiên.

2.3.2 Đánh giá tác dụng kháng u rắn sarcoma 180 của cốm cây sói rừng trên chuột nhắt

2.3.2.1 Phương pháp tạ o kh ố i u r ắ n trên chu ộ t

- Tế bào ung thư S-180 sau khi được hoạt hóa và nhân nuôi đảm bảo đủ số lượng sẽ được dùng để gây u trên chuột theo phương pháp của Lapis K

- Tiêm 0,2ml huyền dịch tế bào S-180 (tương đương 10 6 tế bào) vào dưới da vùng lưng (lệch về phía bên phải chuột) để tạo u rắn

Chuột nhắt được phân loại thành hai nhóm sau khi gây u: nhóm đầu tiên nhằm theo dõi tác dụng của thuốc trên chuột mang u, trong khi nhóm thứ hai được sử dụng để đánh giá thời gian sống thêm của chuột.

2.3.2.2 Đánh giá tác dụng kháng u:

- Nhóm 1 có 06 lô, mỗi lô 10 con Trong đó:

Lô chứng sinh học (SH)

: chuột khỏe mạnh bình thường, không cấy truyền tế bào u S-180

Lô ung thư (UT) : chuột được cấy truyền tế bào u S-180 nhưng không được điều trị

Lô 6-MP : chuột được cấy truyền tế bào u S-180 , uống 6-MP hàng ngày liều 48mg/kg thể trọng

Lô SR1 : chuột được cấy truyền tế bào u S-180 , uống cốm cây sói rừng pha trong nước với liều 5g/kg thể trọng/ngày

Năm ngày sau khi cấy tế bào u S-180, chuột được cho uống nước cất và thuốc liên tục trong 18 ngày Trong thời gian này, chúng tôi quan sát các biểu hiện, hoạt động, thói quen ăn uống và vận động của chuột, đồng thời theo dõi sự thay đổi thể trọng và kích thước khối u bằng thước kẹp Caliper.

- Tính thể tích khối u rắn theo công thức của Teicher B.A [132]:

V= 0,4.a.b 2 Trong đó: a: đường kính nhỏ nhất của khối u (mm) b: đường kính lớn nhất của khối u (mm) V: thể tích khối u (mm 3 )

- Đánh giá hiệu lực kháng u theo tiêu chuẩn của H.Itokawa [133]:

+ Xác định tỷ số phát triển khối u (GR-Growth Ratio):

GR (%) = Vnghiên cứu/Vđối chứng x 100 + Xác định tỷ số ức chế khối u (IR-Inhibition Ratio):

IR (%) = 100% - GR Thang đánh giá hiệu lực kháng u của H Itokawa

91 – 100 +++ Ảnh 2.3 Thước kẹp calip er

2.3.2.3 Xác định thời gian sống thêm của chuột mang u

- Nhóm 2 có 3 lô, mỗi lô 15 con Trong đó:

Lô ung thư (UT) : chuột được cấy truyền tế bào u S-180 nhưng không được điều trị

Lô 6-MP : chuột được cấy truyền tế bào u S-180 , uống 6-MP liều 48mg/kg thể trọng/ngày

Lô SR 1 : chuột được cấy truyền tế bào u S-180 , uống cốm cây sói rừng pha trong nước với liều 5g/kg thể trọng/ngày

Chuột thuộc nhóm 2 sẽ được nuôi dưỡng và theo dõi hàng ngày cho đến khi chúng qua đời Thời gian sống trung bình của mỗi lô chuột sẽ được tính toán, đồng thời xác định tỷ lệ phần trăm thời gian sống kéo dài theo phương pháp của Gerant R.I và cộng sự [134].

Trong đó: Ts: thời gian sống trung bình của lô chuột có điều trị Cs: thời gian sống trung bình của lô chứng

ILS: thời gian sống tăng thêm ((Increased Life Span)

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của cốm cây sói rừng trên tỷ lệ tế bào TCD3, TCD4, TCD8nồng độ IL-2 và TNF-α của chuột mang u rắn sarcoma 180 Đến ngày thứ 23 sau cấy truyền tế bào u S-180, mổ các lô chuột ở nhóm 1:

- Lấy huyết tương để định lượng IL-2, TNF-α và máu để xác định các tế bào máu ngoại vi

- Thu hạch bạch huyết để xác định tế bào TCD3, TCD4, TCD8

- Bóc tách toàn bộ lách và tuyến ức xét nghiệm giải phẫu bệnh

2.3.3.1 Phương pháp thu hạch bạch huyết để xác định tế bào TCD3, TCD4, TCD8

Chuột thí nghiệm được gây mê bằng ete để tiến hành phẫu thuật lấy các hạch bạch huyết ở vị trí bẹn và cổ Sau khi thu thập, các hạch bạch huyết sẽ được chuyển vào đĩa nuôi cấy 24 giếng, mỗi giếng đã được chuẩn bị sẵn 1ml PBS 1X vô trùng và được đánh dấu cho từng đối tượng chuột.

Hình 2.1 Sơ đồ v ị trí các h ạ ch b ạ ch huy ết trên cơ thể chu ộ t [47]

Để tách tế bào lympho từ các hạch bạch huyết, trước tiên cần thu thập chúng trong môi trường cấy vô trùng Sử dụng panh kẹp có đầu nhám đã được khử trùng, nhẹ nhàng nghiền các hạch bạch huyết Sau đó, tiến hành ly tâm dịch lympho vừa thu được để tách biệt các tế bào lympho.

Thu cặn tế bào loại dịch và hòa tan cặn tế bào bằng PBS vô trùng Chia số lượng tế bào lympho thu được từ mỗi chuột vào 3 ống li tâm, mỗi ống chứa 2.10^6 tế bào lympho trong 200μl dung dịch PBS Tiến hành ủ tế bào lympho với kháng thể đơn dòng gắn chất đánh dấu, trong đó ống 1 sẽ được nhuộm với kháng thể kháng CD3 gắn FITC (gọi tắt là ống TCD3).

+ Ống 2: nhuộm với kháng thể kháng CD4 gắn PE (gọi tắt là ống TCD4)

+ Ống 3: nhuộm với kháng thể kháng CD8 gắn PE (gọi tắt là ống TCD8)

Quy trình ủ tế bào được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất, trong đó tế bào được trộn với kháng thể theo tỷ lệ 0.2 µg kháng thể cho mỗi 10^6 tế bào trong 100 µl dung dịch pha loãng Hỗn hợp này được ủ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng, cần tránh ánh sáng trực tiếp Sau đó, tiến hành ly tâm ba lần để loại bỏ các kháng thể dư thừa.

Mẫu sau khi ủ được bảo quản trong PBS 1X, điều kiện nhiệt độ thấp và không có ánh sáng

Đo mẫu trên máy flow cytometry, cụ thể là máy FACS Canto II (BD), cho phép xác định tỷ lệ các loại tế bào lympho sau khi hỗn hợp tế bào được ủ với các kháng thể Hệ thống này là dual-platform, cung cấp kết quả đếm tế bào TCD3, TCD4, TCD8 dưới dạng phần trăm so với tổng số tế bào lympho.

