1 TRƯỜNG THPT LÊ HỒNG PHONG HỌC CHỦ ĐỀ Môn Công Nghệ CHỦ ĐỀ Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống Cây trồng nông , lâm nghiệp Tổ 3 Lớp 10 A1 NĂM HỌC 2016 – 2017 A Đặt vấn đề B Nội dun[.]
TRƯỜNG THPT LÊ HỒNG PHONG …… …… HỌC CHỦ ĐỀ: Môn Công Nghệ CHỦ ĐỀ Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào nhân giống Cây trồng nông , lâm nghiệp Tổ : Lớp : 10 A1 NĂM HỌC 2016 – 2017 A Đặt vấn đề B Nội dung Lịch sử hình thành phát triển công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật +) Thế Giới : Chia làm giai đoạn - Khởi đầu 1902 -1933: Haberlandt , Đức (1902) : “ Tính tồn tế bào thực vật ” Tuy nhiên ông không thành công với tế bào mơ mềm , biểu bì dom chúng khơng thể phân chia - Giai đoạn 1934-1965: + Phát hooc môn sinh trưởng + Xây dựng môi trường - Giai đoạn 1965 – Nay: Phát kĩ thuật ni cấy mơ có ý nghĩa : Tạo đơn bội, nuôi tế bào trần +) Việt Nam : -Du nhập vào nước ta từ năm 1960 miền Nam đầu năm 1970 miền Bắc, thực phát triển từ năm 1980 Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen trồng. Nhiều phòng tỉnh thành nước xây dựng nhiều phịng nghiên cứu cơng nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi cấy mô - Ở nước ta trồng chuyển gen nghiên cứu viện, phịng thí nghiệm, mà chưa sản xuất quy mô lớn, đại trà viện Di truyền Nông nghiệp, viện Công nghệ sinh học, viên Lúa đơng sơng Cửu Long…và số chương trình từ dự án quốc gia quốc tế thành công việc chuyển số gene diệt sâu, bệnh, kháng thuốc vào số lúa, ngô, cải bắp… - Nhìn sang nước khác thấy cơng nghệ sinh học Việt Nam khoảng cách xa: Trung Quốc, Đài Loan, Mỹ… Khái niệm -Nuôi cấy mô tế bào phương pháp tách rời tế bào, mô đem nuôi cấy môi trường thích hợp để chúng tiếp tục phân bào biệt hóa thành mơ, quan phát triển thành Cơ sở khoa học a) Tính tồn tế bào Tế bào chứa hệ gen quy định kiểu gen lồi đó, mang tồn lượng thơng tin lồi Có thể sinh sản vơ tính ni cấy mơi trường thích hợp b) Khả phân hoá phản phân hoá TB - Phân hố TB : Là q trình tế bào phơi sinh biến đổi thành tế bào chuyên hoá đặc hiệu cho mô quan khác nhau, để đảm nhận chức khác - Phản phân hoá TB : Là q trình chuyển tế bào chun hố chức trạng thái phơi sinh ban đầu phân chia mạnh mẽ c) Môi trường dinh dưỡng : Là nhân tố quan trọng định thành cơng q trình ni cấy Hầu hết môi trường dinh dưỡng nhân tạo sử dụng để nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm thành phần sau: Các nguyên tố muối khoáng +Nguyên tố đa lượng +Nguyên tố vi lượng Nguồn cac bon Vitamin Q trình cơng nghệ ni cấy mơ tế bào Bước 1: Chọn vật liệu nuôi cấy Bước : Khử trùng Buồng khử trùng - Mẫu dụng cụ tẩy rửa khử trùng - Cắt đỉnh sinh trưởng thành phần tử nhỏ, tẩy rửa, khử trùng buồng vô trùng VD: - Vật liệu nuôi cấy tiến khử trùng với HgCl 0,1% nước cất - Que cấy, ống nghiệm giá thể.