Tiểu luận học phần Thiết bị và linh kiện quang học, quang phổ và laser TIỂU LUẬN Anh (Chị) hãy trình bày những hiểu biết của anh (chị) về kính hiển vi quang học 1 Sự ra đời của kính hiển vi Kể từ khi. Kể từ khi kính hiển vi xuất hiện vào khoảng thập niên 1590, chúng ta bắt đầu nhìn thấy thế giới của những sinh vật cực kỳ nhỏ bé sống trong nước, thức ăn và thậm chí ngay trong cơ thể chúng ta. Kính hiển vi (microscope) là thiết bị để quan sát các vật thể có kích thước rất nhỏ mà mắt thường không nhìn thấy được. Khoa học nhằm khám phá và kiểm tra những vật thể nhỏ nhờ một thiết bị nhờ vậy được gọi là khoa học hiển vi. Hình ảnh hiển vi của vật thể được phóng đại thông qua một hoặc nhiều thấu kính, hình ảnh này nằm trong mặt phẳng vuông góc với trục của thấu kính (hoặc các thấu kính). Khả năng quan sát của kính hiển vi được quyết định bởi độ phân giải. Năm 1590, hai cha con thợ làm kính mắt người Hà Lan: Hans Janssen và Zaccharias Janssen đã phát minh ra kính hiển vi đầu tiên. Sau đó, Anton van Leeuwenhoek (1623 1732), Hà Lan, là người đầu tiên chế tạo ra kính hiển vi để quan sát tế bào hồng cầu, nấm, vi khuẩn, tinh trùng và các vi sinh vật trong nước... Từ đó, rất nhiều khám phá và công trình nghiên cứu được công bố, Anton van Leeuwenhoek được coi là “Cha đẻ của khoa học
Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser TIỂU LUẬN Anh (Chị) trình bày hiểu biết anh (chị) kính hiển vi quang học Sự đời kính hiển vi Kể từ kính hiển vi xuất vào khoảng thập niên 1590, bắt đầu nhìn thấy giới sinh vật nhỏ bé sống nước, thức ăn chí thể Kính hiển vi (microscope) thiết bị để quan sát vật thể có kích thước nhỏ mà mắt thường khơng nhìn thấy Khoa học nhằm khám phá kiểm tra vật thể nhỏ nhờ thiết bị nhờ gọi khoa học hiển vi Hình ảnh hiển vi vật thể phóng đại thơng qua nhiều thấu kính, hình ảnh nằm mặt phẳng vng góc với trục thấu kính (hoặc thấu kính) Khả quan sát kính hiển vi định độ phân giải Năm 1590, hai cha thợ làm kính mắt người Hà Lan: Hans Janssen Zaccharias Janssen phát minh kính hiển vi Sau đó, Anton van Leeuwenhoek (1623 - 1732), Hà Lan, người chế tạo kính hiển vi để quan sát tế bào hồng cầu, nấm, vi khuẩn, tinh trùng vi sinh vật nước Từ đó, nhiều khám phá cơng trình nghiên cứu công bố, Anton van Leeuwenhoek coi “Cha đẻ khoa học hiển vi – Father of Microscopy) cho dù ông chưa học qua trường lớp Robert Hook (1635 – 1703) sử dụng nguồn sáng để quan sát giới vi sinh vật kính hiển vi, ơng người quan sát cấu trúc tế bào Cuốn sách “Hình ảnh hiển vi” xuất năm 1665 mô tả nhiều đối tượng mà mắt thường khơng nhìn thấy Ơng tơn vinh l cha đẻ khoa học hiển vi người Anh” Trong thập kỷ gần đây, nhờ phát triển nhanh chóng khoa học cơng nghệ, hệ kính hiển vi đại liên tục giới thiệu tung thị trường với nhiều tính ưu việt Do vậy, khó để phân xác thành loại kính hiển vi Tuy nhiên, số nhóm kính hiển vi tóm lươc sau: kính hiển vi quang học (kính hiển vi ánh sáng truyền qua, kính hiển vi soi nổi, kính hiển vi phản pha, kính hiển vi soi ngươc, kính hiển vi phân cực, kính hiển vi Lớp Quang Học K14 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser huỳnh quang, kính hiển vi đồng tụ,…), kính hiển vi điện tử (kính hiển vi điện tử truyền qua - TEM, kính hiển vi điện tử quét - SEM,…), kính hiển vi quét đầu dị (kính hiển vi lực ngun tử - AFM, kính hiển vi quét chui hầm - STM, kính hiển vi