Hình 2.2 C ấu trúc cơ bả n c ủ a h ệ th ố ng flow cytometry [135]

2.3.3.2 Phẫu thuật bóc tách lách và tuyến ức

-Chuột sau khi dược gây mê, mổ bụng và ngực để bộc lộ lách, tuyến ức

Lách và tuyến ức được ngâm trong dung dịch nuôi tế bào, sau đó lọc sạch các mô xung quanh và dùng gạc thấm khô Tiến hành cân trọng lượng của lách và tuyến ức từng con chuột, từ đó ghi lại trọng lượng cụ thể Trọng lượng lách và tuyến ức được tính tương đối theo tỷ lệ so với trọng lượng của từng con chuột tương ứng.

Trọng Trọng lượng lách hoặc tuyến ức

- Lấy tổ chức lách, tuyến ức làm giải phẫu vi thể

2.3.3.3 Định lượng các cytokine: IL-2 và TNF- α trong máu ngoại vi : bằng phương pháp ELISA

Trọng lượng lách hoặc tuyến ức tương đối

 Các bước tiến hành ELISA -TNF-α kit: Được thực hiện theo quy trình của hãng Invitrogen(Mỹ), sử dụng kít thử ELISA -TNF- α

ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Tại bộ môn Dược lý, trường Đại học Y Hà Nội, quy trình xác định độc tính cấp và bán trường diễn được thực hiện Đánh giá hình thái mô học gan và thận của thỏ được tiến hành tại bộ môn Giải phẫu bệnh của trường.

Nghiên cứu đánh giá tác dụng kháng u rắn sarcom 180 đã được thực hiện với sự hỗ trợ của Nhóm nghiên cứu ung thư thực nghiệm tại bộ môn Sinh học tế bào, Khoa Sinh học, Đại học KHTN, Đại học Quốc gia Hà Nội Nghiên cứu tập trung vào tác động của sarcom 180 lên tỷ lệ tế bào TCD3, TCD4, TCD8 và nồng độ IL-2, TNF-α ở chuột mang u Quy trình đánh giá hình thái mô bệnh học tại lách, tuyến ức và khối u được PGS.TS Lê Đình Roanh tại Trung tâm Nghiên cứu và phát hiện sớm Ung thư thực hiện.

-Thời gian nghiên cứu: được tiến hành từnăm 2013 – 2015.

XỬ LÝ SỐ LIỆU

-Tất cả các số liệu thu được đều được xử lý theo phần mềm SPSS 15.0

-Sử dụng thuật toán t-test student để so sánh giá trị trung bình

-Thuật toán  2 để so sánh tỷ lệ

-Thuật toán avant-apres để so sánh trước-sau

-Số liệu được trình bày dưới dạng MEAN ± SD Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

Sơ đồ 2.2 Cách phân chia các nhóm chu ộ t theo dõi tác d ụ ng kháng u

Nhóm đối chứng không gây u (n) Nhóm đối chứng gây u (n)

Uống cốm cây sói rừng liều 5g/kg thể trọng (n)

Thời gian sống thêm Sự phát triển khối u

Sơ đồ 2.3 Quy trình nghiên c ứ u

- Xác định tên khoa học

Tác dụng trên u thực nghiệm Ảnh hưởng lên hệ miễn dịch chuột Độc tính cấp Độc tính bán trường diễn

- Thời gian sống thêm của chuột

- Trọng lượng tuyến ức, lách

- Mô học tuyến ức, lách

- Tỷ lệ TCD3, TCD4, TCD8

- Số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu

LD50 - Trọng lượng cơ thể thỏ

- Mô học gan thận thỏ

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA CỐM CÂY SÓI RỪNG

Theo dõi tình trạng chung của chuột và sốlượng chuột chết trong vòng

72 giờ Tiếp tục theo dõi các dấu hiệu bất thường của chuột trong vòng 7 ngày sau khi đã uống thuốc

B ả ng 3.1 T ỷ l ệ chu ộ t ch ế t trong vòng 72 gi ờ đầ u sau khi u ố ng c ố m cây sói r ừ ng

(g dược liệu sói rừng/kg thể trọng)

Số chuột thử % chuột chết ở mỗi lô

Từ tỷ lệ phần trăm chuột chết ở từng lô, tính liều LD50 theo phương pháp Litchfield –Wilcoxon được kết quả là:

Nhận xét: Chuột ở lô uống 82,19g dược liệu sói rừng/kg thể trọng không có biểu hiện gì đặc biệt, chuột vẫn ăn uống, vậnđộng và bài tiết bình thường.

Số lượng chuột chết tăng dần theo liều dùng, với 20% số chuột chết ở liều 89,04g dược liệu/kg và 100% ở liều 123,29g/kg Các ca tử vong chủ yếu xảy ra trong 24 giờ đầu sau khi uống thuốc, và hầu hết chuột đều có dấu hiệu khó thở trước khi chết Sau 72 giờ, tất cả chuột còn sống đã trở lại trạng thái bình thường.

3.1.2 Độc tính bán trường diễn

3.1.2.1 Ảnh hưởng của cốm cây sói rừng đến trọng lượng cơ thể của thỏ thí nghiệm

Trước UT Sau UT 4 tuần Sau UT 8 tuần

Sói rừng 0,6g/kg Sói rừng 3g/kg p 1 : p trước – sau p 2 : p giữa 3 lô

Bi ểu đồ 3.1 Tr ọng lượng cơ thể th ỏ qua các th ời điể m nghiên c ứ u

Trong quá trình thí nghiệm, thỏ ở cả ba lô đều thể hiện hoạt động bình thường, nhanh nhẹn, với mắt sáng, lông mượt, ăn uống tốt và phân khô Không ghi nhận biểu hiện đặc biệt nào ở cả ba lô Sau 4 và 8 tuần sử dụng thuốc, trọng lượng thỏ ở cả ba lô đều tăng so với thời điểm trước khi nghiên cứu (p < 0,05) Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể về mức độ gia tăng trọng lượng thỏ giữa lô chứng và các lô sử dụng cốm cây sói rừng (p > 0,05).

Trọng lượng cơ thể (kg) p 2 > 0,05 p 1 < 0,05

3.1.2.2 Ảnh hưởng của cốm cây sói rừng đến chức phận tạo máu

B ả ng 3.2 S ự thay đổ i s ố lượ ng các t ế bào máu ngo ạ i vi ở th ỏ

Th ời điể m nghiên c ứ u Lô ch ứ ng

Lô u ố ng c ố m cây sói r ừ ng 0,6g/kg

Lô u ố ng c ố m cây sói r ừ ng 3g/kg p

Trướ c u ố ng 5,07±0,36 5,18±0,44 4,63±0,76 > 0,05 Sau u ố ng 4 tu ầ n 5,06±0,22 5,33±0,34 5,22±0,72 > 0,05 Sau u ố ng 8 tu ầ n 5,21±0,25 5,32±0,39 5,35±0,38 > 0,05

B ả ng 3.3 Ảnh hưở ng c ủ a c ố m cây sói r ừ ng đế n m ộ t s ố ch ỉ s ố huy ế t h ọ c

Trướ c u ố ng 10,23±0,71 10,51±0,81 9,87±1,52 > 0,05 Sau u ố ng 4 tu ầ n 10,17±0,48 10,75±0,63 10,59±1,05 > 0,05 Sau u ố ng 8 tu ầ n 10,85±0,85 10,71±0,86 11,29±0.82 > 0,05

Trướ c u ố ng 32,05±2,16 33,33±2,30 30,79±4,72 > 0,05 Sau uống 4 tuần 32,12±1,46 34,15±1,62 33,14±3,30 > 0,05 Sau u ố ng 8 tu ầ n 33,36±2,29 34,12±2,13 34,57±2,54 > 0,05