được khử trùng nồi hấp Bước : Tạo chồi Khối callus chuẩn bị tạo Cây hình thành - Để phát triển thân cành - Cắm vật liệu nuôi cấy môi trường dinh dưỡng có bổ sung thêm xytokinin hoạt hố tạo chồi Bước : Tạo rễ - Khi đạt tiêu chuẩn chiều cao, số chuyển sang MT tạo rễ Đó MT dinh dưỡng thích hợp bổ sung chất KT auxin, IBA Bước :Cấy vào mơi trường thích ứng - Chuyển sang MT thích ứng gần giống với mặt trời tự nhiên về: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng - Không thể bỏ qua bước tạo yếu Nếu trồng trực tiếp vào MT tự nhiên dễ nhiễm bệnh chết Bước 6: Trồng vườn ươm - Cho thích ứng với MTSX - Khi đủ chiều cao, thân chuyển vườn ươm nhân nhanh sản xuất Áp dụng nuôi cấy mô tế bào Hoa phong lan: Vật liệu nuôi cấy: mô phân sinh ngọn, mô phân sinh bên, cuống hoa, đỉnh lá, hạt lan… Thông thường người ta nuôi cấy hạt lan tạo chồi nuôi cấy trực tiếp quan Chọn mẫu khử trùng mẫu cấy 1.1 Khử trùng trái lan Rửa trái lan xà phòng, rửa lại nước Cho trái lan vào bình hấp khử trùng cho vào tủ cấy vô trùng Dùng cồn 70° lắc qua 30s, rửa lại nước cất vô trùng Khử trùng trái lan lại cồn 96º Dùng dao xẻ dọc trái lan để lấy hạt, cho hạt vào môi trường nuôi cấy, quấn xung quanh miệng hộp nuôi cấy parafin Để hộp vào chỗ tối tuần, sau đem để ngồi sáng 1.2 Khử trùng mẫu cấy quan Tách vảy hành từ cây, bóc già xuất màm chồi bên mang đỉnh sinh trưởng Khử trùng cồn 70° 30s, rửa lại nước cất vô trùng Ngâm mẫu dung dịch Ca(0cl)2 2% phút Rửa lại nước cất 4-5 lần Mỗi mầm đặt đĩa peptri vô trùng, cẩn thận tách non, sau lần tách phải nhúng mầm vào cồn 70º 1s rửa với nước cất vô trùng, chuyển sang đĩa peptri vô trùng khác. Tách mầm dao nhọn vô trùng , dùng kim nhọn tách lớp lá, cắt đỉnh sinhtrưởng khỏi mô cấy vào môi trường nhân giống Cắt khử trùng mẫu cấy MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 2.1 Môi trường nuôi cấy hạt Mỗi loại môi trường thích hợp cho nhóm lan khác nhau: Knudson’s lan Dendrobium, Cattleya; MS1/2 Hyponex(20-20-20) lan đơn thân Vanda, Phalaenopsis Đường bổ sung vào moi trường nuôi cấy 30g/l môi trường làm đặc agar Trước cấy môi trường hấp khử trùng ướt 121ºC, 1atm thời gian 15 phút(tuỳ vào thể tích mơi trường ni cấy) 2.2 Môi trường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Một số môi trường thường dùng là:Knudson’s, Heller, Knop, MS… Được sử dụng phổ biến mơi trường MS có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng: NAA với nồng độ phần triệu(ppm),hoặc 2,4D với nồng độ 1-2 ppm nồng độ chất nên giảm dần lần cấy chuyển sau Một số dich chiết trái bổ sungvào môi trường nuôi cấy Saccarose gây kích thích mơ số lồi lan ngược lạ gây ức chế với số lồi lan khác, cytokynin có hiệu gây mọc chồi với đa số loài với nhiều phận lan, loài phận khơng chịu ảnh hưởng cytokynin thay axit tranh-cinamic Nhiệt độ lý tưởng cho nuôi cấy mô phong lan 22ºC±1 đa số loài lan đa thân 26ºC±3 loài lan đơn thân.Ánh sáng nhân tạo cungcấp loại đèn huỳnh quang đèn nóng sáng, ánh sáng phải sử dụng liên tục với quang kỳ 16 giờ,18 24 giờ, cường độ ánh sáng thay đổi từ 1000 lux- 2000 lux tuỳ loài tuỳ thuộc vào thời kỳ sinh trưởng, đèn phải đặt cách môi trường 0,4-0,5m Trước nuôi cấy,môi trường cấy nước cất phải tiệt trùng nồi áp suất 1kg/cm² 10-30 phút Cấy chuyển sang môi trường 3.1 Đối với hạt nảy mầm - Đối với hạt nảy mầm, sau thời gian nuôi cấy thấy điểm xanh xuất bề mặt mơi trường, cấy thưa vãn để phát triển môi trường cũ, cấy mau phải cấy chuyển sang mơi trường mới,mơi trường mơi trường gieo hạt có bổ sung thêm 10% nước dừa Khi chồi lớn lên tiến hành nhân chồi