quang học quét trương gần – SNOM,…), kính hiển vi huỳnh quang đồng tiêu laser quét (Laser Scanning Confocal Microscope- LSCM) … Lớp Quang Học K14 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser Một số loại kính hiển vi quang học sử dụng phổ biến phòng xét nghiệm vi sinh Việt Nam gồm - Kính hiển vi ánh sáng truyền qua (transmitted light microscope) loại kính hiển quang học sử dụng phổ biến nay, thường sử dụng nguồn ánh sáng trắng rọi qua mẫu đặt lam kính để quan sát hình dạng vi cấu trúc mẫu Ảnh mẫu hình ảnh hai chiều - Kính hiển vi soi (stereoscopic microscope) loại kính hiển vi quang học thiết kế để quan sát hình ảnh bề mặt mẫu vật thể độ phóng đại thấp Loại kính thường sử dụng chùm ánh sáng trắng chiếu tới bề mặt vật thể, hình ảnh tạo ánh sáng phản xạ thông qua hai trục quang học riêng biệt với hai vật kính (hoặc vật kính phẳng), hệ thống kính phóng đến thị kính Ảnh mẫu vật thường hình ảnh chiều - Kính hiển vi phân cực (polarizing microscope) loại kính hiển vi sử dụng ánh sáng phân cực để quan sát, nghiên cứu định tính định lương mẫu có đặc tính lưỡng chiết (có hai số khúc xạ) Kính hiển vi phân cực có khả cung cấp thơng tin màu hấp thụ đương biên quang học chất liệu khác (có só khúc xạ khác nhau) mẫu Hình ảnh hiển vi phân cực có độ tương phản cao - Kính hiển vi quang học có hai nicon phân cực ánh sáng, đặt thẳng góc nhau: nicon phân cực đặt mâm kính, nicon phân tích đặt vật kính thị kính Mẫu đá khoáng vật mài mỏng tới bề dày 0,03 mm, gắn nhựa Canađa vào thuỷ tinh đặt mâm kính KHVPC cho phép xác định số quang học khoáng vật (chiết suất, lưỡng chiết suất, góc quang học, màu tự nhiên, màu đa sắc khống vật kim loại) nhờ xác định xác tên khống vật - Kính hiển vi huỳnh quang (flourescence microscope) loại kính hiển vi quang học sử dụng nguồn ánh sáng kích thích để nghiên cứu, quan sát thuộc tính mẫu sinh học sau mẫu nhuộm với chất phát huỳnh quang (hoặc mẫu tự phát huỳnh quang) Kỹ thuật Lớp Quang Học K14 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser hiển vi huỳnh quang cho phép quan sát thuộc tính sinh hóa sinh lý học tế bào sống Phụ thuộc vào mục đích đối tương cần quan sát mà mẫu nhuộm với chất phát huỳnh quang khác sử dụng ánh sáng có bước sóng kích thích khác Thế mạnh kính hiển vi quang học y-sinh cho phép quan sát vật thể, tế bào sống (living cells) Cho tới nay, độ phân giải kính hiển vi quang học trương rộng (wild field) thông thường bị hạn chế khoảng ~ 150 – 200 nm ƣu điểm vươt trội nên loại kính cơng cụ đầu tay nghiên cứu, thực hành y – sinh Để khắc phục hạn chế độ phân giải, người ta ln tìm cách cải tiến loại kính để nhằm quan sát ảnh vật thể, tế bào sinh học rõ Ngồi loại kính hiển vi truyền qua thông thường, người ta chế loại kính hiển vi huỳnh quang cho phép quan sát ảnh phóng đại vật thể nhờ ánh sáng tự phát quang chúng nhờ xạ huỳnh quang thứ cấp gắn vật thể quan sát với chất đánh dấu phát quang Loại kính hiển vi huỳnh quang sử dụng rộng rãi thực hành nghiên cứu y-sinh đa dạng chất đánh dấu phát quang đa dạng tính chúng Hình ảnh thu ánh sáng huỳnh quang toàn bề mặt mẫu nằm thị trương vật kính Do đó, độ phân giải ảnh mép ảnh, chí trung tâm ảnh khơng cao, độ tương phản chồng chập điểm huỳnh quang khác mẫu Cần loại bỏ ánh sáng nhiễu (gồm ánh sáng huỳnh quang tự phát mẫu vật ánh sáng kích thích) xung quanh điểm hội tụ ánh sáng kích thích (Hình 