B ả ng 3.4 Ảnh hưở ng c ủ a c ố m cây sói r ừ ng đế n công th ứ c b ạ ch c ầ u trong máu th ỏ

Trước uống 14,90±12,22 14,30±4,85 13,00±11,18 > 0,05 Sau u ố ng 4 tu ầ n 19,20±7,22 18,10±7,06 18,89±8,02 > 0,05 Sau u ố ng 8 tu ầ n 14,75±5,65 15,90±3,60 14,80±6,89 > 0,05

Trước uống 85,10±12,22 75,70±4,85 77,00±11,18 > 0,05 Sau u ố ng 4 tu ầ n 80,80±7,22 81,90±7,06 76,11±8,02 > 0,05 Sau u ố ng 8 tu ầ n 85,25±5,65 80,10±3,60 88,20±6,89 > 0,05

Kết quả từ các bảng 3.2, 3.3 và 3.4 cho thấy, sau 4 và 8 tuần sử dụng cốm cây sói rừng, tất cả các xét nghiệm đánh giá chức năng tạo máu (bao gồm số lượng hồng cầu, hàm lượng huyết sắc tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu) ở cả nhóm uống cốm với liều tương đương và liều gấp 5 lần liều lâm sàng không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng và so với thời điểm trước khi sử dụng (p > 0,05).

3.1.2.3 Ảnh hưởng của cốm cây sói rừng đến chức năng gan

B ả ng 3.5 Ảnh hưở ng c ủ a c ố m cây sói r ừ ng đến hàm lượ ng albumin, cholesterol và bilirubin trong máu th ỏ

Trước uống 6,54±0,25 6,47±0,13 6,44±0,29 > 0,05 Sau u ố ng 4 tu ầ n 6,20±0,56 6,25±0,61 5,80±0,24 > 0,05 Sau u ố ng 8 tu ầ n 6,10±1,06 5,91±1,13 5,36±0,20 > 0,05 p trướ c - sau > 0,05 > 0,05 > 0,05

Trướ c u ố ng 2,20±0,17 2,11±0,24 2,20±0,32 > 0,05 Sau uống 4 tuần 2,05±0,31 2,13±0,27 2,01±0,17 > 0,05 Sau u ố ng 8 tu ầ n 2,11±0,29 2,13±0,14 2,06±0,24 > 0,05 p trướ c - sau > 0,05 > 0,05 > 0,05 Bilirubin

Trướ c u ố ng 12,15±0,22 12,15±0,30 12,20±0,29 > 0,05 Sau u ố ng 4 tu ầ n 12,14±0,30 12,28± 0,36 12,27±0,32 > 0,05 Sau uống 8 tuần 12,20±0,27 12,13±0,28 12,08±0,19 > 0,05 p trướ c - sau > 0,05 > 0,05 > 0,05

Cốm cây sói rừng với liều 0,6g/kg và 3g/kg thể trọng không ảnh hưởng đến các chỉ số albumin, cholesterol và bilirubin toàn phần trong suốt thời gian nghiên cứu, và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng.

B ả ng 3.6 Ảnh hưở ng c ủ a c ố m cây sói r ừ ng đế n ho ạt độ AST, ALT trong máu th ỏ

Trướ c u ố ng 38,25±10,63 38,54±7,57 41,30±15,45 > 0,05 Sau uống 4 tuần 42,21±10,57 40,17±5,70 56,10±14,67 > 0,05 p trướ c – sau 4 tuần > 0,05 > 0,05 > 0,05 Sau u ố ng 8 tu ầ n 43,04±16,77 44,36±7,58 66,43±14,01 < 0,05 p trước – sau 8 tu ầ n > 0,05 > 0,05 < 0,05

Trước uống 43,94±7,51 47,03±7,17 49,95±10,70 > 0,05 Sau u ố ng 4 tu ầ n 45,40±10,52 55,77±15,46 56,55±10,15 > 0,05 p trướ c – sau 4 tu ầ n > 0,05 > 0,05 < 0,05

Sau u ố ng 8 tu ầ n 47,09 ± 9,38 58,11±17,28 73,57±12,31 < 0,05 p trướ c – sau 8 tu ầ n > 0,05 < 0,05 < 0,05

- Hoạt độ AST tăng rõ rệt ở lô thỏ uống cốm cây sói rừng liều 3g/kg thể trọng sau 8 tuần uống và so với lô chứng (p < 0,05)

Nghiên cứu cho thấy, lô uống cốm cây sói rừng với liều 0,6g/kg chỉ làm tăng hoạt độ ALT sau 8 tuần, có sự khác biệt so với lô chứng (p < 0,05) Ngược lại, lô uống với liều cao 3g/kg thể trọng đã ghi nhận sự tăng hoạt độ ALT có ý nghĩa thống kê ở cả hai thời điểm nghiên cứu.

3.1.2.4 Ảnh hưởng của cốm cây sói rừng đến chức năng thận

B ả ng 3.7 Ảnh hưở ng c ủ a c ố m cây sói r ừ ng đế n n ồng độ creatinin trong máu th ỏ

Ch ỉ s ố Th ời điể m nghiên c ứ u Lô ch ứ ng Lô u ố ng sói r ừ ng 0,6g/kg

Lô u ố ng sói r ừ ng 3g/kg p

Trướ c u ố ng 1,05 ± 0,05 1,04 ± 0,05 1,05 ± 0,05 > 0,05 Sau uống 4 tuần 1,06 ± 0,07 1,06 ± 0,05 1,08 ± 0,08 > 0,05 p trướ c – sau 4 tuần > 0,05 > 0,05 > 0,05 Sau u ố ng 8 tu ầ n 1,08 ± 0,05 1,04 ± 0,05 1,07 ± 0,05 > 0,05 p trướ c – sau 8 tu ầ n > 0,05 > 0,05 > 0,05

Sau 4 và 8 tuần sử dụng cốm cây sói rừng, hàm lượng creatinin trong máu thỏ không có sự thay đổi đáng kể so với lô chứng và thời điểm trước khi uống, với p > 0,05.

3.1.2.5 Ảnh hưởng của cốm cây sói rừng đến cấu trúc đại thể và vi thể

Sau 8 tuần cho thỏ uống cốm cây sói rừng, 30% số thỏ trong mỗi lô được chọn ngẫu nhiên để tiến hành kiểm tra cấu trúc đại thể và vi thể của các cơ quan, đặc biệt là gan và thận Kết quả cho thấy những thay đổi đáng chú ý trong cấu trúc của các cơ quan này.

Trong nghiên cứu trên thỏ thực nghiệm, không ghi nhận sự thay đổi bệnh lý nào ở các cơ quan như tim, phổi, gan, lách, tuỵ, thận và hệ thống tiêu hoá, cả ở nhóm đối chứng lẫn nhóm uống thuốc nghiên cứu.

- Hình ảnh vi thể gan thỏ sau 8 tuần uống cốm cây sói rừng:

+ Lô chứng: 100% thỏ có cấu trúc vi thể gan hoàn toàn bình thường Tế bào gan không thoái hóa, không hoại tử, không xung huyết

Lô uống cốm cây sói rừng 0.6g/kg cho thấy gan thỏ có dấu hiệu thoái hóa nhẹ đến vừa, với các tế bào gan phồng và bào tương chứa nhiều hốc sáng nhỏ Trong khi đó, lô uống cốm cây sói rừng 3/kg cho thấy mẫu bệnh phẩm tế bào gan thỏ có mức độ thoái hóa từ nhẹ đến nặng, với các tế bào gan phồng to và bào tương chứa nhiều hốc sáng không đều Ảnh 3.1 minh họa hình ảnh vi thể gan thỏ lô chứng (HE x 250).

