(LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tính an toàn và tác dụng kháng u sarcoma 180 của cốm cây sói rừng sarcandra glabra (thunb ) nakai trên thực nghiệm

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư xem bệnh xã hội thời đại Cùng với yếu tố di truyền, loại hóa chất độc hại từ sản phẩm gia dụng, tia cực tím, khói bụi cơng nghiệp, mơi trường sống bị ô nhiễm, thói quen sinh hoạt thiếu khoa học, uống nhiều bia rượu, hút thuốc lá… đẩy nhanh số ca mắc bệnh ung thư toàn giới Theo dự đoán Tổ chức Y tế giới (WHO), đến năm 2020 số người mắc ung thư đạt tới 16 triệu người năm Tại Việt Nam, năm có khoảng 150.000 trường hợp mắc ung thư khoảng 75.000 trường hợp tử vong ung thư [1] Hiện nay, ung thư điều trị nhiều phương pháp: phẫu thuật, hóa trị, xạ trị (phương pháp điều trị truyền thống), liệu pháp hormon, liệu pháp sinh học (miễn dịch), điều trị trúng đích ghép tế bào gốc [2],[3] hóa trị, xạ trị, phẫu thuật áp dụng rộng rãi đến biện pháp trị ung thư Việt Nam Tuy nhiên, phương pháp điều trị truyền thống có hạn chế định, đặc biệt với bệnh nhân ung thư giai đoạn cuối sức đề kháng thể giảm tổn hại chức tủy xương, gan, thận Đã từ lâu, Y học cổ truyền (YHCT) xem phương thức hỗ trợ điều trị ung thư tương đối hiệu Các cơng trình nghiên cứu ứng dụng lâm sàng cho thấy nhiều vị thuốc, thuốc YHCT hỗ trợ điều trị ung thư khía cạnh: tăng cường đáp ứng miễn dịch thể ức chế phát triển khối u [4],[5],[6],[7],[8],[9] Sự kết hợp Y học đại (YHHĐ) YHCT điều trị ung thư phát huy mạnh thuốc YHCT, nâng cao sức đề kháng thể, hạn chế tối đa tình trạng tái phát di khối u tác dụng khơng mong muốn hóa - xạ trị, nên triệu chứng lâm sàng cải thiện Một LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com hướng nghiên cứu YHCT tìm chất thảo dược nguồn gốc thiên nhiên có tác dụng tăng cường miễn dịch ức chế phát triển tế bào ung thư Cây sói rừng (tên khoa học Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) vị thuốc ghi nhận có tác dụng hỗ trợ điều trị số loại hình ung thư [10],[11] Tuy nhiên, Việt Nam, chưa có nghiên cứu đầy đủ khoa học tác dụng kháng u hay hỗ trợ điều trị ung thư Sói rừng Vì vậy, để khởi đầu cho nghiên cứu tiền lâm sàng lâm sàng tiếp theo, tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu tính an tồn tác dụng kháng u sarcoma 180 cốm sói rừng Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai thực nghiệm” với mục tiêu sau: Xác định độc tính cấp bán trường diễn cốm sói rừng Đánh giá tác dụng kháng u rắn sarcoma 180 cốm sói rừng chuột nhắt Khảo sát ảnh hưởng cốm sói rừng tỷ lệ tế bào TCD3, TCD4, TCD8, nồng độ IL-2 TNF α chuột mang u rắn sarcoma 180 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 UNG THƯ VÀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRONG UNG THƯ 1.1.1 Khái niệm ung thư Ung thư tên dùng chung để gọi nhóm bệnh gồm 200 loại khác nguyên nhân, tiến triển, cách thức điều trị, tiên lượng bệnh có chung đặc điểm bật tế bào ung thư có khả xâm lấn, phát triển tồn quan, tổ chức khác thể Đây bệnh ác tính tế bào, tế bào ung thư tăng sinh nhanh, vô tổ chức thường xâm lấn vào tổ chức xung quanh làm rối loạn chức tổ chức quan [12] 1.1.2 Nguyên nhân ung thư Ung thư nguyên nhân gây Tùy theo loại ung thư mà có nguyên nhân khác [13], [14], [15] Có thể chia nguyên nhân gây