1) Hình 1: So sánh khác thể tích chiếu sáng khảo sát hai loại kính hiển vi huỳnh quang trường rộng confocal Cấu tạo nguyên lý hoạt động Lớp Quang Học K14 Tiểu luận học phần 4.1 Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser Kính hiển vi ánh sáng truyền qua a Cấu tạo Gồm phận chủ yếu sau: - Nguồn sáng truyền qua (bóng đèn sợi đốt halogen) - Màn chắn sáng, độ chắn sáng (nếu có) - Giá đỡ mẫu (có phận giữ mẫu) - Bộ phận điều khiển giá đỡ mẫu (lên, xuống, sang phải, sang trái) - Mâm vật kính có khả xoay vịng để lựa chọn vật kính có độ phóng đại thích hợp quan sát - Vật kính: ống hình trụ có hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng xun qua mẫu Vật kính có độ phóng đại điển 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x 100x lắp đặt mâm vật kính - Thị kính: ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh mẫu vật lên võng mạc mắt Độ phóng đại điển hình thị kính 2x, 5x, 10x - Núm chỉnh độ hội tụ (chỉnh thô chỉnh tinh) - Ống nối với camera (nếu có) Hình Kính hiển vi ánh sáng truyền qua (Leica DM3000 LED) Lớp Quang Học K14 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser b Nguyên lý hoạt động Hình Sơ dồ nguyên lý hoạt động kính hiển vi ánh sáng truyền qua Lớp Quang Học K14 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser Ánh sáng khả kiến từ nguồn tập trung lại qua tụ quang để truyền qua mẫu đặt lam kính Sau đó, ảnh mẫu tạo thành phóng đại lần thứ nhờ thấu kính có tiêu cự ngắn (vài mm) gọi vật kính Hình ảnh tiếp tục phóng đại lên nhiều lần nhờ thấu kính phóng Hình ảnh phóng đại cuối mẫu ảnh thật, quan sát nhờ thị kính (có tiêu cực dài nhiều so với tiêu cự vật kính) ghi lại nhờ CCD camera Độ phân giải ảnh hiển vi quang học bị hạn chế nhiễu xạ Theo công thức Abbe – Rayleigh, khoảng cách nhỏ dmin hai điểm có khả phân biệt tính theo cơng thức: dmin = 1,22 /2NA /2NA /2NA bước sóng ánh sáng, NA = n sinα gọi độ số vật kính, n chiết suất môi trương mẫu quan sát, α bán góc mở cực đại vật kính quan sát mẫu 4.2 Kính hiển vi soi a Cấu tạo Lớp Quang Học K14 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser Hình Cấu tạo kính hiển vi soi (Leica EZ4) Lớp Quang Học K14 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser Gồm phận chủ yếu sau : - - Nguồn sáng phản xạ (và truyền qua) - Bệ kính giữ thăng có giá đặt mẫu - Lăng kính - Ống quan sát Vật kính : thường bao gồm hai vật kính vật kính phẳng cố định, cho phép quan sát mẫu vật góc độ khác Độ phóng đại điển hình vật kính: 1x ; 1,5x ; 2x - - Núm chỉnh độ phóng đại - Núm chỉnh độ hội tụ Thị kính: ống hình trụ mang thấu kính Độ phóng đại điển hình thị kính : 10x, 15x, 20x 30x - Ống nối camera (nếu có) b Ngun lý hoạt động Hình Sơ đồ nguyên lý hoạt động kính hiển vi soi Lớp Quang Học K14 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser Kính hiển vi soi thiết kế để quan sát mẫu vật thể độ phóng đại thấp Ảnh hiển vi soi thường tạo thành nhờ ánh sáng phản xạ bề mặt mẫu sau chiếu sáng ánh sáng truyền qua Ánh sáng phản xạ qua hai vật kính vật kính phẳng theo hai trục quang học song song tạo nên hình ảnh ba chiều nhờ khả quan sát mẫu từ góc độ khác (γ) Nhờ sử dụng) Nhờ sử dụng kính viễn vọng kiểu Galilê đặt trống xoay (hoặc hệ thống thấu kính có khả phóng to thu nhỏ) nên có khả thay đổi độ phóng đại ảnh theo ý muốn 4.3 Kính hiển vi phân cực a Cấu tạo a) Lớp Quang Học K14 10 