1 T ế bào gan không thoái hóa 2 Xoang m ạ ch không xung huy ế t

2 Ảnh 3.2 Hình ảnh vi thể gan thỏ lô sói rừng 0,6g/kg (HE x 250)

1 T ế bào gan thoái hóa nh ẹ 2 Xoang m ạ ch không xung huy ế t Ảnh 3.3 Hình ảnh vi thể gan thỏ lô sói rừng 3g/kg (HE x 250)

1 T ế bào gan thoái hóa n ặ ng 2 Xoang m ạ ch không xung huy ế t

- Hình ảnh vi thể thận thỏ sau 8 tuần uống cốm cây sói rừng

Trong lô chứng, 2/3 mẫu bệnh phẩm cho thấy hình ảnh và cấu trúc của cầu thận và ống thận bình thường Tuy nhiên, một mẫu bệnh phẩm (mẫu số 84) cho thấy dấu hiệu thoái hóa vừa ở ống lượn gần.

+ Lô uống cốm cây sói rừng 0,6g/kg: 2/3 bệnh phẩm có hình ảnh cầu thận, ống lượn gần bình thường (mẫu số 14)

Lô uống cốm cây sói rừng 3g/kg cho thấy bệnh phẩm với hình ảnh cầu thận bình thường, tuy nhiên có dấu hiệu thoái hóa nhẹ ở ống lượn gần Ảnh vi thể thận thỏ lô chứng (HE x 250) minh họa rõ nét tình trạng này.

1 C ầ u th ậ n bình thườ ng 2 Ống lượ n g ần bình thườ ng

2 Ảnh 3.5 Hình ảnh vi thể thận thỏ lô sói rừng 0,6g/kg (HE x 250)

1 C ầ u th ận bình thườ ng 2 Ống lượ n g ần bình thườ ng Ảnh 3.6 Hình ảnh vi thể thận thỏ lô sói rừng 3g/kg (HE x 250)

1 C ầ u th ận bình thườ ng 2 Ống lượ n g ầ n thoái hóa nh ẹ

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG U RẮN SARCOMA 180 CỦA CỐM CÂY SÓI RỪNG

3.2.1 Kết quả tạo khối u thực nghiệm

Kết quả tạo mô hình thực nghiệm cho thấy toàn bộ chuột nhắt trắng sau

5 ngày được tiêm huyền dịch chứa 10 6 tế bào sarcoma 180 vào dưới da vùng lưng đều thấy xuất hiện những khối ung thư phát triển tại dưới da vùng lưng

Thể tích khối u tăng dần theo thời gian, dẫn đến sự phát triển của u Động vật ở giai đoạn muộn của bệnh ung thư thường biểu hiện các triệu chứng như bỏ ăn, suy kiệt, xù lông, và một số trường hợp bắt đầu tử vong vào khoảng ngày 18 sau khi tiêm tế bào ung thư.

3.2.2 Ảnh hưởng của cốm cây sói rừng đến trọng lượng cơ thể của chuột mang u

SH UT 6-MP SR1 SR2 SR3 p * : p lô SR so với lô SH p ** : p lô 6-MP so với các lô

Bi ểu đồ 3.2 S ự thay đổ i tr ọng lượng cơ thể chu ộ t qua các ngày cân

Trọng lượng chuột trong các lô đều tăng sau mỗi lần cân Tuy nhiên, ở lô 6 – MP, từ ngày cân thứ 13, trọng lượng trung bình của chuột bắt đầu giảm so với các lô khác và giảm mạnh ở những ngày cân cuối Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.

- Ở các lô chuột bị ung thư được điều trị bằng cốm cây sói rừng, trọng lượng chuột có tăng nhưng thấp hơn sự tăng trọng lượng ở lô chứng

Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nhóm chuột uống cốm cây sói rừng với liều 10g/kg (lô SR2) và 20g/kg (lô SR3), trọng lượng chuột giảm đáng kể so với nhóm uống liều 5g/kg (lô SR1) Hơn nữa, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm uống liều 5g/kg và nhóm đối chứng (lô SH) với p > 0,05.

3.2.3 Ảnh hưởng của cốm cây sói rừng đến sự phát triển khối u

Bi ểu đồ 3.3 S ự thay đổ i th ể tích trung bình kh ố i u qua các ngày đo

Thể tích trung bình u (cm 3 )

- Ở ngày đo thứ 3 và 5, thể tích trung bình u ở 5 lô chuột không có sự khác biệt

- Từ ngày đo thứ 7, bắt đầu có sự khác biệt về thay đổi thể tích trung bình của khối u giữa các lô chuột:

+ Lô UT: thể tích tăng liên tục và rất nhanh sau mỗi lần đo (tăng từ 0,98cm 3 lên 3,37cm 3 )

+ Lô 6-MP: thể tích khối u bắt đầu giảm sau mỗi lần đo (giảm từ 0,76 cm 3 xuống còn 0,46 cm 3 )

+ Lô SR1: thể tích khối u tăng dần nhưng tốc độ tăng chậm hơn so với lô

Lô SR2 cho thấy thể tích khối u tăng liên tục qua các lần đo, mặc dù tốc độ tăng chậm hơn so với lô UT, nhưng lại nhanh hơn so với lô SR3.

+ Ở lô SR3: thể tích khối u không tăng liên tục và tăng ít sau mỗi lần đo Ở ngày đo thứ 19, thể tích khối u không khác biệt so với ngày thứ 15

B ả ng 3.8 T ỷ l ệ chu ộ t có gi ả m th ể tích kh ố i u sau 18 ngày điề u tr ị

Chuột giảm thể tích u Ngày 10 sau uống thuốc

Ngày 18 sau uống thuốc n Tỷ lệ (%) n Tỷ lệ (%) n Tỷ lệ (%)

Sau 18 ngày điều trị, 80% chuột trong nhóm sử dụng 6-MP cho thấy sự giảm thể tích khối u Đối với nhóm chuột được uống cốm cây sói rừng, tỷ lệ giảm kích thước u lần lượt là 60%, 40% và 70% tương ứng với các liều 5g/kg, 10g/kg và 20g/kg thể trọng.

B ả ng 3.9 So sánh s ự thay đổ i th ể tích trung bình kh ố i u gi ữ a các lô chu ộ t vào ngày 23 sau gây u

STT Lô chuột n V trung bình u (cm 3 )

- Cốm cây sói rừng liều 5g/kg,10g/kg và 20g/kg thể trọng đều làm giảm sự phát triển của khối u có ý nghĩa thống kê so với lô UT (p < 0,05)

- Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) về khả năng làm giảm sự phát triển khối u giữa lô SR 3 với lô 6-MP

3.2.4 Hiệu lực kháng u của thuốc nghiên cứu

B ả ng 3.10 Hi ệ u l ự c kháng u c ủa các lô điề u tr ị

Lô chuột Tỷ sốức chế u (%) Hiệu lực kháng u

Khả năng làm giảm khối u của lô SR1 đạt 56,97% và lô SR2 đạt 47,48%, cho thấy hiệu lực kháng u (+) theo thang đánh giá của H Itokawa Trong khi đó, các lô 6-MP và SR3 đều cho thấy hiệu lực kháng u (++) với tỷ số ức chế u lần lượt là 86,35% và 75,67% Ảnh 3.7 minh họa khối u ở chuột lô UT vào ngày thứ 23 sau khi cấy truyền tế bào sarcoma 180.