ung thư thành hai nhóm lớn: ngun nhân bên ngồi ngun nhân bên 1.1.2.1 Các nguyên nhân từ bên - Tác nhân vật lý: tia phóng xạ phát từ chất phóng xạ tự nhiên hay nhân tạo quân sự, y học… tia cực tím ánh nắng mặt trời có khả tác động trực tiếp gián tiếp lên DNA thông qua việc tạo nhiều gốc tự làm thay đổi cấu trúc DNA Từ tạo điều kiện hình thành số bệnh di truyền ung thư [16] LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Tác nhân hóa học: Là hóa chất sử dụng công nghiệp, chiến tranh, thực phẩm hàng ngày người chất bảo quản thịt, cá, lạp xường, jămbon, loại thịt, cá ướp muối … chất thải môi trường khói thuốc lá, thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu, amiăng, dioxin, gốc tự do… [15],[17],[18],[19],[20] - Tác nhân sinh học: chủ yếu virus Các loại virus nghiên cứu đến nhiều gồm: Virus viêm gan B C, virus gây u nhú người (HPV), virus Epstein – Barr (EBV) Ngoài sán Schistosoma vi khuẩn Helicobacter Pylori (HP) coi nguyên nhân gây nên số ung thư ung thư bàng quang, ung thư dày [21],[22] 1.1.2.2 Nguyên nhân bên - Nội tiết tố: Một số nhóm nội tiết tố làm tăng nguy ung thư sau dùng chúng Ví dụ estrogen dùng điều trị để giảm triệu chứng mãn kinh, giảm nguy bệnh tim mạch vành lại làm tăng nguy ung thư nội mạc tử cung [23], [24] - Enzym chất vi lượng: Một số ion Fe++, Cu++ có nồng độ cao dễ gây tách nước, tạo thành gốc superoxid gây độc thể hoạt động enzym SOD bị giảm sút gây ung thư [25] - Các gốc tự do: có hoạt tính hóa học mãnh liệt, phản ứng nhanh với phân tử sinh học gây tổn thương DNA tạo điều kiện cho hình thành ung thư [25] - Các yếu tố di truyền: Gen bất thường dẫn đến ung thư khoảng 5% - 10% tất loại ung thư xuất đột biến gen di truyền từ cha mẹ Một số hội chứng ung thư biết LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com có mang yếu tố di truyền bệnh đa u tuyến nội tiết, hội chứng LiFraumeni, hội chứng Turcot… - Suy giảm miễn dịch AIDS: Sự suy giảm miễn dịch nặng kéo dài làm tăng cao nguy nhiễm loại virus bao gồm virus biết nghi ngờ nguyên nhân gây ung thư EBV, CMV Người có HIV dương tính, đặc biệt chuyển qua giai đoạn AIDS có nguy cao mắc sarcom Kaposi, u lympho không Hodgkin số ung thư khác ung thư vòm, ung thư cổ tử cung [26] 1.1.3 Cơ chế bệnh sinh ung thư: chế bệnh sinh ung thư nhiều điểm chưa sáng tỏ Đa số ung thư đột biến DNA tế bào gốc tế bào tiếp xúc với yếu tố gây ung thư sai lệch tái chép DNA bên tế bào Có bốn nhóm gen liên quan đến q trình phát sinh, phát triển bệnh ung thư: - Nhóm gen gây ung thư (Oncogenes): tên gọi chung cho nhóm gen mà có mặt gen trạng thái tăng cường hoạt động dẫn tới hình thành phát triển bệnh ung thư Oncogen có nguồn gốc từ tiền gen ung thư (pro-oncogen) – gen bình thường hoạt động thời kỳ phôi gen tế bào khởi động phát triển biệt hóa bình thường Chức sinh lý tiền gen sinh ung điều hịa đường dẫn truyền tín hiệu tế bào để tế bào nhận kích thích cho phân bào chết theo lập trình Khi bị đột biến gây tăng sinh tế bào khơng kiểm sốt lúc tiền gen sinh ung thư trở thành gen sinh ung thư Hiện có 50 loại gen sinh ung thư phát gen APC, myc, ras…[27],[28],[29] - Gen ức chế ung thư (tumor suppresor genes): mã hoá cho protein kiểm soát phân bào làm chu kỳ phân bào bị dừng pha, thường LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com pha G1 