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser b) Hình Kính hiển vi phân cực (a) Leica DM4 M & DM6 M; (b) Nikon Gồm phận chủ yếu sau : - Nguồn sáng (sợi đốt, halogen…) - Tụ quang - Bộ phân cực ánh sáng (thường lắp cố định phía tụ quang) - Giá đỡ mẫu có khả xoay vịng - Mâm vật kính - Bộ phân tích (có khả xoay vịng với góc đọc nhỏ) Vật kính: ống hình trụ có hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng xuyên qua mẫu Vật kính có độ phóng đại điển hình khác 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x 100x lắp đặt mâm vật kính Thị kính: ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh mẫu vật lên võng mạc mắt Độ phóng đại điển hình thị kính 2x, 5x, 10x - Núm chỉnh độ hội tụ (chỉnh thô, chỉnh tinh) - Bệ đỡ kính - Ống nối với camera (nếu có) b Nguyên lý hoạt động Lớp Quang Học K14 11 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser Hình Sơ dồ nguyên lý hoạt động kính hiển vi phân cực Khơng giống loại kính hiển vi quang học khác, kính hiển vi phân cực thiết kế để quan sát mẫu sử dụng ánh sáng phân cực đặc tính quang học khơng đẳng hướng mẫu Loại mẫu có liên kết nội phân tử phân cực Lớp Quang Học K14 12 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser tương tác với ánh sáng phân cực theo hướng định dẫn đến trễ pha Q trình kiểm sốt nhờ biến đổi biên độ giao thoa mặt phẳng tạo ảnh ban đầu Để quan sát mẫu lưỡng chiết (có hai số khúc xạ khác nhau), kính hiển vi phải trang bị hai phân cực, đặt đương chùm ánh sáng tới trước mẫu, phân tích (bộ phân cực thứ hai) đặt trục quang học vật kính, sau độ ống quan sát camera Độ tương phản ảnh tạo nhờ tương tác ánh sáng phân cực phẳng với mẫu lưỡng chiết để tạo hai thành phần sóng riêng biệt (tia bình thường bất bình thường) phân cực mặt phẳng vng góc thay đổi lẫn Tốc độ thành phần khác thay đổi hướng truyền qua mẫu Sau qua mẫu, thành phần ánh sáng truyền lệch pha tái kết hợp lại sau trình giao thoa qua phân tích 4.4 Kính hiển vi huỳnh quang a Cấu tạo Gồm phận chủ yếu sau : - Nguồn sáng truyền qua (bóng đèn sợi đốt halogen) Nguồn sáng kích thích huỳnh quang (đèn thủy ngân, đèn hồ quang xenon…) - Tụ quang để hội tụ chùm sáng - Màn chắn sáng, độ chắn sáng - Gương lưỡng hướng sắc (hoặc phân chia chùm tia lưỡng sắc) - Giá đỡ mẫu (có phận giữ mẫu) - Bộ phận điều khiển giá đỡ mẫu (lên, xuống, sang phải, sang trái) - Mâm vật kính có khả xoay vịng để lựa chọn vật kính có độ phóng đại thích hợp quan sát - Vật kính: ống hình trụ có hay nhiều thấu kính, để thu ánh sáng xun qua mẫu Vật kính có độ phóng đại điển 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 60x 100x lắp đặt Lớp Quang Học K14 13 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser mâm vật kính - Thị kính : ống hình trụ có hai hay nhiều thấu kính, giúp hội tụ hình ảnh mẫu vật lên võng mạc mắt Độ phóng đại điển hình thị kính 2x, 5x, 10x - Núm chỉnh độ hội tụ (chỉnh thô chỉnh tinh) - Ống nối với camera Lớp Quang Học K14 14 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser a) b) Lớp Quang Học K14 15 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser Hình Kính hiển vi huỳnh quang a) Leica DM6 FS; b) Nikon Lớp Quang Học K14 16 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser b Nguyên lý hoạt động Kính hiển vi huỳnh quang hoạt động dựa nguyên lý sử dụng ánh sáng có bước sóng ngắn, lương cao để kích thích