1 Khối u của chuột Ảnh 3 8 : Khối u ở chuột tại lô uống cốm cây sói rừng 5g/kg thể trọng vào ngày thứ 23 sau cấy truyền tế bào sarcoma 180

2 21 Ảnh 3.9: Khối u ở chuột tại lô uống 6-MP vào ngày thứ 23 sau cấy truyền tế bào sarcoma 180

3.2.5 Ảnh hưởng của cốm cây sói rừng đến hình ảnh vi thể khối u

Lô ung thư là một khối u ác tính, có sự đa dạng về tế bào và hình thái nhân Khối u này thường có nhiều nhân chia, bao gồm cả nhân điển hình và không điển hình Vùng rìa của khối u thường xuất hiện tình trạng xâm nhập của nhiều bạch cầu đa nhân và lympho bào.

Lô 6-MP : đa hình thái tế bào, nhiều nhân chia, xâm nhập lympho và tương bào ít

Lô SR1 (liều 5g/kg) cho thấy sự hiện diện của tế bào u đa hình thái, với các vùng hoại tử rõ rệt Chỉ còn lại những đảo tế bào u nằm trên các vùng hoại tử hoàn toàn, kèm theo phản ứng xơ hóa và sự xuất hiện của nhiều lympho cùng tương bào.

Lô SR2 (liều 10g/kg) : tế bào u đa dạng, có ít vùng hoại tử, mô đệm có xâm nhập nhiều lympho bào, tương bào

Lô SR3 (liều 20g/kg) : tế bào u đa dạng, có ít vùng hoại tử, mô đệm có phản ứng xơ mạnh

111 Ảnh 3 10 Hình ảnh vi thể khối u chuột lô UT (HE x 400)

1 Tế bào u nhân chia không điển hình

2 Tế bào lympho Ảnh 3 11 Hình ảnh vi thể khối u chuột lô 6 -MP (HE x 400)

1 Tế bào u nhiều nhân chia 2 Tế bào lympho

2 Ảnh 3 12 Hình ảnh vi thể khối u chuột lô SR 1

1 Tế bào u đa hình thái 2 Tế bào lympho Ảnh 3.1 3 Hình ảnh vi thể khối u chuột lô SR 2

1 Tế bào u 2 Tế bào lympho

1 2 Ảnh 3.1 4 Hình ảnh vi thể khối u chuột lô SR3

3.2.6 Ảnh hưởng của cốm cây sói rừng đến vi thể gan

Lô sinh học : tế bào gan thoái hóa nhẹ

Lô 6-MP : tế bào gan thoái hóa nhẹ, bào tương tế bào gan có ít hốc sáng nhỏ

Lô SR1 (liều 5g/kg) : tế bào gan thoái hóa nhẹ, bào tương tế bào gan có ít hốc sáng nhỏ

Lô SR2 (liều 10g/kg) : tế bào gan thoái hóa nhẹ, bào tương tế bào gan có ít hốc sáng nhỏ

Lô SR3 (liều 20g/kg) : tế bào gan thoái hóa vừa, bào tương tế bào gan có khá nhiều hốc sáng nhỏ

Mô đệm Ảnh 3.1 5 Hình ảnh vi thể gan chuột lô sinh học

1 Tế bào gan thoái hóa nhẹ Ảnh 3.1 6 Hình ảnh vi thể gan chuột lô 6 -MP (HE x 400)

1 Tế bào gan thoái hóa nhẹ

1 Ảnh 3.1 7 Hình ảnh vi thể gan chuột lô SR1 (HE x 400)

1 Tế bào gan thoái hóa nhẹ Ảnh 3.1 8 Hình ảnh vi thể gan chuột lô S R2 (HE x 400)

1 Tế bào gan thoái hóa nhẹ

1 Ảnh 3.1 9 Hình ảnh vi thể gan chuột lô SR 3 (HE x 400)

1 Tế bào gan thoái hóa vừa

3.2.7 Tác dụng của cốm cây sói rừng đến thời gian sống thêm của chuột mang u

B ả ng 3.11 S ố chu ộ t s ố ng sót ở các lô thí nghi ệ m

Lô chuột Số ngày sau uống thuốc

- Lô 6-MP có cá thể chuột đầu tiên chết vào ngày 18 và tiếp tục xuất hiện chuột chết trong các ngày tiếp theo

- Các cá thể chuột chết đầu tiên ở lô UT và lô SR1 xuất hiện vào ngày thứ

43 Tuy nhiên, tỷ lệ chuột sống sót của lô uống cốm cây sói rừng cao hơn lô ung thư tại thời điểm này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05

Vào ngày thứ 160 của thí nghiệm, vẫn còn hai cá thể chuột sống sót trong lô uống cốm cây sói rừng, trong khi đó, ở lô ung thư, tất cả chuột đã chết vào ngày thứ 83, và ở lô 6-MP, không còn cá thể nào sống sót vào ngày thứ 101.

Bi ểu đồ 3.4 T ỷ l ệ s ố ng sót c ủ a chu ộ t ở các lô thí nghi ệ m trong 160 ngày theo dõi

Chuột ở lô 6-MP bắt đầu chết vào ngày thứ 18, với số lượng chuột chết tăng nhanh từ ngày 25 đến ngày 30 Đến ngày thứ 101, không còn cá thể chuột nào sống sót.

-Chuột ở lô ung thư bắt đầu chết vào ngày thứ 41 và chết liên tiếp vào các ngày 56 đến ngày 82 Đến ngày thứ 89 thì không còn chuột nào sống sót

-Chuột ở lô SR 5g/kg thể trọng, số chuột chết tập trung vào các ngày 65 đến ngày 81, đến cuối đợt thí nghiệm vẫn còn 2 cá thể chuột sống

B ả ng 3.12: Th ờ i gian s ố ng trung bình (TGSTB) và % th ờ i gian s ố ng kéo dài thêm (ILS) c ủ a chu ộ t

Lô SR1 ( X  SD) TGSTB (ngày) 54,6 ± 15.8 49,2 ± 35.43 84,7 ± 46.4 p< 0,05

- Lô uống cốm cây sói rừng có thời gian sống trung bình kéo dài hơn so với lô uống 6-MP Sự khác biệt là có ý nghĩa thống kê với p < 0,05

- Thời gian sống trung bình ở lô uống cốm cây sói rừng tăng hơn so với lô ung thư có ý nghĩa thống kê tại cùng thời điểm nghiên cứu

- Cốm cây sói rừng đã làm tăng % thời gian sống thêm ở chuột lên 55,13%

3.3 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CỐM CÂY SÓI RỪNG TRÊN TỶ

LỆ TẾ BÀO CD3, CD4, CD8, IL-2 VÀ TNF-α CỦA CHUỘT MANG U

RẮN SARCOMA 180 3.3.1 Đánh giá tình trạng chung của hệ miễn dịch

3.3.1.1 Trọng lượng tuyến ức tương đối và vi thể tuyến ức

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của cốm cây sói rừng lên trọng lượng tuyến ức tương đố i