chuyển sang môi trường có bổ sung thêm 50g dịch chiết khoai tây 50g chuối nghiền Hạt lan Mini Dendrobium nảy mầm sau 30 ngày phương pháp nuôi cấy mô Cây phát triển mạnh điều kiện in-vitro 3.2 Đối với đỉnh sinh trưởng -Sau 4-8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục tạo khối tròn gọi thể chồi, thể chồi lấy khỏi môi trường cấy ban đầu, dùng dao nhọn cắt 4-6 miếng tuỳ theo kích thước thể chồi, lát cắt chuyển vào môi trường phát triển chồi, đỉnh sinh trưởng tạo chồi nới sau khoảng tuần, cắt tiếp chuyển sang môi trường mới, tất việc cấy chuyển phải thực điều kiện vơ trùng Thể chơì lan Hồ điệp phát triển sau tuần nuôi cấy mô Thể chồi lan Hồ Điệp phát triển sau tuần Tái sinh hoàn chỉnh Khi đạt đén số giống cân thiết, ta chuyển thể chồi sang môi trường tạo rễ(môi trường có nồng độ auxin tăng lên để kích thích rễ) Sau 4-5 tháng, thể chồi phát triển thành Tạo rễ chuẩn bị đưa trồng tự nhiên Chuyển vườn ươm Khi cao 5-7cm, có từ 3-4 lá, chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vơ trùng có bổ sung chất dinh dưỡng. Khi đem khỏi chai, dùng vịi rửa hết mơi trường ni cấy cịn bám con, ngâm vào nước có pha thuốc trừ nắm khoảng phút xả nới nước Giá thể thường sử dụng để ươm sau nuôi cấy vỏ dừa C Ý nghĩa – Thành Tựu Ý nghĩa Có thể sản xuất giống trồng theo quy mô công nghiệp có hệ số nhân giống cao - Sản phẩm tạo đồng mặt di truyền - Sản phẩm hồn tồn bệnh ngun liệu ni cấy bệnh Thành tựu Bắt đầu với cơng trình White(1934) nuôi cấy thành công rễ cà chua mơi trường lỏng chứa muối khống, glucose, dịch chiết nấm men (1935 )Thimann phát auxin(IAA) mô thực vật Nhiều nhà nghiên cứu sử dụng IAA vitamin bổ sung vào môi trương nuôi cấy thu kết tốt Những năm 1940 nhiều chất điều hồ sinh trưởng thuộc nhóm IAA tổng hợp thành công sử dụng nhiều ni cấy kết cho thấy chất có tác dụng kích thích tạo mơ sẹo, phân chia tế bào 1954-1955 Skoog phát kinentin có tác dụng kích thích phân chia tế bào. 1956 Skoog Miller tìm hiểu ảnh hưởng tỉ lệ Auxin/Cytokinin môi trường ni cấy đến hình thành quan tạo chồi từ thuốc 1960 Bergman tái sinh tế bào đơn thuốc môi trường lỏng Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô tế bào vào công nghệ sinh học thực vật(1960 đến nay) 1960 Cooking dùng enzym cellulase phân huỷ vỏ cellulose tế bào thực vật thu tế bào không vỏ gọi tế bào trần 1968 Nakata Tanaka tạo thuốc đơn bội cách nuôi cấy bao phấn Từ 1977 Melchers dung hợp tế bào trần khoai tây cà chua thành công tạo lai khoai tây-cà chua Từ năm 1980 hàng loạt nghiên cứu lĩnh vực công nghệ sinh học công bố ... cơng nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi cấy mô - Ở nước ta trồng chuyển gen nghiên cứu viện, phịng thí nghiệm, mà chưa sản xuất quy mô lớn, đại trà viện Di truyền Nông nghiệp, viện Công nghệ. .. thành công việc chuyển số gene diệt sâu, bệnh, kháng thuốc vào số lúa, ngơ, cải bắp… - Nhìn sang nước khác thấy công nghệ sinh học Việt Nam khoảng cách xa: Trung Quốc, Đài Loan, Mỹ… Khái niệm -Nuôi... đổi từ 100 0 lux- 2000 lux tuỳ loài tuỳ thuộc vào thời kỳ sinh trưởng, đèn phải đặt cách môi trường 0, 4-0 ,5m Trước nuôi cấy,môi trường cấy nước cất phải tiệt trùng nồi áp suất 1kg/cm² 1 0-3 0 phút