Các gen ức chế ung thư cịn có chức làm biệt hố tế bào kích thích tế bào vào q trình chết theo chương trình Khi gen ức chế ung thư bị đột biến làm biến đổi tế bào lành thành tế bào ác tính Hiện nay, gen ức chế ung thư phát bao gồm gen BRCA-1, BRCA-2, NF-1, NF-2, WT-1, Rb, p53…[15],[27],[28],[29] - Nhóm gen điều hịa chết tế bào theo chương trình: Ở người trưởng thành bình thường, số lượng tế bào tái sinh thể cân với số lượng tế bào già chết Khi chế kiểm soát chết tế bào bị hỏng dẫn đến nguyên phân không giới hạn, tế bào không biệt hố hình thành ung thư Một số gen điều hịa chết tế bào theo chương trình xác định bcl - 2, bcl – xL, bax, bad, bcl – xS, p53 myc Hoạt hóa p53 làm thúc đẩy tế bào vào trình chết theo chương trình Gen myc bị đột biến kích thích tế bào phân chia Sự chết theo chương trình tế bào (apoptosis) giữ vai trị nhiều bệnh: điều hoà trực tiếp phát triển khối u, góp phần ngăn chặn hay làm chậm phát triển bệnh AIDS [25],[28],[29] - Nhóm gen sửa chữa DNA (DNA repair genes): tế bào bình thường có khả sửa chữa thương tổn DNA tiếp xúc với tác nhân gây hư hại DNA môi trường sống Các gen sửa chữa thương tổn DNA trì tồn vẹn gen Bản thân gen sửa chữa DNA không gây ung thư, chúng cho phép xuất đột biến gen khác trình phân chia tế bào bình thường [30] Trong chế bệnh sinh ung thư, vai trị nhóm gen sinh ung thư, gen ức chế ung thư, gen sửa chữa thương tổn DNA gen điều hòa chết tế bào theo chương trình lớn Khi có cân nhóm gen hay xuất khơng giai đoạn sinh lý, không pha phân bào LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com chu kỳ tế bào góp phần việc tích lũy đột biến gen để làm cho tế bào tiến triển ác tính 1.1.4 Điều trị ung thư Do ung thư bệnh phát triển thời gian tương đối dài kể từ khởi phát từ tế bào ban đầu, nên điều trị bệnh hồn tồn Tuy nhiên, bệnh giai đoạn di việc điều trị khó khăn tỷ lệ tử vong cao Vì việc điều trị bệnh thực sớm tốt [14],[31] - Điều trị phẫu thuật: Từ trước đến nay, phẫu thuật phương pháp chủ yếu để điều trị đại đa số bệnh nhân ung thư có khả phẫu thuật Phẫu thuật ung thư dùng để chẩn đốn, điều trị, xác định giai đoạn bệnh làm giảm triệu chứng ung thư gây Phẫu thuật điều trị phối hợp với phương pháp điều trị khác xạ trị, hóa trị, liệu pháp hormon liệu pháp sinh học [31] - Điều trị tia xạ: Là phương pháp sử dụng nguồn lượng cao từ tia X, tia γ, neutron nguồn phóng xạ khác để tiêu diệt tế bào ung thư khối u Xạ trị thường dùng để hỗ trợ cho biện pháp phẫu thuật trường hợp khối u q lớn tiến hành xạ trị trước sau mổ mà có lo ngại ung thư tái phát Các kỹ thuật xạ trị áp dụng gồm chiếu xạ từ vào, xạ trị áp sát (Brachythérapie) uống tiêm thuốc có đồng vị phóng xạ để diệt tế bào ung thư Một số tác dụng không mong muốn thường gặp xạ trị mệt mỏi, chán ăn, khô bong da, viêm loét niêm mạc, giảm dòng bạch cầu, tiểu cầu, hồng cầu [32],[33] - Điều trị hóa chất: Là phương pháp sử dụng hóa chất có khả tiêu diệt ngăn chặn phát triển tế bào ung thư Phương pháp LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com áp dụng ung thư lan vị trí ban đầu có di nhiều địa điểm [34],[35] Trong điều trị phối hợp, hóa chất dùng trước dùng sau phương pháp khác để ngăn ngừa phát triển vi di Cho đến nay, hóa trị liệu xem phương pháp điều trị hiệu thường kèm với nhiều tác dụng phụ buồn nôn, nơn, chán