Trọng lượng tuyến ức tương đối (mg) ( X  SD) p

*: Khác lô sinh học (SH) với p < 0,05

- Trọng lượng tuyến ức tương đối của cả lô UT, lô 6-MP và lô SR1 đều tăng có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh học (p < 0,05)

Nghiên cứu cho thấy thuốc 6-MP kết hợp với cốm cây sói rừng đã làm tăng trọng lượng tuyến ức tương đối của chuột so với nhóm chuột ung thư không được điều trị, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

- Ở lô uống 6-MP, trọng lượng tuyến ức tương đối có xu hướng cao hơn so với lô uống sói rừng

3.3.1.2 Biến đổi cấu trúc vi thể tuyến ức:

Lô sinh học : Tuyến ức bình thường

Lô ung thư : Số lượng lympho bào gần như bình thường, tỷ lệ tủy/vỏ cao hơn so với lô sinh học

Lô 6-MP : Tập trung nhiều lympho bào ở vùng vỏ và tủy, tỷ lệ tủy/vỏ cao hơn so với lô sinh học

Lô SR1 có sự tập trung cao lympho bào ở vùng vỏ và tủy, với tỷ lệ tủy/vỏ vượt trội so với lô sinh học Ảnh 3.20 minh họa hình ảnh vi thể của tuyến ức ở lô chuột sinh học.

1 Ảnh 3 21 Hình ảnh vi thể tuyến ức lô chuột ung thư

1 Tế bào lympho Ảnh 3.2 2 Hình ảnh vi thể tuyến ức lô chuột uống 6 -MP

1 Ảnh 3.2 3 Hình ảnh vi thể tuyến ức lô chuột uống sói rừng

3.3.1.3 Trọng lượng lách tương đối và vi thể lách

Bi ểu đồ 3.5 Ảnh hưở ng c ủ a c ố m cây sói r ừ ng lên tr ọng lượ ng lách t ương đố i

Cuối đợt điều trị, trọng lượng lách tương đối của cả ba lô chuột ung thư được điều trị bằng 6-MP và cốm cây sói rừng đều tăng rõ rệt so với lô chứng sinh học.

Chỉ số của lô uống 6-MP và lô uống cốm cây sói rừng có sự thay đổi có ý nghĩa thống kê so với lô ung thư (p < 0,05), tuy nhiên không có sự khác biệt đáng kể giữa lô uống 6-MP và lô uống cốm cây sói rừng (p > 0,05).

3.3.1.4 Biến đổi cấu trúc vi thể lách:

Lô sinh học : Tủy trắng bình thường

Lô ung thư : Tăng sốlượng lympho bào và kích thước của tủy trắng

Lô 6-MP : Tăng số lượng lympho bào và kích thước của tủy trắng

Lô SR1 : Tủy trắng tăng mạnh kích thước và số lượng lympho bào Ảnh 3 24 Hình ảnh vi thể lách chuột lô sinh học (HE x 400)

1 Ảnh 3 25 Hình ảnh vi thể lách chuột lô ung thư (HE x 400)

1 Tế bào lympho Ảnh 3 26 Hình ảnh vi thể lách chuột lô 6 -MP (HE x 400)

1 Ảnh 3 27 Hình ảnh vi thể lách chuột lô SR1 (HE x 400)

3.3.1.5 Trọng lượng tim tương đối

Bi ểu đồ 3.6 Ảnh hưở ng c ủ a c ố m cây sói r ừ ng lên tr ọng lượ ng tim tương đố i

Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ % trọng lượng tim/trọng lượng cơ thể giữa lô đối chứng sinh học và các lô điều trị bằng 6MP, cốm cây sói rừng liều 5g/kg thể trọng (p > 0,05) Tuy nhiên, ở lô đối chứng ung thư, tỷ lệ này có xu hướng tăng cao hơn so với các lô khác.

3.3.1.6 Số lượng tế bào máu ngoại vi

B ả ng 3.14 Ảnh hưở ng c ủ a c ố m cây sói r ừ ng lên s ố lượ ng h ồ ng c ầ u

STT Lô chuột n Số lượng hồng cầu (T/L)

*: Khác lô SH (sinh học) với p < 0,05

BÀN LUẬN

VỀ ĐỘC TÍNH CỦA CỐM CÂY SÓI RỪNG

Cây sói rừng là một dược liệu mới tại Việt Nam, nhưng chưa được đề cập nhiều trong tài liệu và không có trong Dược điển Việt Nam IV Do đó, việc xác định độc tính cấp và liều chết 50% là cần thiết để đánh giá mức độ độc và chọn liều thử cho các nghiên cứu tiếp theo Nghiên cứu độc tính cấp được thực hiện trên chuột nhắt trắng theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon, một phương pháp kinh điển để thử độc tính cấp của thuốc Kết quả nghiên cứu cho thấy LD50 của cốm cây sói rừng qua đường uống trên chuột nhắt thực nghiệm là 98,753 (89,065 –).

Nghiên cứu cho thấy LD50 của dược liệu cây sói rừng là 103,597 g/kg với p = 0,05, gấp 10,27 lần so với liều dùng 40g/ngày theo dân gian Theo hướng dẫn của WHO, liều dân gian của cây sói rừng được coi là tương đối an toàn So với các dược liệu khác, cây sói rừng thuộc loại có độc, vì nhiều dược liệu không xác định được LD50 trong nghiên cứu độc tính cấp Phan Anh Tuấn (2006) đã cho chuột uống bột sâu chít đến 18g/kg/ngày mà không ghi nhận sự thay đổi bất thường hay tử vong trong 72 giờ Tương tự, Tạ Thu Thủy và cộng sự (2013) cũng không xác định được độc tính cấp LD50 khi nghiên cứu bài thuốc Đại an hoàn với liều 119g/kg, gấp 110 lần liều dùng trên người.

Nghiên cứu độc tính cấp cho thấy chuột chết có gan và thận hồng, mềm mại, không xung huyết, cho thấy độc tính của cốm cây sói rừng không ảnh hưởng đến chức năng gan, thận mà có thể tác động đến nhiều hệ cơ quan khác Đặc biệt, khó thở là dấu hiệu thường gặp ở những lô chuột uống cốm cây sói rừng liều cao, đặt ra câu hỏi về ảnh hưởng của thuốc đến hệ hô hấp Do đó, cần tiến hành các nghiên cứu chuyên sâu về độc tính để làm rõ vấn đề này.

Nghiên cứu về tác dụng gây độc tế bào của cây sói rừng cho thấy nó có hiệu quả đối với hai dòng tế bào ung thư gan và ung thư máu, cho thấy cây này chứa các thành phần gây độc Điều này có thể giải thích cho mức độ độc tính LD50 của cây Trong y học cổ truyền, cây sói rừng được phân loại là dược liệu có tính độc Nghiên cứu của Đỗ Thị Oanh và cộng sự (2010) chỉ ra rằng liều LD50 của cao lỏng sói rừng khi thử nghiệm trên chuột nhắt trắng dao động từ 240 – 270g dược liệu/kg cân nặng chuột, thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của chúng tôi Sự khác biệt này có thể được lý giải bởi một số nguyên nhân nhất định.