điện tử nội phân tử mẫu nhảy lên quỹ đạo cao (có mức lương cao hơn) Khi điện tử quay trở lại quỹ đạo cũ (có mức lương ban đầu chƣa bị kích thích) chúng phát ánh sáng có bước sóng dài hơn, lương thấp (thường nằm phổ ánh ánh sáng nhìn thấy) để tạo hình ảnh huỳnh quang Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng đèn xenon thủy ngân để tạo ánh sáng tia cực tím, qua lọc để dẫn vào kính đến Gương lưỡng hướng sắc - loại Gương có khả phản xạ dải bước bước sóng định cho phép dải bước sóng khác qua Gương phản xạ ánh sáng tia cực tím lên mẫu để kích thích huỳnh quang nội phân tử mẫu Vật kính thu lại ánh sáng có bước sóng huỳnh quang tạo đến Gương lưỡng hướng sắc thông qua lọc (để loại bỏ ánh sáng khơng có bước sóng huỳnh quang) dẫn đến thị kính để tạo ảnh huỳnh quang Hình Sơ đồ ngun lý hoạt động kính hiển vi huỳnh quang 4.5 Kính hiển vi laser quét đồng tiêu Lớp Quang Học K14 17 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser Cấu hình quang học có tính chất định kính hiển vi huỳnh quang đồng tiêu laser quét (Laser Scanning Confocal Microscope - LSCM) so với kính hiển vi huỳnh quang thơng thường khe tiêu (confocal aperture – pinhole) đặt trước đầu thu (detector) vị trí mặt phẳng tiêu trung gian liên hợp (conjugate) với mặt phẳng tiêu kính vật Kết đầu thu thu ánh sáng qua Lớp Quang Học K14 18 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser khe tiêu Khe tiêu nguyên tắc nhỏ (cực nhỏ) đầu thu thu điểm phát sáng Về phía nguồn sáng kích thích laser: laser hội tụ vị trí trùng với mặt phẳng tiêu trung gian liên hợp (conjugate) với mặt phẳng tiêu kính vật cho tia kích thích hội tụ vào mẫu vật điểm với kích thước giới hạn vết nhiễu xạ Có nghĩa sử dụng thấu kính để kích thích thu tín hiệu huỳnh quang mặt phẳng đồng tiêu Như vậy, thời điểm, điểm chiếu sáng điểm quan sát nằm mặt phẳng tiêu liên hợp, có nghĩa chúng hội tụ lên Vì vậy, cấu hình quang học gọi đồng tiêu Bằng cách này, ánh sáng nhiễu nằm xung quanh điểm chiếu sáng mặt phẳng tiêu loại bỏ (Hình 7.10) Chỉ có ánh sáng huỳnh quang từ điểm quan sát mẫu mặt phẳng tiêu cự hội tụ vào khe tiêu Một lương đáng kế ánh sáng huỳnh quang phát từ lớp bên bên mặt phẳng tiêu cự vật kính xung quanh điểm chiếu sáng không hội tụ vào khe tiêu tất nhiên khơng đóng góp vào tín hiệu đo Như vậy, khe tiêu đóng vai trị lọc khơng gian LSCM Muốn quan sát toàn mặt mẫu phải tia kích thích qt tồn mặt mẫu sau dùng phần mềm tin học xử lý tái tạo ảnh mẫu Khác với kính hiển vi huỳnh quang trương rộng, tồn mẫu Lớp Quang Học K14 19 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser chiếu nguồn sáng mạnh, ảnh huỳnh quang thứ cấp mẫu quan sát trực tiếp thị kính ghi nhận đầu đo Hình 10: Sơ đồ nguyên lý hệ kính hiển vi đồng tiêu lưu đồ hoạt động hệ LSCM Lớp Quang Học K14 20 .. .Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser huỳnh quang, kính hiển vi đồng tụ,…), kính hiển vi điện tử (kính hiển vi điện tử truyền qua - TEM, kính hiển vi điện tử... tử qt - SEM,…), kính hiển vi qt đầu dị (kính hiển vi lực nguyên tử - AFM, kính hiển vi quét chui hầm - STM, kính hiển vi quang học quét trương gần – SNOM,…), kính hiển vi huỳnh quang đồng tiêu... … Lớp Quang Học K14 Tiểu luận học phần Thiết bị linh kiện quang học, quang phổ laser Một số loại kính hiển vi quang học sử dụng phổ biến phòng xét nghiệm vi sinh Vi? ??t Nam gồm - Kính hiển vi ánh