ăn, rối loạn tiêu hóa, rụng tóc, xạm da, thay đổi số xét nghiệm máu, chức gan, thận… [14], [34] Hiện có khoảng 200 loại thuốc chống ung thư sử dụng lâm sàng phân chia thành nhóm nhóm alkyl hóa (thuốc Cyclophosphamide, Cisplatin, Carboplatin), nhóm thuốc chống chuyển hố (5-fluorouracil, Mercaptopurine, Methotrexate), nhóm thuốc ức chế phân bào (Vincristine, Vinblastine, Taxol), nhóm kháng sinh kháng ung thư (Adriamycin, Mitomycin, Plicamycin) [35], [36] - Điều trị nội tiết: Điều trị nội tiết đóng vai trị quan trọng chiến lược điều trị số loại ung thư, đặc biệt ung thư đặc trưng liên quan đến giới Điều trị nội tiết ung thư cách sau: + Loại bỏ hormon trực tiếp kích thích khối u phát triển cách cắt bỏ tuyến nội tiết cắt buồng trứng ung thư vú + Dùng thuốc ức chế sản xuất nội tiết tố ức chế, cạnh tranh tác dụng nội tiết tố tế bào ung thư + Dùng nội tiết tố (hormon): ví dụ dùng Megestrol acetat điều trị ung thư nội mạc tử cung… - Điều trị miễn dịch (Miễn dịch trị liệu): sử dụng thuốc làm thay đổi tương tác qua lại vật chủ khối u từ mà có tác dụng chống u Phương pháp sử dụng đơn phối hợp với phẫu thuật, tia xạ hóa chất Đây lĩnh vực cịn mẻ có nhiều tiến Bên cạnh số thuốc áp dụng rộng rãi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thử nghiệm lâm sàng, nhiều thuốc nghiên cứu [35],[36],[37]: + Các cytokinee Interferon alpha (INF- α), Interferon gamma (INFᵞ ), Interleukin-2 (IL-2), IL-1, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12 + Yếu tố kích thích tạo cụm (Colony stimulating factor-CSF): gồm yếu tố kích thích tạo cụm dịng bạch cầu hạt (G-CSF), yếu tố kích thích tạo cụm dịng bạch cầu hạt đại thực bào (GM-CSF), IL-3 + Các kháng thể đơn dòng: Các kháng thể gắn với kháng nguyên bề mặt tế bào u từ phá hủy tế bào u Ngoài kháng thể dùng việc chuyên chở đồng vị phóng xạ, chất độc thuốc để tiêu diệt tế bào u Một số kháng thể đơn dòng sử dụng điều trị ung thư Rituximab, Alemtuzumab,Trastuzumab, Cetuximab - Điều trị trúng đích: có số phân tử đặc hiệu thể định dẫn truyền tín hiệu tăng trưởng, sinh mạch, điều hịa chu trình chết theo chương trình tế bào ung thư Khi cơng vào phân tử ngăn chặn hay loại trừ ung thư Các thuốc có tác dụng gây chết tế bào có độc tính tác dụng phụ thấp thuốc gây độc tế bào kinh điển Các thuốc trúng đích gồm: Imatinib, Nilotinib, Sorafenib…(có tác dụng ức chế protein kinase), Bevacizumab (có tác dụng ức chế tăng sinh mạch khối u)… 1.1.5 Đáp ứng miễn dịch ung thư 1.1.5.1 Khái niệm đáp ứng miễn dịch Miễn dịch khả thể nhận biết, đáp ứng loại bỏ yếu tố lạ gây hại [38] LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 10 Đáp ứng miễn dịch trình bảo vệ quan trọng phức tạp thể sinh vật Các yếu tố tham gia đáp ứng miễn dịch bao gồm: quan lympho trung ương (tủy xương, tuyến ức) ngoại vi (hạch lympho, lách, mơ lympho khơng có vỏ bọc); tế bào lympho T, B, tế bào diệt tự nhiên NK; tế bào thực bào đơn nhân số tế bào máu khác bạch cầu hạt trung tính, bạch cầu toan, bạch cầu kiềm tiểu cầu Ở người, đáp ứng miễn dịch chia hai loại: đáp ứng miễn dịch tự nhiên đáp ứng miễn dịch thu * Miễn dịch tự nhiên (miễn dịch không đặc hiệu): khả tự bảo vệ sẵn có mang tính di truyền thể loài Cơ thể loại trừ kháng nguyên (vi khuẩn, virus…) gây bệnh thông qua hàng rào vật lý, hoá học, tế bào, thể chất [38], [39] * Miễn dịch thu (miễn dịch đặc hiệu): trạng thái miễn dịch xuất kháng thể đặc hiệu tương ứng với kháng nguyên tạo sau thể tiếp xúc với kháng nguyên (KN) Miễn dịch thu gồm hai phương thức: đáp ứng miễn dịch dịch thể tế bào lympho B đảm nhiệm với globulin miễn dịch đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào tế bào lympho T đảm nhiệm với cytokine chúng tiết - Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (cell mediated immunoresponse): có hai loại phản ứng tùy theo tính chất KN tế bào trình diện Khi MHC lớp I trình diện KN cho thụ thể tế bào T (T cell receptor TCR) lympho T độc (Tc: T cytotoxic) dịng hoạt hóa tiêu diệt tế bào có mang KN ấy, phản ứng độc tế bào Nếu phân tử MHC lớp II trình diện KN cho TCR tế bào lympho T hỗ trợ (Th: T helper) kích thích tế bào tiết cytokine mà chủ yếu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Với tất kính trọng lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin bày tỏ tới: PGS.TS Đỗ Hịa Bình, ngun Phó chủ nhiệm Bộ môn Miễn dịch – Sinh lý bệnh, trường Đại học Y Hà Nội, người thầy tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ tơi suốt q trình nghiên cứu hoàn thành luận án Sự hiểu biết sâu sắc khoa học kinh nghiệm tiền đề giúp tơi có kinh nghiệm quý báu PGS.TS Phan Anh Tuấn, Giám đốc Trung tâm huấn luyện đào tạo, Viện YHCT Quân đội, người thầy kiên nhẫn hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình nghiên cứu đề tài Tơi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Đỗ Thị Phương, nguyên Trưởng khoa YHCT, trường Đại học Y Hà Nội quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Thị Vân Anh, Chủ nhiệm Bộ môn Dược lý, trường Đại học Y Hà Nội; PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, Phó chủ nhiệm Bộ mơn Sinh học tế bào, Khoa Sinh, Đại học KHTN- ĐH Quốc gia Hà Nội dành cho giúp đỡ nhiệt tình, nhiều ý kiến q báu để tơi thực nghiên cứu thực nghiệm môn Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán giáo viên, kỹ thuật viên Bộ môn Dược lý, trường Đại học Y Hà Nội, Bộ môn Sinh học tế bào, Khoa Sinh, Đại học KHTN- ĐH Quốc gia Hà Nội, Bệnh viện YHCT tỉnh Cao Bằng giúp đỡ nhiều mặt nguyên liệu, kỹ thuật phương pháp thực nghiệm để tơi hồn thành u cầu luận án, Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận án LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Tôi vô biết ơn bạn bè đồng nghiệp Khoa YHCT, trường Đại học Y Hà Nội dành tình cảm tốt đẹp, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Cuối gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ, chồng người thân động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt để học tập nghiên cứu Trần Thị Hải Vân LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi Trần Thị Hải Vân, nghiên cứu sinh khóa 30 trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Y học cổ truyền, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn của: - PGS.TS Đỗ Hịa Bình - PGS.TS Phan Anh Tuấn Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội ngày 24 tháng năm 2016 Người viết Trần Thị Hải Vân LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ADCC : Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity (gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể) AIDS : Acquired Immuno Deficiency Syndrome (Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) ALT : Alanin Transaminase AST : Aspartate Transaminase ATCC : American Type Culture Collection (ngân hàng nuôi cấy tế bào Mỹ) CD : Cluster of differenciation (dấu ấn bề mặt) CMV : Cytomegalo Virus CSF : Colony Stimulating Factor (Yếu tố kích thích tạo cụm) DĐVN : Dược điển Việt Nam DNA : Acid Deoxynucleic EBV : Epstein – Barr Virus G – CSF : Grannulocyte Colony Stimulating Factor (yếu tố kích thích dịng bạch cầu hạt) GM – CSF : Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor (yếu tố kích thích tạo cụm dịng bạch cầu hạt đại thực bào) HP : Helicobacter Pylori HPV : Human Papilloma Virus (Virut gây u nhú người) LAK : Lymphokine Activated Killer (Tế bào diệt hoạt hóa lympho) LD50 : Lethal Dose (liều gây chết nửa) MDA : Malonyl dialdehyd MHC : Major Histocompatibility Complex LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com (Phức hợp hịa hợp mơ chính) PBS : Phosphat Buffer Salin (muối đệm phốt phát) PE : Phycoerythrin RNA : Acid Ribonucleic SAV-HRP : Steplavidin Horseradish Peroxidase ((kháng thể có gắn enzym) SOD : Superoxide Dismutase Tc : T cytotoxic (Tế bào T gây độc) TCR : T Cell Receptor (Thụ thể tế bào T) TGF-α : Transforming Growth Factor (Yếu tố tăng trưởng chuyển hóa) Th : T helper (Tế bào T hỗ trợ) TMB : Tetramethylbenzidin (cơ chất tạo màu) TNF : Tumor Necrosis Factor (Yếu tố hoại tử u) WBF 1X : Wast Buffer (dung dịch rửa nồng độ 1%) WHO : World Health Ognization (Tổ chức Y tế Thế giới) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 UNG THƯ VÀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRONG UNG THƯ 1.1.1 Khái niệm ung thư 1.1.2 Nguyên nhân ung thư 1.1.3 Cơ chế bệnh sinh ung thư 1.1.4 Điều trị ung thư 1.1.5 Đáp ứng miễn dịch ung thư 1.1.6 Mơ hình thực nghiệm điều trị ung thư 13 1.2 QUAN NIỆM VỀ UNG THƯ TRONG Y HỌC CỔ TRUYỀN 17 1.2.1 Khái niệm 17 1.2.2 Nguyên nhân 17 1.2.3 Cơ chế bệnh sinh nham chứng 19 1.2.4 Điều trị nham chứng 21 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ UNG THƯ CỦA CÁC THUỐC YHCT 27 1.3.1 Trên giới 27 1.3.2 Tại Việt Nam 29 1.4 TỔNG QUAN VỀ CÂY SÓI RỪNG 30 1.4.1 Vị trí phân loại 31 1.4.2 Đặc điểm thực vật 31 1.4.3 Tính vị, tác dụng 32 1.4.4 Các nghiên cứu sói rừng 32 CHƯƠNG 2: CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 CHẤT LIỆU NGHIÊN CỨU 36 2.1.1 Thuốc nghiên cứu 36 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.1.2 Hóa chất nghiên cứu 38 2.1.3 Phương tiện, dụng cụ 38 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 39 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.3.1 Xác định độc tính cấp bán trường diễn cốm sói rừng 40 2.3.2 Đánh giá tác dụng kháng u rắn sarcoma 180 cốm sói rừng chuột nhắt 42 2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng cốm sói rừng tỷ lệ tế bào TCD3, TCD4, TCD8nồng độ IL-2 TNF-α chuột mang u rắn sarcoma 180 45 2.4 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 50 2.