Địa điểm và thời gian thu hái dược liệu rất quan trọng để đảm bảo chất lượng Nghiên cứu của Đỗ Thị Oanh cho thấy cây sói rừng được thu hái vào tháng 7 tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc, trong khi nghiên cứu của chúng tôi thực hiện thu hái vào tháng 5 tại Hòa An, Cao Bằng Theo WHO, chất lượng dược liệu từ cùng một loài có thể khác nhau tùy thuộc vào địa điểm trồng do ảnh hưởng của đất, khí hậu và các yếu tố khác Việc thu hái dược liệu cần được thực hiện vào thời điểm thích hợp để đạt được chất lượng tốt nhất cho nguyên liệu và thành phẩm Nồng độ các thành phần hoạt tính sinh học thay đổi theo giai đoạn phát triển của cây, đặc biệt là với các cây bản địa có chứa độc tố.

Thuốc nghiên cứu của Đỗ Thị Oanh được bào chế dưới dạng cao lỏng và sử dụng dạng cốm tan Trong quá trình tạo cốm, Lactose được trộn thêm như một tá dược độn, giúp tạo kênh khuếch tán khi tan trong nước Điều này không chỉ đảm bảo độ bền cơ học mà còn tăng khả năng giải phóng hoạt chất của thuốc.

Cốm cây sói rừng có liều LD50 cao hơn so với cao lỏng cây sói rừng, điều này cho thấy sự khác biệt trong độc tính giữa hai dạng bào chế Việc lựa chọn dạng bào chế phù hợp là rất quan trọng để giảm thiểu độc tính của thuốc.

Nghiên cứu về tác dụng kháng u và tăng cường miễn dịch của cây sói rừng hiện nay chủ yếu dựa vào dịch chiết toàn phần, dẫn đến nguy cơ độc tính Luận án này sử dụng cốm cây sói rừng từ dịch chiết toàn phần để khảo sát tác dụng sinh học và độc tính, nhưng đây là một hạn chế cần khắc phục Cần có các nghiên cứu tiếp theo về chất phân lập để xác định rõ thành phần có hoạt tính kháng u, tăng cường miễn dịch và thành phần gây độc, nhằm đảm bảo tính an toàn và hiệu quả trong sử dụng thuốc lâm sàng cho bệnh nhân.

4.1.2 Vềđộc tính bán trường diễn

Theo nguyên tắc ngoại suy liều của Đỗ Trung Đàm, tỷ lệ liều dùng cho thỏ so với người là 3:1 Với liều cốm cây sói rừng 10g/kg trên người, liều tương ứng cho thỏ sẽ là 0,6g/kg Trong nghiên cứu độc tính bán trường diễn, hai mức liều 0,6g/kg (liều lâm sàng) và 3g/kg (gấp 5 lần liều lâm sàng) sẽ được đánh giá.

4.1.2.1 Ảnh hưởng của cốm cây sói rừng tới tình trạng chung và thay đổi thể trọng thỏ

Kết quả nghiên cứu từ biểu đồ 3.1 cho thấy thỏ ở cả ba lô chứng, lô uống cốm cây sói rừng liều 0,6g/kg và lô uống cốm cây sói rừng liều 3g/kg đều phát triển bình thường về cân nặng, không có sự khác biệt về mức tăng trọng lượng giữa các lô thỏ Theo dõi tình trạng sức khỏe hàng ngày cũng cho thấy không có biểu hiện bất thường ở các lô thỏ.

Thỏ dùng trong nghiên cứu là thỏ trưởng thành, có trọng lượng ổn định từ 2 – 2,5kg, phù hợp với sinh lý phát triển Cốm cây sói rừng không ảnh hưởng đến tình trạng chung và trọng lượng của thỏ trong giai đoạn trưởng thành.

4.1.2.2 Ảnh hưởng của cốm cây sói rừng đến chức năng tạo máu

Kết quả nghiên cứu cho thấy sau 8 tuần sử dụng cốm cây sói rừng, các chỉ số hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, phần trăm các loại bạch cầu, hematocrit và hàm lượng hemoglobin không có sự biến đổi ở cả lô chứng và lô sử dụng cốm sói rừng Điều này chứng tỏ rằng cốm cây sói rừng không ảnh hưởng đến chức năng tạo máu của thỏ bình thường, trưởng thành.

4.1.2.3 Ảnh hưởng của cốm cây sói rừng đến chức năng gan

Chuyển hóa chất là một trong những chức năng quan trọng của gan

Gan có hệ thống enzym phong phú cho tổng hợp và thoái hóa protein, lipid Tổn thương gan ảnh hưởng đến hàm lượng protein máu Nghiên cứu cho thấy cốm cây sói rừng với liều 0,6g/kg và 3g/kg không làm thay đổi nồng độ albumin, bilirubin và cholesterol trong huyết thanh thỏ Điều này chứng minh rằng cốm cây sói rừng không ảnh hưởng đến chức năng chuyển hóa protein, lipid cũng như chức năng bài tiết và chuyển hóa mật của gan.

Khi thuốc được đưa vào cơ thể, nó có thể gây độc hại cho gan, ảnh hưởng đến cả cấu trúc và chức năng của cơ quan này Do đó, việc nghiên cứu tác động của thuốc lên gan là rất quan trọng trong quá trình đánh giá độc tính.

Mức độ tổn thương tế bào gan được đánh giá qua hoạt độ transaminase ALT và AST trong huyết thanh Khi tế bào gan bị tổn thương, hoạt độ enzym ALT tăng cao hơn đáng kể so với AST, do phần lớn enzym AST nằm trong ty thể Trong nghiên cứu, sau 8 tuần, hoạt độ ALT và AST ở nhóm uống cốm cây sói rừng liều 3g/kg tăng cao hơn nhóm chứng với p < 0,05, trong khi nhóm uống liều 0,6g/kg chỉ làm tăng hoạt độ ALT.

VỀ TÁC DỤNG KHÁNG U RẮN SARCOM 180 CỦA CỐM CÂY SÓI RỪNG TRÊN CHUỘT NHẮT

4.2.1 Về mô hình nghiên cứu

Có nhiều phương pháp gây u cho động vật, bao gồm sử dụng hóa chất, ghép mô ung thư, cấy ghép tế bào ung thư, gây đột biến gen hoặc chuyển gen ung thư Trên thế giới hiện có ba loại mô hình ung thư thực nghiệm trên chuột: chuột chuyển gen ung thư, chuột cấy ghép ung thư người và chuột mang dòng ung thư cấy chuyển Mô hình chuột chuyển gen ung thư sử dụng kỹ thuật chuyển đoạn DNA chứa gen ung thư liên kết với gen hoạt hóa, giúp các gen ung thư biểu lộ trong tế bào và mô đặc hiệu của chuột thuần chủng Mô hình này chủ yếu được áp dụng để nghiên cứu cơ chế bệnh sinh ung thư và kiểm tra hoạt tính sinh ung thư.

Chuột chuyển gen ung thư được nhiều tác giả sử dụng làm mô hình nghiên cứu u người để thử nghiệm độc tính, đánh giá hiệu quả và tính ổn định của các loại thuốc chống ung thư.

Mô hình chuột mang dòng ung thư người được Povlsen C và Rygaad

Năm 1971, J đã lần đầu tiên xây dựng mô hình ghép dưới da chuột với khối ung thư biểu mô tuyến đại tràng người Hiện nay, mô hình chuột cấy ghép ung thư người chủ yếu tập trung vào các khối u thể rắn, trong đó hai loại ung thư phổ biến nhất là ung thư vú và ung thư đại tràng Mô hình ung thư thực nghiệm này đóng vai trò quan trọng trong việc sàng lọc các liệu pháp mới chống ung thư.

Mô hình này được áp dụng trong nghiên cứu di căn xa của các tế bào ung thư, giúp tìm hiểu cơ chế bệnh sinh và kiểm tra hoạt tính gây u của nhiều loại tế bào ung thư khác nhau.

Mô hình chuột mang dòng ung thư cấy chuyển đã tồn tại từ năm 1910, khi Roux tiêm dịch lọc từ u sarcom gà vào gà khỏe mạnh, tạo ra khối sarcom mới Nghiên cứu của Carrel và Lewis (1923) chỉ ra rằng tế bào ung thư, dù trong cơ thể động vật hay nuôi cấy, vẫn giữ được đặc tính mô bệnh học Hiện nay, có khoảng 3000 dòng tế bào ung thư được phân lập, trong đó hơn 1000 dòng được sử dụng thường xuyên Số lượng dòng tế bào được lựa chọn trong thí nghiệm sàng lọc thuốc chống ung thư phụ thuộc vào số lượng thuốc, đặc tính của mỗi dòng tế bào và điều kiện phòng thí nghiệm.

Tại Việt Nam, hai dòng tế bào ung thư phổ biến trong nghiên cứu thực nghiệm là ung thư mô liên kết (Sarcom 180) và ung thư biểu mô phổi (Lewis Lung Carcinoma) Những dòng tế bào này thường được tiêm vào khoang bụng chuột để tạo ra u báng hoặc tiêm vào cơ đùi và dưới da để gây u rắn.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng dòng tế bào sarcoma 180 để gây u cho chuột nhắt trắng dòng Swiss Dòng tế bào sarcoma 180 là dòng tế bào chuẩn được nhiều viện nghiên cứu ung thư trên thế giới áp dụng, nhờ vào khả năng sống trong dịch ổ bụng, mô liên kết, dễ dàng xác định đặc tính di truyền và nhạy cảm với các liệu pháp điều trị ung thư.

[151] Dòng tế bào này do ATCC cung cấp, được bảo quản trong nitơ lỏng ở -

Tế bào sarcoma 180 được rã đông ở nhiệt độ 196 o C và nuôi cấy in vitro trong môi trường RPMI với 10% FBS Trong quá trình nuôi cấy, tế bào phát triển ở dạng trôi nổi và có hình cầu Khi đạt số lượng trên 100 triệu tế bào, chúng sẽ được lưu trữ làm tế bào giống gốc và sử dụng để cấy ghép gây u cho chuột thí nghiệm.

Một số tác giả đã áp dụng mô hình u báng trong nghiên cứu ung thư thực nghiệm, tuy nhiên, mô hình này khiến dòng tế bào ung thư phát triển nhanh chóng, phù hợp cho nghiên cứu động học nhưng làm giảm thời gian sống thêm của động vật Ngược lại, mô hình u rắn cho phép nghiên cứu hình thái và chức năng của khối u, với sự phát triển nhanh của tế bào ung thư Khi khối u lớn lên, cơ thể phản ứng tại chỗ và toàn thân, giúp nghiên cứu các biến đổi về kích thước và thể tích khối u Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã gây u rắn bằng cách tiêm 0,2ml huyền dịch chứa 10^6 tế bào sarcoma 180 vào dưới da chuột nhắt trắng Swiss Quan sát hàng ngày cho thấy các khối u hình thành tại vùng lưng, với thể tích tăng dần theo thời gian Sau khi tiêm tế bào ung thư, các triệu chứng toàn thân của chuột không được điều trị diễn biến xấu đi, với hầu hết chuột có biểu hiện bỏ ăn, suy kiệt, và bắt đầu chết từ ngày thứ 43.

Để đánh giá tác dụng kháng u của cốm cây sói rừng, một loại thảo dược, trên động vật thực nghiệm, mô hình nghiên cứu mà chúng tôi lựa chọn hoàn toàn phù hợp.

4.2.2 Về tác dụng kháng u rắn sarcoma 180

Theo kinh nghiệm từ Trung Quốc và Việt Nam, liều lượng sói rừng sắc uống để trị bệnh thường dao động từ 20 đến 40 gam Để xác định liều dùng hiệu quả trên người, nghiên cứu đã lựa chọn ba mức liều 5g/kg, 10g/kg và 20g/kg dựa trên trọng lượng chuột nhắt trắng, tương ứng với liều ngoại suy cho con người.

[143] Theo Đỗ Trung Đàm, liều có tác dụng dược lý dao động trong giới hạn từ 1/20 đến 1/5 LD50 [152], vậy các tỷ lệ 1/3, 1/7 và 1/15 là chấp nhận được

Trong thí nghiệm, liều cao nhất cho chuột uống là 20g cốm/kg (tương đương 27g dược liệu/kg thể trọng) So với liều cao nhất không gây chết động vật thí nghiệm là 89,04g dược liệu/kg, khoảng cách giữa liều cao nhất trong thí nghiệm và liều bắt đầu gây độc là khoảng 1/3, cho thấy sự chấp nhận được trong nghiên cứu.

4.2.2.1 Ảnh hưởng của cốm cây sói rừng tới tình trạng chung và thay đổi thể trọng chuột

Bất kỳ chế phẩm nào tác động vào cơ thể, dù là đắp, tiêm hay uống, đều ảnh hưởng đến sức khỏe và sinh lý Trước khi khảo sát hoạt tính ức chế khối u, cần theo dõi ảnh hưởng của cốm cây sói rừng đến sức khỏe chuột thông qua việc quan sát hoạt động ăn uống, vận động và tăng trọng của chúng.

Trong quá trình quan sát hoạt động ăn uống, các lô chuột 6-MP, SR 5g/kg và UT không cho thấy sự khác biệt so với lô chuột SH không bị ung thư Tuy nhiên, lô chuột SR 10g/kg và SR 20g/kg có trọng lượng giảm rõ rệt, cho thấy tình trạng ăn uống kém hơn so với các lô chuột khác.

Kết quả từ biểu đồ 3.2 cho thấy vào ngày đầu tiên điều trị, trọng lượng chuột ở các lô tương đương nhau (trung bình khoảng 25g) và đều tăng sau mỗi lần cân, với lô sinh học có trọng lượng lớn nhất do không bị tác động từ tế bào ung thư hay thuốc thử nghiệm Lô chuột ung thư điều trị bằng cốm SR liều 5g/kg có trọng lượng tăng nhẹ nhưng vẫn thấp hơn lô sinh học và lô UT (ung thư không điều trị), với sự khác biệt không có ý nghĩa (p > 0,05) Trong khi đó, lô SR 10g/kg và đặc biệt lô SR 20g/kg có trọng lượng chuột thấp hơn rõ rệt so với các lô khác (p < 0,05) Đối với lô 6-MP, trọng lượng chuột bắt đầu giảm từ ngày 13 sau khi uống thuốc và giảm mạnh ở các lần cân cuối.

Tiêu đề	Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng kháng u sarcoma 180 của cốm cây sói rừng Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai trên thực nghiệm
Tác giả	Nguyễn Thị Thu Trang
Người hướng dẫn	PTS. Nguyễn Văn A, PGS.TS. Nguyễn Văn B
Trường học	Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Thành phố	TP. Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	167
Dung lượng	4,43 MB