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU 50 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53 3.1 XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA CỐM CÂY SÓI RỪNG 53 3.1.1 Độc tính cấp 53 3.1.2 Độc tính bán trường diễn 54 3.2 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG U RẮN SARCOMA 180 CỦA CỐM CÂY SÓI RỪNG 64 3.2.1 Kết tạo khối u thực nghiệm 64 3.2.2 Ảnh hưởng cốm sói rừng đến trọng lượng thể chuột mang u 64 3.2.3 Ảnh hưởng cốm sói rừng đến phát triển khối u 65 3.2.4 Hiệu lực kháng u thuốc nghiên cứu 67 3.2.5 Ảnh hưởng cốm sói rừng đến hình ảnh vi thể khối u 69 3.2.6 Ảnh hưởng cốm sói rừng đến vi thể gan 72 3.2.7 Tác dụng cốm sói rừng đến thời gian sống thêm chuột mang u 75 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.3 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CỐM CÂY SÓI RỪNG TRÊN TỶ LỆ TẾ BÀO CD3, CD4, CD8, IL-2 VÀ TNF-α CỦA CHUỘT MANG U RẮN SARCOMA 180 78 3.3.1 Đánh giá tình trạng chung hệ miễn dịch 78 3.3.2 Đánh giá tỷ lệ tế bào lympho T nồng độ IL-2, TNF-α 88 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 92 4.1 VỀ ĐỘC TÍNH CỦA CỐM CÂY SĨI RỪNG 92 4.1.1 Về độc tính cấp 92 4.1.2 Về độc tính bán trường diễn 95 4.2 VỀ TÁC DỤNG KHÁNG U RẮN SARCOM 180 CỦA CỐM CÂY SÓI RỪNG TRÊN CHUỘT NHẮT 98 4.2.1 Về mơ hình nghiên cứu 98 4.2.2 Về tác dụng kháng u rắn sarcoma 180 101 4.3 VỀ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CỐM CÂY SÓI RỪNG TRÊN TỶ LỆ TẾ BÀO CD3, CD4, CD8, IL-2 VÀ TNF-α CỦA CHUỘT MANG U RẮN SARCOMA 180 109 4.3.1 Về tình trạng chung hệ miễn dịch 109 4.3.2 Về ảnh hưởng tới tỷ lệ tế bào T nồng độ IL-2, TNF-α 117 4.3.3 Tác dụng kháng u tăng cường miễn dịch sói rừng theo quan điểm y học cổ truyền 123 KẾT LUẬN 126 KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT 128 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Tỷ lệ chuột chết vòng 72 đầu sau uống cốm sói rừng 53 Bảng 3.2 Sự thay đổi số lượng tế bào máu ngoại vi thỏ 55 Bảng 3.3 Ảnh hưởng cốm sói rừng đến số số huyết học 55 Bảng 3.4 Ảnh hưởng cốm sói rừng đến công thức bạch cầu máu thỏ 56 Bảng 3.5 Ảnh hưởng cốm sói rừng đến hàm lượng albumin, cholesterol bilirubin máu thỏ 57 Bảng 3.6 Ảnh hưởng cốm sói rừng đến hoạt độ AST, ALT máu thỏ 58 Bảng 3.7 Ảnh hưởng cốm sói rừng đến nồng độ creatinin máu thỏ 59 Bảng 3.8 Tỷ lệ chuột có giảm thể tích khối u sau 18 ngày điều trị 66 Bảng 3.9 So sánh thay đổi thể tích trung bình khối u lô chuột vào ngày 23 sau gây u 67 Bảng 3.10 Hiệu lực kháng u lô điều trị 67 Bảng 3.11 Số chuột sống sót lơ thí nghiệm 75 Bảng 3.12: Thời gian sống trung bình % thời gian sống kéo dài thêm chuột 77 Bảng 3.13 Ảnh hưởng cốm sói rừng lên trọng lượng tuyến ức tương đối 78 Bảng 3.14 Ảnh hưởng cốm sói rừng lên số lượng hồng cầu 85 Bảng 3.15 Ảnh hưởng cốm sói rừng lên số lượng tiểu cầu 85 Bảng 3.16 Ảnh hưởng cốm sói rừng lên số lượng bạch cầu 86 Bảng 3.17 Ảnh hưởng cốm sói rừng lên số lượng loại bạch cầu 87 Bảng 3.18 Ảnh hưởng cốm sói rừng lên tỷ lệ lympho bào TCD3 88 Bảng 3.19 Ảnh hưởng cốm sói rừng lên tỷ lệ lympho bào TCD4 88 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 3.20 Ảnh hưởng cốm sói rừng lên tỷ lệ lympho bào TCD8 89 Bảng 3.21 Ảnh hưởng cốm sói rừng lên nồng độ IL-2 90 Bảng 3.22 Ảnh hưởng cốm sói rừng lên nồng độ TNF-α 91 Bảng 4.1 Tỷ lệ thời gian sống kéo dài thêm chuột mang u sarcoma 180 so với số kết nghiên cứu khác 109 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Trọng lượng thể thỏ qua thời điểm nghiên cứu 54 Biểu đồ 3.2 Sự thay đổi trọng lượng thể chuột qua ngày cân 64 Biểu đồ 3.3 Sự thay đổi thể tích trung bình khối u qua ngày đo 65 Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ sống sót chuột lơ thí nghiệm 160 ngày theo dõi 76 Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng cốm sói rừng lên trọng lượng lách tương đối 81 Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng cốm sói rừng lên trọng lượng tim tương đối 84 Biểu đồ 3.7 Sự khác biệt tỉ lệ tế bào TCD3, TCD4, TCD8 lô chuột 90 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ vị trí hạch bạch huyết thể chuột 45 Hình 2.2 Cấu trúc hệ thống flow cytometry 47 Hình 2.3 Dải nồng độ sử dụng để xây dựng đường chuẩn 48 Hình 2.4 Dải nồng độ sử dụng để xây dựng đường chuẩn IL-2 49 Hình 4.1 Mơ hình cấu trúc phân tử interleukin-2 120 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC ẢNH Ảnh 1.1 Cây Sói rừng 31 Ảnh 2.1 Cốm sói rừng 38 Ảnh 2.2 Tế bào ung thư mô liên kết Sarcoma-180 40 Ảnh 2.3 Thước kẹp caliper 44 Ảnh 3.1 Hình ảnh vi thể gan thỏ lô chứng 60 Ảnh 3.2 Hình ảnh vi thể gan thỏ lơ sói rừng 0,6g/kg 61 Ảnh 3.3 Hình ảnh vi thể gan thỏ lơ sói rừng 3g/kg 61 Ảnh 3.4 Hình ảnh vi thể thận thỏ lô chứng 62 Ảnh 3.5 Hình ảnh vi thể thận thỏ lơ sói rừng 0,6g/kg 63 Ảnh 3.6 Hình ảnh vi thể thận thỏ lơ sói rừng 3g/kg 63 Ảnh 3.7 Khối u chuột lô UT vào ngày thứ 23 sau cấy truyền tế bào sarcoma 180 68 Ảnh 3.8 Khối u chuột lô uống cốm sói rừng 5g/kg thể trọng vào ngày thứ 23 sau cấy truyền tế bào sarcoma 180 68 Ảnh 3.9 Khối u chuột lô uống 6-MP vào ngày thứ 23 sau cấy truyền tế bào sarcoma 180 69 Ảnh 3.10 Hình ảnh vi thể khối u chuột lô UT 70 Ảnh 3.11 Hình ảnh vi thể khối u chuột lơ 6-MP 70 Ảnh 3.12 Hình ảnh vi thể khối u chuột lơ SR1 71 Ảnh 3.13 Hình ảnh vi thể khối u chuột lô SR2 71 Ảnh 3.14 Hình ảnh vi thể khối u chuột lô SR3 72 Ảnh 3.15 Hình ảnh vi thể gan chuột lô sinh học 73 Ảnh 3.16 Hình ảnh vi thể gan chuột lơ 6-MP 73 Ảnh 3.17 Hình ảnh vi thể gan chuột lô SR1 74 Ảnh 3.18 Hình ảnh vi thể gan chuột lô SR2 74 Ảnh 3.19 Hình ảnh vi thể gan chuột lô SR3 75 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Ảnh 3.20 Hình ảnh vi thể tuyến ức lơ chuột sinh học 79 Ảnh 3.21 Hình ảnh vi thể tuyến ức lô chuột ung thư 80 Ảnh 3.22 Hình ảnh vi thể tuyến ức lô chuột uống 6-MP 80 Ảnh 3.23 Hình ảnh vi thể tuyến ức lơ chuột uống sói rừng 81 Ảnh 3.24 Hình ảnh vi thể lách chuột lơ sinh học 82 Ảnh 3.25 Hình ảnh vi thể lách chuột lô ung thư 83 Ảnh 3.26 Hình ảnh vi thể lách chuột lô 6-MP 83 Ảnh 3.27 Hình ảnh vi thể lách chuột lô SR1 84 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình chiết xuất cốm sói rừng 37 Sơ đồ 2.2 Cách phân chia nhóm chuột theo dõi tác dụng kháng u 51 Sơ đồ 2.3 Quy trình nghiên cứu 52 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... nghiên c? ?u tiền lâm sàng lâm sàng tiếp theo, tiến hành nghiên c? ?u đề tài ? ?Nghiên c? ?u tính an toàn tác dụng kháng u sarcoma 180 cốm sói rừng Sarcandra glabra (Thunb. ) Nakai thực nghiệm? ?? với mục ti? ?u. .. gây u (n=1 0) Nhóm đối chứng gây u (n=9 5) Khơng đi? ?u trị (n=1 5) Không đi? ?u trị (n=1 0) U? ??ng 6-MP (n=1 5) U? ??ng 6-MP (n=1 0) U? ??ng cốm sói rừng li? ?u 5g/kg thể trọng (n=1 5) U? ??ng cốm sói rừng li? ?u 5g/kg... LI? ?U, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C? ?U 2.1 CHẤT LI? ?U NGHIÊN C? ?U 2.1.1 Thuốc nghiên c? ?u - Thuốc dùng nghiên c? ?u dạng cốm tan sản xuất Khoa Dược, Bệnh viện Y học cổ truyền Cao Bằng theo quy